Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Detta arbete finansierades av NIH bidrag HD043680, MH106392, DA013137 och NS100624.

Alla djur protokoll granskades och godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of South Carolina (federal försäkran nummer: D16-00028).
1. Beredning av DiI/Volframpärla slangar
<ol><li>Lös 100 mg polyvinylpyrrolidon (PVP) med 10 ml ddH2O. Vortex PVP-lösningen lätt.</li>
	<li>Fyll slangen med PVP-lösningen (se Tabell över material)och låt den stå i 20 minuter. Sedan, utvisa PVP-lösningen genom den andra änden av slangen med en 10 ml sprut...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

I detta protokoll beskriver vi en mångsidig märkningsteknik för nervceller från både råttahjärna och de som odlas in vitro. Dessutom rapporterar vi metoden för att utnyttja neuronal återuppbyggnad programvara och neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara för att bedöma neuronal morfologi och dendritiska taggar. Bedömning av neuronal morfologi och dendritiska ryggar ger en möjlighet att bestämma förändringar i dendritiska förgrening komplexitet, neuronal arbor komplexitet, dendritiska ryggra...

År 2000 beskrev Gan et al. en snabb märkningsteknik för enskilda nervceller och glia i nervsystemet som kombinerade olika lipofila färgämnen, vilket möjliggör samtidig märkning av många hjärnceller med olika färger1,2. På senare tid, en ballistisk märkning teknik beskrevs av Seabold et al.3 som introducerade fluorescerande färgämnen (Dil) i nervceller i hjärnan skivor. En mångsidig färgning teknik, ballistiska märkning uppskattas för sin förmåga att utnyttjas i flera djurarter och över ett brett spektrum av åldrar. Dessutom kan det kombineras med immunstainning för att identifiera subpopulationer av hjärnceller3. Jämfört med traditionella tekniker (t.ex. Golgi-Cox silver impregnering, microinjection)4, ballistiska märkning ger en möjlighet att tydligare skilja morfologiska egenskaper, inklusive dendritiska taggar, en funktion som är avgörande för att dra slutsatser om neuronal komplexitet och synaptisk anslutning5.
Excitatoriska pyramidala nervceller kännetecknas av en enda, stor apical dendrit, flera kortare basala dendriter, och tusentals dendritiska taggar6. Pyramidala nervceller finns i flera hjärnan regioner relaterade till högre ordning kognitiv bearbetning, inklusive prefrontala cortex (PFC) och hippocampus. I PFC, pyramidala nervceller observeras i lager II/III och lager V, med varje uppvisar unika morfologi. Specifikt, pyramidala nervceller i lager II / III av PFC har en kortare apikal dendrit och mindre förgrening än pyramidala nervceller i lager V6. Inom hippocampus, pyramidala nervceller finns i både CA1 och CA3 regioner, med varje visar distinkta morfologier. Specifikt, pyramidala nervceller i CA1 regionen uppvisar en mer distinkt apikal dendrit, med förgrening inträffar längre från soma, i förhållande till CA3 regionen6.
Dendritiska taggar på pyramidala nervceller i både PFC och hippocampus är den primära platsen för excitatoriska synapser7. Morfologiska egenskaper hos dendritiska taggar, som klassiskt kännetecknas i tre primära kategorier (dvs. tunn, stubbig eller svamp8), har varit relaterade till storleken på excitatoriska synaps9. Tunna taggar, som kännetecknas av en lång, tunn hals, små bulbous huvud, och mindre postsynaptiska densiteter, är mer instabila och utveckla svagare anslutningar. Svampryggar, som har ett större dendritiskt ryggradshuvud, är dock erkända för att bilda starkare synaptiska anslutningar, en effekt som härrör från deras större storlek. I skarp kontrast, stubby taggar saknar en ryggrad hals, uppvisar en ungefär lika huvud och hals volymförhållande8. Inom hippocampus, grenade taggar kan också observeras, där ryggraden har flera huvuden som kommer ut från samma dendritiska ryggraden hals10. Därför kan morfologiska förändringar av dendritiska taggar återspegla funktionalitet och strukturell kapacitet. Dessutom har studier visat att storleken och formen på dendritiska taggar relaterar till deras strukturella plasticitet, vilket leder till tanken att små taggar är involverade i lärande och uppmärksamhet, medan större, mer stabila taggar, är involverade i långsiktiga processer, inklusive minne11. Dessutom kan fördelningen av dendritiska taggar längs dendriten associeras med synaptisk anslutning5,12.
Således har den nuvarande metodologiska papper tre mål: 1) Presentera vårt protokoll för ballistiska märkning, som har utnyttjats med en framgång (dvs. nervceller som uppfyller urvalskriterier och lämpliga för analys) av 83,3%5,12,13 och över flera regioner i hjärnan (dvs. PFC, nucleus accumbens, hippocampus); 2) Visa generaliserbarhet av tekniken och dess tillämpning på nervceller odlas in vitro; 3) Detalj den metod som används i neuronal återuppbyggnad programvara och slutsatser som kan dras från sådana data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Det har rapporterats att storleken och formen på dendritiska taggar är relaterad till deras strukturella plasticitet. För att identifiera den morfologiska strukturen av pyramidala nervceller och dendritiska taggar, en ballistisk märkning teknik kan utnyttjas. I det nuvarande protokollet, pyramidala nervceller är märkta med DilC18(3) färgämne och analyseras med neuronal återuppbyggnad programvara för att bedöma neuronal morfologi och dendritiska taggar. För att undersöka neuronal struktur, dendritiska förgrening analys och Sholl analys utförs, så att forskare att dra slutsatser om dendritiska förgrening komplexitet och neuronal arbor komplexitet, respektive. Utvärderingen av dendritiska taggar utförs med hjälp av en automatisk assisterad klassificering algoritm integrerad i återuppbyggnaden programvara, som klassificerar ryggar i fyra kategorier (dvs tunn, svamp, stubby, filopodia). Dessutom väljs ytterligare tre parametrar (dvs. längd, huvuddiameter och volym) också för att bedöma förändringar i dendritisk ryggrad morfologi. För att validera potentialen för bred tillämpning av ballistiska märkning teknik, pyramidala nervceller från in vitro cell kultur var framgångsrikt märkt. Sammantaget är ballistisk märkningsmetoden unik och användbar för att visualisera nervceller i olika hjärnregioner hos råttor, vilket i kombination med sofistikerad rekonstruktionsprogramvara gör det möjligt för forskare att belysa de möjliga mekanismerna bakom neurokognitiv dysfunktion.

I figur 2Aidentifierades de typiska pyramidala nervcellerna i hippocampus regionen i råttahjärnans sektioner av ballistiska märkningsteknik, som kännetecknas av en stor apical dendrite och flera mindre basala dendriter runt soma. Figur 2B visar neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara efter soma upptäcktes, dendritiska grenar spårades och ryggar upptäcktes. Därefter analyserades data med hjälp av neuronal återuppbyggnad kvantitativ analy...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Vi presenterar ett protokoll för att märka och analysera pyramidala nervceller, som är avgörande för att utvärdera potentiella morfologiska förändringar i nervceller och dendritiska ryggar som kan ligga till grund för neurokemiska och beteendemässiga avvikelser.

Ballistisk märkning av pyramidal neuroner i hjärnan skivor och i primär cell kultur

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Detta protokoll gör det möjligt att utvärdera potentiella morfologiska förändringar i nervceller och dendritic spines som kan understryka neurokemiska och beteendemässiga avvikelser. Det är unikt och användbart för att visualisera nervceller i olika hjärnregioner hos råttor, vilket i kombination med sofistikerad återuppbyggnadsprogram gör det möjligt för forskare att belysa de möjliga mekanismerna bakom neurokognitiv dysfunktion. Börja med att förbereda PVP-lösning enligt manuskriptriktningar.Fyll slangen med PVP och låt den vara i 20 minuter. Och driva ut den genom andra änden med en 10 milliliter spruta. Kombinera 170 milligram volfram microcarrier pärlor med 250 mikroliter metylenklorid.Sedan noggrant virvel suspensionen. Därefter lägger du till 6 milligram lipofila DilC18(3)färgämne till 300 mikroliter metylenklorid och virvel. Pipet 250 mikroliter av volfram pärlan suspensionen på ett glas slide.Vänta tills fjädringen lufttorka och tillsätt 300 mikroliter av färgämneslösningen. När torkat, använd en rakhyvel för att dela blandningen i två 1,5 milliliter centrifugrör och fyll rören med vatten. Sonikera blandningen i ett vattenbad tills homogen.Se till att sonicator spetsen ligger direkt på rören. Kombinera de två blandningarna i en 15 milliliter konisk rör. Och sonikera i ytterligare tre minuter, se till att inga stora klumpar av färgbelagda pärlor kvar.Efter ultraljudsbehandling, dra blandningen i PVP belagda slangar med en 10 milliliter spruta. Och mata in slangen i förberedelsestationen. Rotera slangen i en minut.Ta försiktigt bort allt vatten med hjälp av en spruta. Sätt på kvävegasen och justera kväveflödet till cirka 0,5 liter per minut. Rotera slangen i beredningsstationen och torka den med kvävgas i 30 minuter.Ta bort slangen från stationen och skär den i 13 millimeter segment med en slangskärare. Se till att råttan inte är lyhörd för skadliga stimuli och reflexer är frånvarande. Sedan säkra den i ryggläge.Gör ett snitt längs bröstkorgens mittlinje. Separera membranet och öppna bröstet med sax. Sätt sedan in en 20 gauge 25 millimeters nål i den vänstra ventrikeln.Skär omedelbart höger förmak med sax och granska 15 milliliter på 100 millimolar PBS med en 5 millimeter per minut flödeshastighet. Sedan granska 100 milliliter av 4%PFA buffrade i PBS. Efter perfusion, ta bort hela råtthjärnan.Och postfix det med 4%PFA i 10 minuter. Använd en rat brain matris för att skära 500 mikrometer tjock koronasektion. Gör en knytnäve klippa och hålla bladet på plats.Gör sedan ett andra snitt med ett andra blad och vertikalt ta bort det första bladet, hålla vävnaden på bladytan. Placera hjärnan skivor i 24-brunnsplattan med 1 milliliter PBS i varje brunn. Och upprepa processen tills alla skivor har skurits.Ta bort PBS från varje riktad brunn. Ladda brosket med bit Dil / volfram slangar och placera den i applikatorn. Lägg en bit filterpapper mellan de två nätskärmarna.Och koppla applikatorn till heliumslangen. Justera sedan utgående trycket av helium till 90 pounds per kvadrattum. Placera applikatorn vertikalt på mitten av den riktade väl 1,5 centimeter mellan provet och nätskärmen.Avfyra sedan Dil/volframslangen. Ladda brosket med nästa slangar och kontinuerligt eld pärlorna från slangarna på de återstående skivorna. Fyll 24-brunnsplattan med 100 millimolar PBS.Och tvätta skivorna tre gånger med 500 mikroliter färska PBS. Se till att skivorna inte vänds över under tvätten. När du är klar, tillsätt 500 mikroliter färska PBS till skivorna.Och inkubera dem i tre timmar vid fyra grader Celsius i mörkret. Efter inkubationen, använd en fin borste för att överföra hjärnan skivor på glas diabilder. Och omedelbart lägga till en milliliter av antifade monteringsmedium till varje sektion.Placera en 22 och 15 millimeter coverslip över sektionerna och torka diabilder i mörkret. Slå på confocal mikroskop systemet och byta till en 60X mål. Justera bildframställningsinställningarna enligt manuskriptriktningar.Och få Z-stack bilder för den riktade neuron typ baserat på hjärnans region gränser och morfologiska egenskaper av nervceller. Isolera primära när neuron från F344/N råttor vid postnatal dag ett och kultur dem i en 35 millimeter glas botten skålen för en vecka. Uppfriskande hälften av mediet på den tredje dagen efter isolering.Tvätta skålen två gånger med 1 milliliter på 100 millimolar PBS. Och fixa cellerna med 4%PFA i 15 minuter vid rumstemperatur. Ballistiskt märka cellerna som tidigare beskrivits.Och tvätta dem tre gånger till med 1 milliliter PBS. Tillsätt 500 mikroliter PBS till cellerna och inkubera dem i tre timmar i fyra grader Celsius i mörkret. Tillsätt sedan 200 mikroliter av antifade monteringsmedium.Och erhålla Z-stack bilder för varje riktad neuron. Typiska pyramidala nervceller i hippocampus regionen i rat hjärnan avsnitten identifierades med ballistiska märkning teknik som kännetecknas av en stor apikala dendrite och flera mindre basala dendriter runt soma. Neuronal återuppbyggnad kvantitativ analys programvara användes för att spåra dendritic grenar och upptäcka spines.Därefter användes programvaran för att bedöma dendritic förgrening komplexitet och neuronal arbor komplexitet. Morfologiska förändringar i dendritiska taggar bedömdes med hjälp av längd, volym och huvudet diameter. Då ryggrader klassificerades i tunna, stubby, och svamp ryggar.Och den relativa frekvensen av antalet taggar mellan varje radie undersöktes. Ytterligare mer ballistiska märkning tekniken validerades på en primär pyramidal neuron i cellkultur. Pyramidal nervceller identifierades baserat på triangeln form av soma och stora apikala dendrite.Sedan neuronal återuppbyggnad programvara användes för att analysera fördelningen av tunna dendritiska spines och dendritic spine längd. När du försöker detta protokoll, Det är viktigt att undvika stora klumpar eller kluster av ballistiska färgämne belagda volfram pärlor börjar beredning. Klumpar skulle inte tillåta enskilda nervceller som skall särskiljas.Kombinerat med neuronal återuppbyggnad programvara denna metod tillåter oss att undersöka neuronal och dendritiska ryggrad morfologi i hippocampus pyramidala nervceller. Neuronal återuppbyggnad programvara utnyttja en algoritm för att erbjuda automatisk assisterad klassificering av dendritiska spines. Kvantifieringen av flera neuronala parametrar erbjuder en möjlighet att bättre förstå mekanismen bakom neuronal kognitiv dysfunktion.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Dissektion och kultur commissural neuroner från embryonala ryggmärg

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

DiOLISTIC Märkning av nervceller från gnagare och icke-mänskliga primater Slices Brain

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Bakåtsträvande Fluorescerande märkning Tillåter Riktade Extracellular Single-enhet Inspelning från identifierade nervceller<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Imaging Kalcium svar i GFP-märkta neuroner i hypotalamus skivor mushjärna

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Spänningskänsliga Dye Inspelning från axoner, dendriter och Dendritutskotten av enskilda nervceller i hjärnan skivor

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Dubbla Elektrofysiologiska Inspelningar av synaptiskt-framkallade astrogliala och neuronala svar i akut hippocampus skivor

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Primär kultur av mus dopaminerga neuroner

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Isolering, kultur och långsiktigt underhåll av primär mesencefala dopaminerga neuron från embryonala Gnagare Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...