Name: impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00
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Ringraziamo Olivia Funk per la sua assistenza tecnica con i dati del sistema di analisi cellulare in tempo reale. Ringraziamo anche il Medical Writing Center di Children's Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto da Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) e dal finanziamento del Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (a TP).

NOT:</</c0> Tutti i materiali di coltura cellulare devono essere sterili e l'intero esperimento deve essere eseguito in un armadietto della biosicurezza in condizioni sterili.
1. Cultura ed elettroporazione della linea cellulare Glioblastoma U-118MG
<ol><li>Cultura la linea cellulare U-118MG nel siero bovino fetale 5% (FBS) contenente Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (mezzo di coltura) e Mantenere a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umida contenente il 5% di incuba...

<ol>
	<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a/b+in+solid+cancer.">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li><li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration,+invasion,+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer.">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li><li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion.">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).</li><li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions.">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis.">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li><li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation.">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis.">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).</li><li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras.">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li><li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions.">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells.">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice.">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L.">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes &amp; Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li></ol>

La misurazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale è un processo di monitoraggio semplice, rapido e continuo con molteplici e significativi vantaggi rispetto ai metodi tradizionali che forniscono dati in un singolo momento. Come per i metodi tradizionali, le condizioni sperimentali devono essere ottimizzate per ogni linea cellulare per il sistema di analisi cellulare in tempo reale, perché ogni linea cellulare può essere diversa in termi...

Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare i genotipi e i fenotipi del cancro è fondamentale per comprendere e progettare strategie terapeutiche efficaci. Decenni di ricerca sul cancro hanno portato allo sviluppo e all'adattamento di diversi metodi per determinare i genotipi e i fenotipi del cancro. Uno degli ultimi sviluppi tecnici è la misurazione in tempo reale della migrazione cellulare e dell'invasione basata sull'impedimento cellulare. L'adesione cellulare ai substrati e ai contatti cellulare svolge un ruolo importante nella comunicazione e nella regolazione cellulare-cellulare, nello sviluppo e nella manutenzione dei tessuti. Le anomalie nell'adesione cellulare portano alla perdita del contatto cellulare, alla degradazione della matrice extracellulare (ECM), e al guadagno di capacità migratorie e invasive da parte delle cellule, che contribuiscono alla metastasi delle cellule tumorali a diversi organi1,2. Sono disponibili vari metodi per determinare la migrazione cellulare (guarigione delle ferite e saggi della camera di Boyden) e l'invasione (saggio della camera Matrigel-Boyden)3,4,5.5 Questi metodi convenzionali sono semiquantitativi perché le cellule devono essere etichettate con un colorante fluorescente o altri coloranti prima o dopo l'esperimento per misurare i fenotipi cellulari. Inoltre, sono necessari disturbi meccanici in alcuni casi per la creazione di una ferita per misurare la migrazione delle cellule al sito della ferita. Inoltre, questi metodi esistenti richiedono molto tempo, richiedono molto lavoro e misurano i risultati in un solo momento. Inoltre, questi metodi sono inclini a effettuare misurazioni imprecise a causa di una manipolazione incoerente durante la procedura sperimentale6.
A differenza dei metodi convenzionali, il sistema di analisi cellulare in tempo reale misura l'impedimento cellulare in tempo reale senza richiedere danni pre o post-staining e meccanici delle cellule. Ancora più importante, la durata di un esperimento può essere estesa in modo che gli effetti biologici possano essere determinati in modo dipendente dal tempo. L'esecuzione dell'esperimento è efficiente in termini di tempo e non richiede molto lavoro. L'analisi dei dati è relativamente semplice e accurata. Rispetto ad altri metodi, questo metodo è una delle migliori misurazioni in tempo reale per misurare la migrazione cellulare e l'invasione6,7,8,9.
Giaever e Keese sono stati i primi a descrivere la misurazione basata sull'impedanza di una popolazione cellulare sulla superficie degli elettrodi10. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale funziona sullo stesso principio. L'area di ogni pozzo di micropiastra è circa l'80% coperto da una serie di microelettrodi d'oro. Quando la superficie dell'elettrodo è occupata dalle cellule a causa dell'aderenza o della diffusione delle cellule, l'impedimento elettrico cambia. Questo impedimento viene visualizzato come indice cellulare, che è direttamente proporzionale alle cellule che coprono la superficie dell'elettrodo dopo che penetrano la membrana microporosa (la dimensione mediana dei pori di questa membrana è di 8 m)11.
Crk e CrkL sono proteine adattatori e contenenti domini SH2 e SH3 e svolgono ruoli importanti in varie funzioni cellulari, come la regolazione del citoscheletro, la trasformazione cellulare, la proliferazione, l'adesione, la transizione epiteliale-mesenchy, la migrazione, l'invasione e la metastasi mediando le interazioni proteina-proteina in molte vie di segnalazione1,12,13,14,15,16,1717. 18. Pertanto, è importante determinare le capacità migratorie e invasive dipendenti da Crk/CrkL delle cellule tumorali. L'analisi cellulare in tempo reale è stata eseguita per determinare le capacità migratorie e invasive delle cellule glioblastoma al knockdown genico di Crk e CrkL.
Questo documento di metodo descrive misurazioni dettagliate della migrazione mediata da Crk- e CrkL e l'invasione delle cellule glioblastoma umane.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:339px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:235px;">1300 Series Class II, Type A2</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CIM plates</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Crk siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>J-010503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CrkL siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>ID: 3522 and ID: 3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Culture medium used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS used to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon electroporation system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-01</td>
			<td>siRNA for non targated control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey CLx (Imaging system)</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RTCA software</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U-118MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB15</td>
			<td>Cell lines used for experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion

Il cancro nasce a causa della proliferazione incontrollata delle cellule iniziata dall'instabilità genetica, mutazioni e fattori ambientali e di altro tipo. Queste hanno acquisito anomalie in complesse reti di segnalazione molecolare a più livelli che inducono la proliferazione e la sopravvivenza delle cellule aberranti, la degradazione della matrice extracellulare e la metastasi a organi distanti. Si stima che circa il 90% dei decessi correlati al cancro sia causato dagli effetti diretti o indiretti della diffusione metastatica. Pertanto, è importante stabilire un sistema altamente affidabile e completo per caratterizzare i comportamenti delle cellule tumorali sulle manipolazioni genetiche e ambientali. Tale sistema può dare una chiara comprensione della regolazione molecolare della metastasi del cancro e l'opportunità di sviluppare con successo strategie terapeutiche stratificate e precise. Pertanto, una determinazione accurata dei comportamenti delle cellule tumorali come la migrazione e l'invasione con guadagno o perdita di funzione dei geni consente di valutare la natura aggressiva delle cellule tumorali. Il sistema di misurazione in tempo reale basato sull'impedimento cellulare consente ai ricercatori di acquisire continuamente dati durante un intero esperimento e di confrontare e quantificare istantaneamente i risultati in varie condizioni sperimentali. A differenza dei metodi convenzionali, questo metodo non richiede fissazione, colorazione ed elaborazione del campione per analizzare le celle che migrano o invadono. Questo documento sul metodo enfatizza le procedure dettagliate per la determinazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali del glioblastoma.

È stato suggerito che Crk e CrkL sono importanti per la migrazione cellulare e l'invasione in diverse linee cellulari tumorali13,17. Anche se le proteine Crk e CrkL sono strutturalmente e funzionalmente simili tra loro e svolgono funzioni sovrapposte essenziali16,19,20,21, molti studi di abbattimento genico per Crk e CrkL non hanno chiaramente affrontato se i...

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Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

Il cancro è una malattia letale a causa della sua capacità di metastasi a diversi organi. Determinare la capacità delle cellule tumorali di migrare e invadere in varie condizioni di trattamento è fondamentale per valutare le strategie terapeutiche. Questo protocollo presenta un metodo per valutare le capacità metastatiche in tempo reale di una linea cellulare del cancro del glioblastoma.

Misurazione in tempo reale dell'invasione e dell'invasione delle cellule tumorali basata sull'impedimento

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Utilizzando questo protocollo, la migrazione cellulare e l'invasione possono essere svelate in condizioni in tempo reale che consentono di determinare la cinetica cellulare in perdita o guadagno di funzione genica e farmaci. A differenza di altri metodi, non sono necessarie macchie, danni meccanici alle celle o marcatori fluorescenti. Ancora più importante, la cinetica cellulare in tempo reale può essere determinata in modo efficace.Quando la coltura della linea cellulare U-118MG raggiunge il 70-80% di confluenza, lavare le cellule con PBS prima di trattare le cellule con due millilitri dello 0,5% di tripside-EDTA. Dopo 30 secondi a 37 gradi Celsius, interrompere la reazione con 10 millilitri di mezzo di coltura fresco e trasferire le cellule staccate in un tubo conico da 15 millilitri. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimorsi il pellet in una concentrazione di sei volte 10-quinta per condizione nel volume appropriato di mezzo fresco.Trasferire sei volte 10 alla quinta colonna in un tubo di microcentrifugo per condizione e aggiungere 800 microlitri del PBS di Dulbecco a ciascun tubo. Dopo la centrifugazione, rimorsi ogni pellet in 60 microlitri di tampone di resuspensione R e sei micromolari del siRNA di interesse. Mescolare ogni tubo con maschiatura delicata prima di elettroporare 10 aliquote microliter di ogni sospensione cellulare con tre impulsi da 10 millisecondi da 1.350 volt.Dopo ogni trattamento, mettere in comune le cellule elettroporate da ogni condizione in singoli cinque aliquote millilitri di mezzo di coltura fresco. Quindi seminare le cellule in due piatti di coltura di 35 millimetri per condizione e posizionare le cellule nell'incubatore di coltura cellulare per tre giorni. Da cinque a sei ore prima dell'analisi cellulare in tempo reale, posizionare il sistema di analisi cellulare in tempo reale nell'incubatore di coltura cellulare.Per impostare un saggio di invasione, utilizzare la pipettazione inversa per posizionare 50 microlitri di DMEM integrati con 0,1 microgrammi per millilitro di gel a matrice extracellulare in ogni pozzo della camera superiore di una piastra di invasione cellulare. Immediatamente dopo la placcatura, rimuovere 30 microlitri della soluzione a matrice extracellulare da ogni pozzo e posizionare la piastra nell'incubatore di coltura cellulare per quattro ore. Per impostare un programma di misurazione dell'impedenza, sei ore prima della misurazione, sostituire il mezzo in tutte le colture cellulari elettroporate con mezzo siero basso.Nella scheda Layout del software di misurazione dell'impedenza associato selezionare pozzi quadruplicati per ogni condizione biologica. Nella scheda Pianificazione impostare un passaggio di sweep di misurazione della linea di base una sola volta con un intervallo di un minuto e impostare un secondo passaggio per misurare l'impedenza della cella nelle rispettive singole culle per l'esperimento effettivo. Un'ora prima dell'inizio della misurazione dell'impedenza cellulare, aggiungere 160 microlitri di mezzo integrati con siero bovino fettale al 10% come chemioattrattante nei pozzi della camera inferiore della piastra di invasione cellulare e migrazione.Per misurare l'invasione, assemblare la camera superiore contenente i pozzi rivestiti in gel a matrice extracellulare. Per misurare la migrazione, utilizzare pozzi non rivestiti nella camera superiore. Per entrambi i tipi di esperimento, riempire i pozzi nella camera superiore con 50 microlitri di mezzo siero basso e posizionare le camere nella culla del sistema.Fare clic sulla scheda Messaggio nel software per determinare se tutti i pozzi sono riconosciuti dall'unità di controllo. Se il messaggio viene visualizzato come previsto, la piastra nella culla è pronta per l'esperimento. Quindi posizionare le piastre completamente imballate nell'incubatore di coltura cellulare nella culla del sistema di analisi cellulare in tempo reale per un'ora per acclimatare la piastra alle condizioni di coltura cellulare.Mentre le piastre sono equilibranti, raccogliere le cellule del glioblastoma come dimostrato e rimostrare le cellule da ogni condizione a otto volte 10 alla quinta colonna per 800 microlitri a bassa concentrazione media siere. Inoltre, mettere da parte un tre volte 10 alla quinta cellule in due millilitri di mezzo di coltura per la semina in un piatto da 35 millimetri per l'analisi western a valle della macchia. Per misurare la lettura pre-migrazione prevista, al termine dell'acclimatazione fare clic sul pulsante Start della base.Una volta acquisita la misurazione di base, trasferire la migrazione e le piastre di invasione dalle rispettive culle in un armadio di biosicurezza. Pipetta inversa 100 microlitri di cellule in pozzi quadruplicati della camera superiore per ogni condizione biologica nel pozzo appropriato delle piastre di invasione cellulare e migrazione come programmato nell'unità di controllo della culla. Dopo la semina, tenere le piastre nell'armadio di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente per consentire alle cellule di depositarsi uniformemente sul fondo della piastra prima di trasferire le piastre nelle rispettive culle.Fare clic sul pulsante Start della base per iniziare a misurare l'impedenza della cella. Per visualizzare le modifiche nell'impedenza delle celle come indice di cella in modo dipendente dal tempo durante o dopo il completamento dell'esperimento, aprire la scheda Analisi dati. Per visualizzare i dati per ciascuna delle rispettive condizioni singolarmente o come medie e/o deviazioni standard, fare clic sulle caselle delle opzioni per la deviazione media e standard.Per esportare i dati dell'indice delle celle in un file di foglio di calcolo, posizionare il cursore al centro della finestra di analisi dei dati e fare clic con il pulsante destro del mouse. Nella finestra di dialogo visualizzata selezionare l'opzione copia dati in formato elenco e incollarli in un foglio di calcolo aperto. Per rilasciare l'esperimento, fare clic sul pulsante Rilascia in ogni base.L'abbattimento delle proteine dell'adattatore Crk diminuisce i livelli di proteine Crk1 e Crk2 rispettivamente dell'85% e dell'86% senza indurre livelli proteici simili a Crk. L'abbattimento di simili a Crk riduce l'espressione proteica simile alla Crk dell'85% con lievi riduzioni dei livelli proteici di Crk1 e Crk2. La combinazione di entrambi i siRNA riduce l'espressione simile a Crk1, Crk2 e Crk di oltre l'80%, mentre né Vinculin né l'espressione alfa-tubulina sono influenzate da alcuna combinazione di knockdown simile a Crk o Crk.Le cellule del glioblastoma cerebrale umano migrano lungo un gradiente in risposta ad alte concentrazioni siere che raggiungono il livello massimo di migrazione a 13 ore. Nelle celle di abbattimento Crk, sebbene la migrazione sia inizialmente ritardata, le cellule hanno continuato a migrare fino a 23 ore. L'abbattimento simile a una Crk riduce sostanzialmente la migrazione cellulare con la linea cellulare del glioblastoma che perde completamente la loro capacità migratoria a causa dell'abbattimento sia di Crk che di Crk che suggeriscono che crk e crk-like svolgono ruoli essenziali sovrapposti nella migrazione delle cellule tumorali.Tuttavia, quando l'invasione cellulare viene monitorata per diversi giorni, le cellule di abbattimento della Crk raggiungono un livello massimo simile di invasione cellulare rispetto alle cellule di glioblastoma di controllo a 60 ore con cellule simili a Crk che recuperano parzialmente la loro capacità invasiva di 90 ore e doppie cellule Crk-Crk che dimostrano una ridotta capacità di invadere dopo 40 ore. I risultati supportano chiaramente il suggerimento che l'invasione cellulare dovrebbe essere analizzata durante l'intero periodo dell'esperimento. Seminare il giusto numero di cellule ed evitare le bolle d'aria durante la registrazione della matrice extracellulare per il test di invasione e le cellule di semina sono punti chiave per il successo di questo esperimento.Seguendo una procedura simile, ma utilizzando piastre e-plates, è possibile determinare l'adesione cellulare e la cinetica di proliferazione cellulare.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

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