Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Este trabajo fue financiado por las subvenciones DE NIH HD043680, MH106392, DA013137 y NS100624.

Todos los protocolos de animales fueron revisados y aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Carolina del Sur (número de garantía federal: D16-00028).
1. Preparación de tubos de cuentas DiI/Tungsteno
<ol><li>Disolver 100 mg de polivinilpirrolidona (PVP) con 10 ml de ddH2O. Vortex la solución de PVP ligeramente.</li>
	<li>Llene el tubo con la solución PVP (ver Tabla de Materiales)y déjelo durante 20 minutos. A continuación, ...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

En este protocolo, describimos una técnica de etiquetado versátil para las neuronas tanto del cerebro de rata como de las cultivadas in vitro. Además, informamos de la metodología para la utilización de software de reconstrucción neuronal y software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. La evaluación de la morfología neuronal y las espinas dendríticas ofrece una oportunidad para determinar alteraciones en la complejidad de las ramif...

En 2000, Gan y otros describieron una técnica de etiquetado rápido para neuronas individuales y glia en el sistema nervioso que combinaba varios colorantes lipofílicos, permitiendo el etiquetado simultáneo de muchas células cerebrales con diferentes colores1,,2. Más recientemente, una técnica de etiquetado balístico fue descrita por Seabold et al.3 que introdujo colorantes fluorescentes (Dil) en las neuronas de las rebanadas cerebrales. Una técnica de tinción versátil, el etiquetado balístico es apreciado por su capacidad para ser utilizado en múltiples especies animales y a través de una amplia gama de edades. Además, se puede combinar con inmunostaining para identificar subpoblaciones de células cerebrales3. En comparación con las técnicas tradicionales (por ejemplo, imperraje de plata Golgi-Cox, microinyección)4, el etiquetado balístico ofrece la oportunidad de distinguir más claramente las características morfológicas, incluidas las espinas dendríticas, una característica que es fundamental para extraer inferencias sobre la complejidad neuronal y la conectividad sináptica5.
Las neuronas piramidales excitatorias se caracterizan por una sola dendrita apical grande, múltiples dendritas basales más cortas y miles de espinas dendríticas6. Las neuronas piramidales se encuentran en múltiples regiones cerebrales relacionadas con el procesamiento cognitivo de orden superior, incluyendo la corteza prefrontal (PFC) y el hipocampo. En el PFC, las neuronas piramidales se observan en las capas II/III y V, con cada una de ellas una morfología única. Específicamente, las neuronas piramidales en la capa II/III de la PFC tienen una dendrita apical más corta y menos ramificación que las neuronas piramidales en la capa V6. Dentro del hipocampo, las neuronas piramidales se encuentran en las regiones CA1 y CA3, con cada una mostrando morfologías distintas. Específicamente, las neuronas piramidales en la región CA1 exhiben una dendrita apical más distintiva, con ramificaciones que ocurren más lejos del soma, en relación con la regiónCA3 6.
Las espinas dendríticas en las neuronas piramidales tanto en el PFC como en el hipocampo son el sitio principal de las sinapsis excitatorias7. Las características morfológicas de las espinas dendríticas, que se caracterizan clásicamente en tres categorías primarias (es decir, delgadas, rechonchas o setas8),se han relacionado con el tamaño de la sinapsis excitatoria9. Las espinas delgadas, caracterizadas por un cuello largo y delgado, una cabeza bulbosa pequeña y densidades postsinápticas más pequeñas, son más inestables y desarrollan conexiones más débiles. Sin embargo, las espinas de setas, que tienen una cabeza de la columna vertebral dendrítica más grande, son reconocidas por formar conexiones sinápticas más fuertes, un efecto resultante de su mayor tamaño. En contraste agudo, las espinas rechonchas están desprovistas de un cuello de columna vertebral, exhibiendo una relación de volumen de cabeza y cuello aproximadamente igual8. Dentro del hipocampo, también se pueden observar espinas ramificadas, por lo que la columna vertebral tiene múltiples cabezas que emergen del mismo cuello dela dorsal dendrítico10. Por lo tanto, los cambios morfológicos de las espinas dendríticas podrían reflejar la funcionalidad y la capacidad estructural. Además, los estudios han demostrado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas se relaciona con su plasticidad estructural, lo que lleva a la idea de que las espinas pequeñas están involucradas en el aprendizaje y la atención, mientras que las espinas más grandes y estables, están involucradas en procesos a largo plazo, incluida la memoria11. Además, la distribución de espinas dendríticas a lo largo de la dendrita puede estar asociada con la conectividad sináptica5,12.
Por lo tanto, el presente documento metodológico tiene tres objetivos: 1) Presentar nuestro protocolo de etiquetado balístico, que ha sido utilizado con una tasa de éxito (es decir, neuronas que cumplen con los criterios de selección y apropiado para el análisis) de 83,3%5,12,13 y en múltiples regiones cerebrales (es decir, PFC, núcleo accumbens, hipocampo); 2) Demostrar la generalización de la técnica y su aplicación a las neuronas cultivadas in vitro; 3) Detallar la metodología utilizada en el software de reconstrucción neuronal y las inferencias que se pueden extraer de dichos datos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Se ha informado que el tamaño y la forma de las espinas dendríticas está relacionada con su plasticidad estructural. Para identificar la estructura morfológica de las neuronas piramidales y las espinas dendríticas, se puede utilizar una técnica de etiquetado balístico. En el protocolo actual, las neuronas piramidales se etiquetan con tinte DilC18(3) y se analizan utilizando un software de reconstrucción neuronal para evaluar la morfología neuronal y las espinas dendríticas. Para investigar la estructura neuronal, se realizan análisis de ramificación dendrítica y análisis de Sholl, lo que permite a los investigadores extraer inferencias sobre la complejidad de las ramificaciones dendríticas y la complejidad del árbol neuronal, respectivamente. La evaluación de las espinas dendríticas se lleva a cabo utilizando un algoritmo de clasificación asistida automática integral para el software de reconstrucción, que clasifica las espinas en cuatro categorías (es decir, delgada, hongo, rechoncho, filopodia). Además, también se eligen otros tres parámetros (es decir, longitud, diámetro de la cabeza y volumen) para evaluar alteraciones en la morfología dendrítica de la columna vertebral. Para validar el potencial de la amplia aplicación de la técnica de etiquetado balístico, las neuronas piramidales del cultivo celular in vitro fueron etiquetadas con éxito. En general, el método de etiquetado balístico es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, lo que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción, permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes disfunción neurocognitiva.

En la Figura 2A,las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones del cerebro de la rata fueron identificadas por la tecnología de etiquetado balístico, caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. La Figura 2B muestra la neurona en el software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal después de que se detectó el soma, se trazaron ramas dendríticas y se det...

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Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Presentamos un protocolo para etiquetar y analizar las neuronas piramidales, que es fundamental para evaluar posibles alteraciones morfológicas en neuronas y espinas dendríticas que pueden subyacen a anomalías neuroquímicas y conductuales.

Etiquetado balístico de las neuronas piramidales en las rebanadas cerebrales y en el cultivo celular primario

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Este protocolo permite evaluar posibles alteraciones morfológicas en las neuronas y las espinas dendríticas que pueden subrayar anomalías neuroquímicas y conductuales. Es único y útil para visualizar las neuronas en diferentes regiones cerebrales en ratas, que en combinación con un sofisticado software de reconstrucción permite a los investigadores dilucidar los posibles mecanismos subyacentes a la disfunción neurocognitiva. Comience preparando la solución PVP de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Llene el tubo con PVP y déjelo durante 20 minutos. Y expulsarlo por el otro extremo con una jeringa de 10 mililitros. Combinar 170 miligramos de perlas de microportadora de tungsteno con 250 microlitros de cloruro de metileno.A continuación, vórtice a fondo la suspensión. A continuación, añadir 6 miligramos de DilC18(3) tinte lipofílico a 300 microlitros de cloruro de metileno y vórtice. Pipet 250 microlitros de la suspensión de cuentas de tungsteno en un portaobjetos de vidrio.Espere a que la suspensión se seque al aire y agregue 300 microlitros de la solución de tinte. Una vez seca, usa una maquinilla de afeitar para dividir la mezcla en dos tubos centrífugos de 1,5 mililitros y llena los tubos con agua. Sonicar la mezcla en un baño de agua hasta que sea homogénea.Asegurarse de que la punta del sonicador se encuentra directamente en los tubos. Combine las dos mezclas en un tubo cónico de 15 mililitros. Y sonicar durante otros tres minutos, asegurándose de que no queden grandes grupos de cuentas recubiertas de tinte.Después de la sonicación, extraiga la mezcla en el tubo recubierto de PVP con una jeringa de 10 mililitros. Y alimenta el tubo a la estación de preparación. Gire el tubo durante un minuto.Retire con cuidado toda el agua con una jeringa. Encienda el gas nitrógeno y ajuste el flujo de nitrógeno a aproximadamente 0,5 litros por minuto. Gire el tubo en la estación de preparación y séquelo con nitrógeno durante 30 minutos.Retire el tubo de la estación y córtelo en segmentos de 13 milímetros con un cortador de tubos. Asegúrese de que la rata no responde a estímulos nocivos y que los reflejos están ausentes. A continuación, asegúrelo en la posición supina.Haga una incisión a lo largo de la línea media torácica. Separe el diafragma y abra el pecho con tijeras. A continuación, inserte una aguja de calibre 20 de 25 milímetros en el ventrículo izquierdo.Corte inmediatamente la aurícula derecha con tijeras y perfunda 15 mililitros de 100 PBS milimétricos con un caudal de 5 milímetros por minuto. A continuación, perfunde 100 mililitros de 4%PFA almacenados en búfer en PBS. Después de la perfusión, extirpa todo el cerebro de la rata.Y postfir lo arregla con 4%PFA durante 10 minutos. Usa una matriz cerebral de rata para cortar la sección coronal de 500 micrómetros de espesor. Haga un corte de puño y mantenga la hoja en su lugar.Luego haz un segundo corte con una segunda hoja y retira verticalmente la primera hoja, manteniendo el tejido en la superficie de la hoja. Coloque las rebanadas cerebrales en la placa de 24 pozos con 1 mililitro de PBS en cada pozo. Y repita el proceso hasta que se hayan cortado todas las rebanadas.Retire PBS de cada pozo objetivo. Cargue el cartílago con la pieza de tubo de dil/tungsteno y colóquelo en el aplicador. Coloque un pedazo de papel de filtro entre las dos pantallas de malla.Y conecte el aplicador a la manguera de helio. A continuación, ajuste la presión de salida de helio a 90 libras por pulgada cuadrada. Coloque el aplicador verticalmente en el centro del pozo de destino 1,5 centímetros entre la muestra y la pantalla de malla.A continuación, dispare el tubo Dil/tungsteno. Cargue el cartílago con el siguiente tubo y dispare continuamente las perlas de la tubería en las rodajas restantes. Llene la placa de 24 pozos con 100 PBS mililares.Y lave las rodajas tres veces con 500 microlitros de PBS fresco. Asegúrese de que las rodajas no se voltean durante el lavado. Cuando haya terminado, agregue 500 microlitros de PBS fresco a las rodajas.Y incubarlos durante tres horas a cuatro grados Celsius en la oscuridad. Después de la incubación, usa un cepillo fino para transferir las rebanadas cerebrales a los portaobjetos de vidrio. Y añadir inmediatamente un mililitro de antifade medio de montaje a cada sección.Coloque un cubreobjetos de 22 por 15 milímetros sobre las secciones y seque los portaobjetos en la oscuridad. Encienda el sistema de microscopio confocal y cambie a un objetivo 60X. Ajuste la configuración de imágenes de acuerdo con las instrucciones del manuscrito.Y obtener imágenes de pila Z para el tipo de neurona dirigida basada en los límites de la región cerebral y características morfológicas de las neuronas. Aísle la neurona cortical primaria de las ratas F344/N en el primer día posnatal y escálalas en un plato inferior de cristal de 35 milímetros durante una semana. Refrescante la mitad del medio en el tercer día después del aislamiento.Lave el plato dos veces con 1 mililitro de 100 pliólonos PBS. Y fijar las celdas con 4%PFA durante 15 minutos a temperatura ambiente. Etiquete balísticamente las celdas como se describió anteriormente.Y lávelos tres veces más con 1 mililitro de PBS. Añadir 500 microlitros de PBS a las células e incubarlos durante tres horas a cuatro grados Celsius en la oscuridad. A continuación, añada 200 microlitros de medio de montaje antifada.Y obtener imágenes de la pila Z para cada neurona dirigida. Las neuronas piramidales típicas en la región del hipocampo en las secciones cerebrales de ratas se identificaron con tecnología de etiquetado balístico caracterizada por una gran dendrita apical y varias dendritas basales más pequeñas alrededor del soma. Se utilizó un software de análisis cuantitativo de reconstrucción neuronal para rastrear ramas dendríticas y detectar espinas.Posteriormente, el software se utilizó para evaluar la complejidad de la ramificación dendrítica y la complejidad del árbol neuronal. Los cambios morfológicos en las espinas dendríticas se evaluaron utilizando la longitud, el volumen y el diámetro de la cabeza. Luego las espinas se clasificaron en espinas delgadas, rechonchas y de seta.Y se examinó la frecuencia relativa del número de espinas entre cada radio. Más bien se validó la técnica de etiquetado balístico en una neurona piramidal primaria en el cultivo celular. Las neuronas piramidales fueron identificadas en base a la forma triangular del soma y la gran dendrita apical.Luego se utilizó un software de reconstrucción neuronal para analizar la distribución de espinas dendríticas delgadas y la longitud de la columna vertebral dendrítica. Al intentar este protocolo, es importante evitar grandes grumos o racimos de tinte balístico recubierto de cuentas de tungsteno comenzando la preparación. Los grumos no permitirían distinguir las neuronas individuales.Combinado con el software de reconstrucción neuronal este método nos permite examinar la morfología neuronal y dendrítica de la columna vertebral en neuronas piramidales hipocampales. El software de reconstrucción neuronal utiliza un algoritmo para ofrecer la clasificación asistida automática de las espinas dendríticas. La cuantificación de múltiples parámetros neuronales ofrece una oportunidad para entender mejor el mecanismo subyacente a la disfunción cognitiva neuronal.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

La disección y la Cultura de las neuronas comisurales de médula espinal embrionaria

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

Investigación

Neurociencias

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Etiquetado DiOLISTIC de las neuronas de los roedores y no humanos rodajas de cerebro de los primates

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Marcaje fluorescente retrógrada Permite dirigida extracelular sola unidad de grabación de neuronas identificadas<em&gt; En vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dos registros electrofisiológicos de sinápticamente respuestas evocadas neuronal y astroglial en agudas rodajas de hipocampo

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Cultivo primario de ratón neuronas dopaminérgicas

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Pareadas Grabaciones de células enteras en organotípicos de hipocampo rebanadas

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Aislamiento, cultivo y mantenimiento a largo plazo de Primaria mesencefálico neuronas dopaminérgicas a partir de cerebros de embriones de roedores

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Las grabaciones de células enteras Patch-clamp en rodajas de cerebro

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...