Name: ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture
Uploaded: 2020-04-02T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Bu çalışma NIH tarafından finanse edilmiştir HD043680, MH106392, DA013137, ve NS100624.

Tüm hayvan protokolleri Gözden geçirildi ve Güney Carolina Üniversitesi Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı (federal güvence numarası: D16-00028).
1. DiI/Tungsten boncuk tüp hazırlanması
<ol><li>100 mg polivinilpyrrolidone (PVP) ile 10 mL ddH2O. Vortex PVP çözeltisini hafifçe çözün.</li>
	<li>Tüpü PVP çözeltisi ile doldurun (Bkz. Malzeme Tablosu)ve 20 dk bekletin. Daha sonra PVP çözeltisini 10 mL şırınga kullanarak t...

<ol>
	<li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, W. T., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+"DiOlistic"+labeling+of+the+nervous+system+using+lipophilic+dye+combinations.">Multicolor "DiOlistic" labeling of the nervous system using lipophilic dye combinations.</a> Neuron. 27, 219-225 (2000).</li><li>Gan, W. B., Grutzendler, J., Wong, R. O., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ballistic+delivery+of+dyes+for+structural+and+functional+studies+of+the+nervous+system.">Ballistic delivery of dyes for structural and functional studies of the nervous system.</a> Cold Spring Harbor Protocol. 2009 (4), 5202 (2009).</li><li>Seabold, G. K., Daunais, J. B., Rau, A., Grant, K. A., Alvarez, V. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DiOLISTIC+labeling+of+neurons+from+rodent+and+non-human+primate+brain+slices.">DiOLISTIC labeling of neurons from rodent and non-human primate brain slices.</a> Journal of Visualized Experiments. (41), (2010).</li><li>Spacek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+the+Golgi+method:+a+time-lapse+study+of+the+early+stages+of+impregnation+in+single+sections.">Dynamics of the Golgi method: a time-lapse study of the early stages of impregnation in single sections.</a> Journal of Neurocytology. 18 (1), 27-38 (1989).</li><li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Timing:+NeuroHIV+Progression+in+the+Post-cART+Era.">Disruption of Timing: NeuroHIV Progression in the Post-cART Era.</a> Science Reports. 9 (1), 827 (2019).</li><li>Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyramidal+neurons:+dendritic+structure+and+synaptic+integration.">Pyramidal neurons: dendritic structure and synaptic integration.</a> Nature Reviews Neurosciences. 9 (3), 206-221 (2008).</li><li>Megias, M., Emri, Z., Freund, T. F., Gulyas, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+number+and+distribution+of+inhibitory+and+excitatory+synapses+on+hippocampal+CA1+pyramidal+cells.">Total number and distribution of inhibitory and excitatory synapses on hippocampal CA1 pyramidal cells.</a> Neuroscience. 102, 527-540 (2001).</li><li>Peters, A., Kaiserman-Abramof, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+small+pyramidal+neuron+of+the+rat+cerebral+cortex.+The+perikaryon,+dendrites+and+spines.">The small pyramidal neuron of the rat cerebral cortex. The perikaryon, dendrites and spines.</a> American Journal of Anatomy. 127, 321-355 (1970).</li><li>Harris, K. M., Sultan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+in+the+number,+location,+and+size+of+synaptic+vesicles+provides+an+anatomical+basis+for+the+nonuniform+probability+of+release+at+hippocampal+CA1+synapses.">Variation in the number, location, and size of synaptic vesicles provides an anatomical basis for the nonuniform probability of release at hippocampal CA1 synapses.</a> Neuropharmacology. 34, 1387-1395 (1995).</li><li>Sorra, K. E., Fiala, J. C., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+assessment+of+the+involvement+of+perforations,+spinules,+and+spine+branching+in+hippocampal+synapse+formation.">Critical assessment of the involvement of perforations, spinules, and spine branching in hippocampal synapse formation.</a> Journal of Comparative Neurology. 398, 225-240 (1998).</li><li>Mancuso, J. J., Chen, Y., Li, X., Xue, Z., Wong, S. T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+of+dendritic+spine+detection:+from+Golgi+to+high-resolution+optical+imaging.">Methods of dendritic spine detection: from Golgi to high-resolution optical imaging.</a> Neuroscience. 251, 129-140 (2012).</li><li>McLaurin, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+connectivity+in+medium+spiny+neurons+of+the+nucleus+accumbens:+A+sex-dependent+mechanism+underlying+apathy+in+the+HIV-1+transgenic+rat.">Synaptic connectivity in medium spiny neurons of the nucleus accumbens: A sex-dependent mechanism underlying apathy in the HIV-1 transgenic rat.</a> Frontiers in Behavior Neurosciences. 12, 285 (2018).</li><li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+transgenic+female+rat:+synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens.">HIV-1 transgenic female rat: synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> Journal of Neuroimmune Pharmacology. 9 (5), 642-653 (2014).</li><li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+Filamentous+Actin+(F-actin)+Puncta+in+Rat+Cortical+Neurons.">Quantification of Filamentous Actin (F-actin) Puncta in Rat Cortical Neurons.</a> Journal of Visualized Experiments. (108), e53697 (2016).</li><li>Rodriguez, A., Ehlenberger, D. B., Dickstein, D. L., Hof, P. R., Wearne, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Three-Dimensional+Detection+and+Shape+Classification+of+Dendritic+Spines+from+Fluorescence+Microscopy+Images.">Automated Three-Dimensional Detection and Shape Classification of Dendritic Spines from Fluorescence Microscopy Images.</a> PLoS ONE. 3 (10), 1371 (2008).</li></ol>

Bu protokolde, hem sıçan beyninden nöronlar hem de in vitro yetiştirilenler için çok yönlü bir etiketleme tekniğini tanımlıyoruz. Ayrıca nöronal morfoloji ve dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ve nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımını kullanma metodolojisini de rapor ediyoruz. Nöronal morfoloji ve dendritik dikenlerin değerlendirilmesi dendritik dallanma karmaşıklığı, nöronal arbor karmaşıklığı, dendritik omurga morfolojisi ve sina...

2000 yılında, Gan ve ark bireysel nöronlar ve çeşitli lipophilic boyalar kombine sinir sisteminde glia için hızlı bir etiketleme tekniği açıklanan, farklı renklerde birçok beyin hücrelerinin eşzamanlı etiketleme için izin1,2. Daha yakın zamanda, bir balistik etiketleme tekniği Seabold ve ark.3 tarafından bu floresan boyalar tanıttı (Dil) beyin dilimleri nöronların içine. Çok yönlü bir boyama tekniği olan balistik etiketleme, birden fazla hayvan türünde ve çok çeşitli yaşlarda kullanılabilme yeteneğinden dolayı takdir edilmektedir. Ayrıca, beyin hücrelerinin alt popülasyonları belirlemek için immünboyama ile kombine edilebilir3. Geleneksel tekniklerle karşılaştırıldığında (örneğin, Golgi-Cox gümüş emprenye, mikroenjeksiyon)4, balistik etiketleme daha net morfolojik özellikleri ayırt etmek için bir fırsat sunuyor, dendritik dikenler de dahil olmak üzere, nöronal karmaşıklık ve sinaptik bağlantı hakkında çıkarımlar çizim için kritik bir özellik5.
Uyarıcı piramidal nöronlar tek, büyük apikal dendrit, birden fazla kısa bazal dendritler ve dendritik omurgalar binlerce ile karakterizedir6. Piramidal nöronlar yüksek derecede bilişsel işleme ile ilgili birden fazla beyin bölgelerinde bulunur, prefrontal korteks dahil (PFC) ve hipokampus. PFC'de piramidal nöronlar II/III ve V tabakasında gözlenir ve her biri benzersiz morfoloji sergiler. Özellikle, PFC katman II / III piramidal nöronlar daha kısa apikal dendrite ve katman Vpiramidalnöronlar daha az dallanma var 6 . Hipokampus içinde, piramidal nöronlar ca1 ve CA3 bölgelerinde hem de bulunan, her farklı morfolojileri gösteren. Özellikle, CA1 bölgesindeki piramidal nöronlar daha belirgin bir apikal dendit sergilerler, dallanma somadan daha uzakta meydana gelen, CA3 bölgesine göre6.
Hem PFC hem de hipokampuspiral nöronlar üzerinde Dendritik dikenler uyarıcı sinapsların birincil site7. Klasik olarak üç ana kategoriye (yani ince, güdük veya mantar8)ayrılır, dendritik dikenlerin morfolojik özellikleri, uyarıcı sinaps9'unbüyüklüğüile ilişkilidir. İnce dikenler, uzun, ince boyun ile karakterize, küçük soğanlı kafa, ve küçük postsinaptik yoğunlukları, daha kararsız ve zayıf bağlantılar geliştirmek. Ancak, mantar dikenleri, daha büyük bir dendritik omurga kafası var, güçlü sinaptik bağlantılar oluşturmak için tanınan, onların büyük boyutu kaynaklanan bir etki. Keskin kontrast olarak, güdük dikenler bir omurga boyun yoksun, yaklaşık eşit baş ve boyun hacim oranı sergileyen8. Hipokampus içinde, dallı dikenler de görülebilir, omurga aynı dendritik omurga boyun ortaya birden fazla başları vardır nerede10. Bu nedenle, dendritik dikenlerin morfolojik değişiklikleri işlevselliği ve yapısal kapasiteyi yansıtabilir. Ayrıca, çalışmalar dendritik dikenlerin boyutu ve şekli yapısal plastisite ile ilgili olduğunu göstermiştir, küçük dikenler öğrenme ve dikkat dahil olduğu fikrine yol açan, daha büyük ise, daha istikrarlı dikenler, bellek dahil olmak üzere uzun vadeli süreçlerde yer almaktadır11. Ayrıca, dendrit boyunca dendritik dikenlerin dağılımı sinaptik bağlantıileilişkili olabilir 5,12.
Böylece, mevcut metodolojik kağıt üç hedefleri vardır: 1) bir başarı oranı ile kullanılmıştır balistik etiketleme için protokol mevcut (yani, nöronlar seçim kriterleri toplantı ve analiz için uygun) 83.3%5,12,13 ve birden fazla beyin bölgeleri arasında (yani, PFC, çekirdek accumbens, hipokampus); 2) Tekniğin genellenebilirliğini ve in vitro olarak yetiştirilen nöronlara uygulanmasını göstermek; 3) Nöronal rekonstrüksiyon yazılımında kullanılan metodolojiyi ve bu verilerden çıkarılabilen çıkarımları ayrıntılı olarak inceleyin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:868px;" width="869">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">20Gx25mm PrecisionGlide needle</td>
			<td style="width:263px;">BD</td>
			<td style="width:143px;">305175</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well cell culture plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3562</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">35 mm Glass Bottom Dishes</td>
			<td>MatTek Corporation</td>
			<td>P35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Antibiotic-Antimycotic solution</td>
			<td>Cellgro</td>
			<td>30004CI</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">B-27 supplement</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17504-044</td>
			<td>50X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Barrel liner</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Borax</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B9876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Boric acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B0252</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cartridge holder</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2426</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal imaging software</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">EZ-C1</td>
			<td>version 3.81b</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:143px;">TE-2000E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>637-137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DilC18(3)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM/F12 medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #7 Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">F344 rat</td>
			<td style="width:263px;">(Harlan Laboratories, Indianapolis, IN)</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Glucose</td>
			<td>VWR</td>
			<td>101174Y</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">GlutaMax</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>35050-061</td>
			<td>100X</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">HBSS</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4641</td>
			<td>10X</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios diffusion screens</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2475</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Helios gene gun system</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2431</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Helium hose assembly</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Forceps</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>15914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Iris Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500216</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene chloride</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>D150-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Neurobasal medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:296px;">Neurolucida 360 software</td>
			<td style="width:263px;">mbf bioscience</td>
			<td style="width:143px;"></td>
			<td>dendritic spine analysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Poly-L-Lysine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinylpyrrolidone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>5295</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ProLong Gold antifade reagent</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>P36930</td>
			<td>mounting medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat brain matrix, 300 - 600g, Coronal, 0.5mm</td>
			<td>Ted Pella</td>
			<td>15047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sevoflurane</td>
			<td>Merritt Veterinary Supply</td>
			<td>347075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sodium Bicarbonate</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">SuperFrost Plus Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-154%</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe kit</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tefzel tubing</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15400-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing cutter</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tubing Prep station</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tungsten M-25 Microcarrier 1.7 &#181;m</td>
			<td>BIO-RAD</td>
			<td>165-2269</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vannas Scissors</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>500086</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ballistic labeling of pyramidal neurons in brain slices and in primary cell culture

Dendritik dikenlerin büyüklüğü ve şeklinin yapısal plastisite ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Piramidal nöronların ve dendritik dikenlerin morfolojik yapısını belirlemek için balistik etiketleme tekniği nden yararlanılabilir. Bu protokolde, piramidal nöronlar DilC18(3) boya ile etiketlenmiş ve nöronal morfolojive dendritik dikenleri değerlendirmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı kullanılarak analiz edilmiştir. Nöronal yapıyı araştırmak için, dendritik dallanma analizi ve Sholl analizi yapılır, araştırmacılar dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı hakkında çıkarımlar çizmek için izin, sırasıyla. Dendritik dikenlerin değerlendirilmesi, rekonstrüksiyon yazılımının ayrılmaz bir parçası olan ve omurgaları dört kategoriye ayıran otomatik destekli sınıflandırma algoritması kullanılarak yapılır (örn. ince, mantar, güdük, filopodia). Ayrıca dendritik omurga morfolojisindeki değişiklikleri değerlendirmek için ek üç parametre (uzunluk, kafa çapı ve hacim) seçilir. Balistik etiketleme tekniğinin geniş uygulama potansiyelini doğrulamak için, in vitro hücre kültüründen piramidal nöronlar başarıyla etiketlendi. Genel olarak, balistik etiketleme yöntemi benzersiz ve farelerde farklı beyin bölgelerinde nöronları görselleştirmek için yararlıdır, hangi sofistike yeniden yapılanma yazılımı ile birlikte, araştırmacılar altta yatan olası mekanizmaları açıklamak için izin verir nörokognitif disfonksiyon.

Şekil 2A'da,sıçan beyin bölümlerinde hipokampal bölgede tipik piramidal nöronlar balistik etiketleme teknolojisi ile tespit edildi, bir büyük apikal dendrit ve soma etrafında birkaç küçük bazal dendrit ile karakterize. Şekil 2B, soma tespit edildikten sonra nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımında nöronu gösterir, dendritik dallar izlenebilir ve omurgalar saptanmıştır. Daha sonra veriler nöronal rekonstrüksiyon kantitatif ...

Watch this Scientific Journal Video about Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture at JoVE.com

Ballistic Labeling of Pyramidal Neurons in Brain Slices and in Primary Cell Culture

Nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altında yatan nöronlar ve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesi için kritik olan piramidal nöronları etiketlemek ve analiz etmek için bir protokol salıyoruz.

Beyin Dilimlerinde ve Birincil Hücre Kültüründe Piramidal Nöronların Balistik Etiketlemesi

It has been reported that the size and shape of dendritic spines is related to their structural plasticity. To identify the morphological structure of ...

Bu protokol, nörokimyasal ve davranışsal anormalliklerin altını çizebilecek nöronve dendritik dikenlerde potansiyel morfolojik değişikliklerin değerlendirilmesini mümkün kılmıştır. Bu benzersiz ve sıçanlarda farklı beyin bölgelerinde nöronların görselleştirilmesi için yararlıdır, hangi sofistike yeniden yapılanma yazılımı ile birlikte araştırmacılar nörobilişsel disfonksiyon altında yatan olası mekanizmaları açıklamak için izin verir. PVP çözümlerini el yazması talimatlara göre hazırlayarak başlayın.Tüpü PVP ile doldurun ve 20 dakika bekletin. Ve 10 mililitrelik bir şırıngayla diğer taraftan dışarı at. 170 miligram tungsten mikrotaşıyıcı boncukları 250 mikrolitre metilen klorür ile birleştirin.Sonra iyice süspansiyon girdap. Sonra, metilen klorür ve girdap 300 mikrolitre lipophilic DilC18(3) boya 6 miligram ekleyin. Pipet 250 tungsten boncuk süspansiyon bir cam slayt üzerine mikrolitre.Süspansiyonun kurumasını bekleyin ve boya çözeltisinin 300 mikrolitresini ekleyin. Kuruduktan sonra, karışımı iki adet 1,5 mililitrelik santrifüj tüpüne bölmek ve tüpleri suyla doldurmak için bir jilet kullanın. Homojen kadar bir su banyosunda karışımı sonicate.Sonicator ucu tüpler üzerinde doğrudan yatıyor emin olun. 15 mililitrelik konik bir tüp iki karışımları birleştirin. Ve üç dakika daha sonicate, boya kaplı boncuk hiçbir büyük kümeleri kalır emin olun.Sonication sonra, 10 mililitreşile PVP kaplı boru içine karışımı çizin. Ve tüpü hazırlık istasyonuna yedirin. Tüpü bir dakika döndürün.Bir şırınga kullanarak tüm suyu dikkatlice çıkarın. Azot gazını açın ve azot akışını dakikada yaklaşık 0,5 litreye ayarlayın. Tüpü hazırlık istasyonunda döndürün ve 30 dakika boyunca azot ile kurulayın.Boruyu istasyondan çıkarın ve bir boru kesicisi ile 13 milimetrelik parçalarhalinde kesin. Sıçan zararlı uyaranlara yanıt olmadığından emin olun ve refleksleri yok. Sonra supine pozisyonda güvenli.Torasik orta hat boyunca bir kesi yapın. Diyaframı ayırın ve göğsü makasla açın. Sonra sol ventrikül içine 20 gauge 25 milimetrelik bir iğne takın.Hemen makas ile sağ atriyum kesilmiş ve dakikada 5 milimetre akış hızı ile 100 milimolar PBS 15 mililitre perfuse. Daha sonra PBS tamponlu% 4 PFA 100 mililitre perfuse. Perfüzyondan sonra, tüm sıçan beynini çıkarın.Ve 10 dakika boyunca% 4 PFA ile postfix. 500 mikrometre kalınlığında koronal kesit kesmek için bir sıçan beyin matris kullanın. Bir yumruk kes ve yerinde bıçak tutun.Sonra ikinci bir bıçak ile ikinci bir kesim yapmak ve dikey olarak ilk bıçak kaldırmak, bıçak yüzeyinde doku tutmak. Her kuyuda 1 mililitre PBS ile 24 kuyulu plakaya beyin dilimlerini yerleştirin. Ve tüm dilimler kesilene kadar işlemi tekrarlayın.PBS'yi hedeflenen her kuyudan çıkarın. Kıkırdağı Dil/tungsten boru parçasıile yükleyin ve aplikatöre yerleştirin. İki kafes ekran arasına bir parça filtre kağıdı koyun.Aplikatörü helyum hortumuna bağlayın. Sonra helyum çıkış basıncını inç kare başına 90 pound ayarlayın. Aplikatörü hedeflenen kuyunun ortasına dikey olarak yerleştirin örnek le örgü ekran arasına 1,5 santimetre.Sonra Dil / tungsten tüp ateş. Kıkırdağı bir sonraki tüple yükleyin ve kalan dilimler üzerindeki boncukları sürekli olarak ateşleyin. 24 kuyulu plakayı 100 milimolar PBS ile doldurun.Dilimleri 500 mikrolitre taze PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama sırasında dilimlerin ters çevrilmediğinden emin olun. Bittiğinde, dilimlere 500 mikrolitre taze PBS ekleyin.Ve onları karanlıkta dört derece santigrat derecede üç saat kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, beyin dilimlerini cam slaytlara aktarmak için ince bir fırça kullanın. Ve hemen her bölüme bir mililitre antifade montaj ortamı ekleyin.Bölümlerin üzerine 22'ye 15 milimetrelik bir kapak kaydırın ve slaytları karanlıkta kurulayın. Konfokal mikroskop sistemini açın ve 60X hedefine geçin. Görüntüleme ayarlarını el yazması talimatlara göre ayarlayın.Ve beyin bölgesi sınırları ve nöronların morfolojik özelliklerine göre hedeflenen nöron tipi için Z-yığın görüntüleri elde. Birinci doğum sonrası ilk doğum gününde F344/N sıçanlarından birincil kortikal nöron izole edin ve onları bir hafta boyunca 35 milimetrelik cam alt çanakta kültürleyin. Tecritten sonraki üçüncü gün ortamın yarısını serinletin.1 mililitre 100 milimolar PBS ile iki kez çanak yıkayın. Ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca% 4 PFA ile hücreleri düzeltmek. Hücreleri daha önce açıklandığı gibi balistik olarak etiketle.Ve 1 mililitre PBS ile üç kez daha yıkayın. Hücrelere 500 mikrolitre PBS ekleyin ve karanlıkta dört derece santigrat üç saat kuluçka. Daha sonra 200 mikrolitre antifade montaj ortamı ekleyin.Ve her hedeflenen nöron için Z-yığın görüntüleri elde edin. Sıçan beyin bölümlerinde hipokampal bölgede tipik piramidal nöronlar bir büyük apikal dendrit ve soma etrafında birkaç küçük bazal dendritler ile karakterize balistik etiketleme teknolojisi ile tespit edildi. Nöronal rekonstrüksiyon kantitatif analiz yazılımı dendritik dalları izlemek ve dikenleri tespit etmek için kullanılmıştır.Daha sonra, yazılım dendritik dallanma karmaşıklığı ve nöronal arbor karmaşıklığı değerlendirmek için kullanılmıştır. Dendritik dikenlerde morfolojik değişiklikler uzunluk, hacim ve baş çapı kullanılarak değerlendirildi. Daha sonra dikenler ince, güdük ve mantar dikenleri olarak sınıflandırıldı.Ve her yarıçap arasındaki diken sayısının göreceli frekansı incelendi. Ayrıca balistik etiketleme tekniği hücre kültüründe birincil piramidal nöron üzerinde doğrulandı. Piramidal nöronlar soma ve büyük apikal dendit üçgen şekline göre tanımlanmış.Daha sonra ince dendritik dikenlerin ve dendritik omurga uzunluğunun dağılımını analiz etmek için nöronal rekonstrüksiyon yazılımı kullanıldı. Bu protokolü çalışırken, büyük kümeler veya balistik boya kaplı tungsten boncuk kümeleri hazırlık başlayan önlemek önemlidir. Kümeler tek tek nöronların ayırt edilmesine izin vermez.Nöronal rekonstrüksiyon yazılımı ile birlikte bu yöntem bize hipokampal piramidal nöronlarda nöronal ve dendritik omurga morfolojisi incelemek için izin verir. Nöronal rekonstrüksiyon yazılımı dendritik dikenlerin otomatik destekli sınıflandırmasını sunmak için bir algoritma kullanır. Birden fazla nöronal parametrelerin nicelleştirilmesi daha iyi nöronal kognitif disfonksiyon altında yatan mekanizmaanlamak için bir fırsat sunuyor.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Dissection and Culture of Commissural Neurons from Embryonic Spinal Cord

Embriyonik Omurilik Commissural Nöronlar Diseksiyon ve Kültür

Commissural neurons have been widely used to investigate the mechanisms underlying axon guidance during embryonic spinal cord development. The cell bodies ...

DiOLISTIC Labeling of Neurons from Rodent and Non-human Primate Brain Slices

Kemirgen Nöronlar ve Sigara insan Primate Beyin Slices DiOLISTIC Etiketleme

DiOLISTIC staining uses the gene gun to introduce fluorescent dyes, such as DiI, into neurons of brain slices (Gan et al., 2009; O'Brien and Lummis, 2007; ...

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograd Floresan Etiketleme Belirlenen Nöronlar gelen Hedefli Hücre dışı Tek ünitesi Kayıt izin verir<em&gt; In vivo</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Hipotalamik Fare Beyin Dilimleri GFP etiketli Nöronlar in Görüntüleme Kalsiyum Cevapları

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Aksonlar, Dendrit ve Beyin Dilimleri Bireysel Nöron Dendritik Spine kaynaklanan voltaj duyarlı Boya Kaydı

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Akut Hipokampal Dilimler içinde Synaptically-uyarılmış astroglial ve Nöronal Cevaplarının İkili Elektrofizyolojik Kayıtlar

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Primary Culture of Mouse Dopaminergic Neurons

Fare dopaminerjik nöronlar İlköğretim Kültür

Dopaminergic neurons represent less than 1% of the total number of neurons in the brain. This low amount of neurons regulates important brain functions ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Embriyonik Kemirgen Brain itibaren İlköğretim Mesensefalik dopaminerjik Nöronlar İzolasyonu, Kültür ve Uzun Vadeli Bakım

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...