Name: impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion
Uploaded: 2020-04-02T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Agradecemos olivia funk por sua assistência técnica com os dados do sistema de análise celular em tempo real. Também agradecemos ao Centro de Escrita Médica do Children's Mercy Kansas City pela edição deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo Tom Keaveny Endowed Fund for Pediatric Cancer Research (to TP) e pelo Children's Mercy Hospital Midwest Cancer Alliance Partner Advisory Board (para TP).

NOTA: Todos os materiais de cultura celular precisam ser estéreis e todo o experimento deve ser realizado em um gabinete de biossegurança em condições estéreis.
1. Cultura e Eletroporação da Linha Celular de Glioblastoma U-118MG
<ol><li>Cultura A linha celular U-118MG em 5% de soro bovino fetal (FBS) contendo o DMEM (meio de cultura) de Dulbecco e manter a 37 °C em uma atmosfera úmida contendo 5% de incubadora de CO2 (condições de cultura).</li>
	<li>Us...

<ol>
	<li>Park, T., Koptyra, M., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibroblast+Growth+Requires+CT10+Regulator+of+Kinase+(Crk)+and+Crk-like+(CrkL).">Fibroblast Growth Requires CT10 Regulator of Kinase (Crk) and Crk-like (CrkL).</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).</li><li>Hanahan, D., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hallmarks+of+cancer:+the+next+generation.">Hallmarks of cancer: the next generation.</a> Cell. 144 (5), 646-674 (2011).</li><li>Mudduluru, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+Axl+receptor+tyrosine+kinase+expression+by+miR-34a+and+miR-199a/b+in+solid+cancer.">Regulation of Axl receptor tyrosine kinase expression by miR-34a and miR-199a/b in solid cancer.</a> Oncogene. 30 (25), 2888-2899 (2011).</li><li>Mudduluru, G., Vajkoczy, P., Allgayer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+zinc+finger+1+induces+migration,+invasion,+and+in+vivo+metastasis+through+Axl+gene+expression+in+solid+cancer.">Myeloid zinc finger 1 induces migration, invasion, and in vivo metastasis through Axl gene expression in solid cancer.</a> Molecular Cancer Research. 8 (2), 159-169 (2010).</li><li>Khalili, A. A., Ahmad, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Review+of+Cell+Adhesion+Studies+for+Biomedical+and+Biological+Applications.">A Review of Cell Adhesion Studies for Biomedical and Biological Applications.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16 (8), 18149-18184 (2015).</li><li>Katt, M. E., Placone, A. L., Wong, A. D., Xu, Z. S., Searson, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Tumor+Models:+Advantages,+Disadvantages,+Variables,+and+Selecting+the+Right+Platform.">In Vitro Tumor Models: Advantages, Disadvantages, Variables, and Selecting the Right Platform.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 4, 12 (2016).</li><li>Hamidi, H., Lilja, J., Ivaska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+xCELLigence+RTCA+Instrument+to+Measure+Cell+Adhesion.">Using xCELLigence RTCA Instrument to Measure Cell Adhesion.</a> Bio Protocols. 7 (24), 2646 (2017).</li><li>Scrace, S., O'Neill, E., Hammond, E. M., Pires, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+xCELLigence+system+for+real-time+analysis+of+changes+in+cellular+motility+and+adhesion+in+physiological+conditions.">Use of the xCELLigence system for real-time analysis of changes in cellular motility and adhesion in physiological conditions.</a> Methods in Molecular Biology. 1046, 295-306 (2013).</li><li>Kumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+Tyrosine+Phosphorylation+Regulates+PDGF-BB-inducible+Src+Activation+and+Breast+Tumorigenicity+and+Metastasis.">Crk Tyrosine Phosphorylation Regulates PDGF-BB-inducible Src Activation and Breast Tumorigenicity and Metastasis.</a> Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).</li><li>Giaever, I., Keese, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+fibroblast+behavior+in+tissue+culture+with+an+applied+electric+field.">Monitoring fibroblast behavior in tissue culture with an applied electric field.</a> Proceeding of the National Academy of Science U. S. A. 81 (12), 3761-3764 (1984).</li><li>Tiruppathi, C., Malik, A. B., Del Vecchio, P. J., Keese, C. R., Giaever, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+method+for+detection+of+endothelial+cell+shape+change+in+real+time:+assessment+of+endothelial+barrier+function.">Electrical method for detection of endothelial cell shape change in real time: assessment of endothelial barrier function.</a> Proceedings of the National Academy of Sci U.S.A. 89 (17), 7919-7923 (1992).</li><li>Collins, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+proteins+transduce+FGF+signaling+to+promote+lens+fiber+cell+elongation.">Crk proteins transduce FGF signaling to promote lens fiber cell elongation.</a> Elife. 7, (2018).</li><li>Fathers, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adaptor+proteins+act+as+key+signaling+integrators+for+breast+tumorigenesis.">Crk adaptor proteins act as key signaling integrators for breast tumorigenesis.</a> Breast Cancer Research. 14 (3), 74 (2012).</li><li>Koptyra, M., Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+CrkL+are+required+for+cell+transformation+by+v-fos+and+v-ras.">Crk and CrkL are required for cell transformation by v-fos and v-ras.</a> Molecular Carcinogenesis. 55 (1), 97-104 (2016).</li><li>Lamorte, L., Royal, I., Naujokas, M., Park, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+adapter+proteins+promote+an+epithelial-mesenchymal-like+transition+and+are+required+for+HGF-mediated+cell+spreading+and+breakdown+of+epithelial+adherens+junctions.">Crk adapter proteins promote an epithelial-mesenchymal-like transition and are required for HGF-mediated cell spreading and breakdown of epithelial adherens junctions.</a> Molecular Biology of the Cell. 13 (5), 1449-1461 (2002).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+roles+of+Crk+and+CrkL+in+fibroblast+structure+and+motility.">Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility.</a> Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).</li><li>Rodrigues, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CrkI+and+CrkII+function+as+key+signaling+integrators+for+migration+and+invasion+of+cancer+cells.">CrkI and CrkII function as key signaling integrators for migration and invasion of cancer cells.</a> Molecular Cancer Research. 3 (4), 183-194 (2005).</li><li>Feller, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+family+adaptors-signalling+complex+formation+and+biological+roles.">Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles.</a> Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).</li><li>Park, T. J., Boyd, K., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+and+craniofacial+defects+in+Crk-null+mice.">Cardiovascular and craniofacial defects in Crk-null mice.</a> Molecular and Cellular Biology. 26 (16), 6272-6282 (2006).</li><li>Park, T. J., Curran, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crk+and+Crk-like+play+essential+overlapping+roles+downstream+of+disabled-1+in+the+Reelin+pathway.">Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway.</a> Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).</li><li>Hallock, P. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dok-7+regulates+neuromuscular+synapse+formation+by+recruiting+Crk+and+Crk-L.">Dok-7 regulates neuromuscular synapse formation by recruiting Crk and Crk-L.</a> Genes &amp; Development. 24 (21), 2451-2461 (2010).</li></ol>

A medição em tempo real da migração e invasão de células usando o sistema de análise celular em tempo real é um processo de monitoramento simples, rápido e contínuo com múltiplas vantagens significativas sobre os métodos tradicionais que fornecem dados em um único ponto de tempo. Assim como os métodos tradicionais, as condições experimentais devem ser otimizadas para cada linha celular para o sistema de análise celular em tempo real, pois cada linha celular pode ser diferente em termos de sua adesão ao ...

O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar genótipos e fenótipos do câncer é fundamental para compreender e projetar estratégias terapêuticas eficazes. Décadas de pesquisa sobre câncer levaram ao desenvolvimento e adaptação de diferentes métodos para determinar genótipos e fenótipos do câncer. Um dos mais recentes desenvolvimentos técnicos é a medição em tempo real da migração celular e invasão baseada na impedância celular. A adesão celular a substratos e contatos celulares desempenham um papel importante na comunicação e regulação celular-célula, desenvolvimento e manutenção de tecidos. Anormalidades na adesão celular levam à perda do contato celular-celular, degradação da matriz extracelular (ECM) e ganho de capacidades migratórias e invasoras por células, que contribuem para a metástase de células cancerosas para diferentes órgãos1,2. Vários métodos estão disponíveis para determinar a migração celular (cicatrização de feridas e ensaios da câmara de Boyden) e invasão (ensaio de câmara Matrigel-Boyden)3,4,5. Esses métodos convencionais são semiquantitativos porque as células precisam ser rotuladas com um corante fluorescente ou outros corantes antes ou depois do experimento para medir fenótipos celulares. Além disso, são necessárias interrupções mecânicas em alguns casos para a criação de uma ferida para medir a migração das células para o local da ferida. Além disso, esses métodos existentes são demorados, intensivos em mão-de-obra e medem os resultados em apenas um ponto de tempo. Além disso, estes métodos são propensos a fazer medições imprecisas devido ao manuseio inconsistente durante o procedimento experimental6.
Ao contrário dos métodos convencionais, o sistema de análise celular em tempo real mede a impedância celular em tempo real sem exigir danos pré ou pós-coloração e mecânicos das células. Mais importante, a duração de um experimento pode ser estendida para que os efeitos biológicos possam ser determinados de forma dependente do tempo. Executar o experimento é eficiente em tempo e não é trabalhoso. Analisar dados é relativamente simples e preciso. Comparado a outros métodos, este método é uma das melhores medidas em tempo real para medir a migração e invasão celular6,7,8,9.
Giaever e Keese foram os primeiros a descrever a medição baseada em impedância de uma população celular na superfície dos eletrodos10. O sistema de análise celular em tempo real funciona com o mesmo princípio. A área de cada poço de microplacas é aproximadamente 80% coberta com uma matriz de microeletrodos de ouro. Quando a área da superfície do eletrodo é ocupada por células devido à adesão ou disseminação das células, a impedância elétrica muda. Esta impedância é exibida como o índice celular, que é diretamente proporcional às células que cobrem a área da superfície do eletrodo depois de penetrarem na membrana microporosa (o tamanho médio dos poros desta membrana é de 8 μm)11.
Crk e CrkL são proteínas adaptoras que contêm domínios SH2 e SH3 e desempenham papéis importantes em várias funções celulares, como regulação de citoesqueleto, transformação celular, proliferação, adesão, transição epitelial-mesenquimal, migração, invasão e metástase por mediação de interações proteína-proteína em muitas,1,12,13,14,15,16,17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 , 17 ,1717 18. Por isso, é importante determinar as capacidades migratórias e invasivas dependentes de Crk/CrkL das células cancerígenas. A análise celular em tempo real foi realizada para determinar as habilidades migratórias e invasivas das células de glioblastoma após a derrubada genética de Crk e CrkL.
Este artigo do método descreve medições detalhadas da migração mediada por Crk e CrkL e invasão de células de glioblastoma humanas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1140px;" width="1140">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:323px;">Biosafety cabinet</td>
			<td style="width:339px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:235px;">1300 Series Class II, Type A2</td>
			<td style="width:244px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CIM plates</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>5665825001</td>
			<td>Cell invasion and migration plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Crk siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>J-010503-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CrkL siRNA</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>ID: 3522 and ID: 3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>302002</td>
			<td>Culture medium used for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (DPBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21-031-CV</td>
			<td>DPBS used to wash the cells</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Hyclone</td>
			<td>SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Heracell VIOS 160i CO2 incubator</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>51030285</td>
			<td>Co2 incubator</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Matrigel</td>
			<td>BD Bioscience</td>
			<td>354234</td>
			<td>Extracellular matrix gel</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon electroporation system</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK5000</td>
			<td>Electroporation system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Neon transfection system 10 &#181;L kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MPK1025</td>
			<td>Electroporation kit</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Non-targeting siRNA</td>
			<td>Dharmacon</td>
			<td>D-001810-01</td>
			<td>siRNA for non targated control</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Odyssey CLx (Imaging system)</td>
			<td>LI-COR Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>Western blot imaging system</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">RTCA software</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td></td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Scepter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>C85360</td>
			<td>Handheld automated cell counter</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">U-118MG</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC HTB15</td>
			<td>Cell lines used for experiments</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">xCELLigence RTCA DP</td>
			<td>Cell Analysis Division of Agilent Technologies, Inc</td>
			<td>380601050</td>
			<td>Instrument used for experiment</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion

O câncer surge devido à proliferação descontrolada de células iniciada por instabilidade genética, mutações e fatores ambientais e outros fatores de estresse. Essas anormalidades adquiridas em redes de sinalização molecular complexas e multicamadas induzem a proliferação e sobrevivência de células aberrantes, degradação da matriz extracelular e metástase em órgãos distantes. Estima-se que aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer sejam causadas pelos efeitos diretos ou indiretos da disseminação metastática. Por isso, é importante estabelecer um sistema altamente confiável e abrangente para caracterizar comportamentos de células cancerígenas em manipulações genéticas e ambientais. Tal sistema pode dar uma clara compreensão da regulação molecular da metástase do câncer e da oportunidade para o desenvolvimento bem-sucedido de estratégias terapêuticas estratificadas e precisas. Assim, a determinação precisa de comportamentos de células cancerígenas como migração e invasão com ganho ou perda de função de genes permite avaliar a natureza agressiva das células cancerosas. O sistema de medição em tempo real baseado na impedância celular permite que os pesquisadores adquiram continuamente dados durante todo um experimento e comparem e quantifiquem instantaneamente os resultados em várias condições experimentais. Ao contrário dos métodos convencionais, este método não requer fixação, coloração e processamento de amostras para analisar células que migram ou invadem. Este artigo do método enfatiza procedimentos detalhados para determinação em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas de glioblastoma.

Foi sugerido que crk e CrkL são importantes para migração celular e invasão em diferentes linhas de células cancerígenas13,17. Embora as proteínas Crk e CrkL sejam estruturalmente e funcionalmente semelhantes umas às outras e joguem funções sobrepostas essenciais16,,19,,20,21, muitos estudos de knockdown genético para Crk e C...

Watch this Scientific Journal Video about Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion at JoVE.com

Impedance-based Real-time Measurement of Cancer Cell Migration and Invasion

O câncer é uma doença letal devido à sua capacidade de metástase para diferentes órgãos. Determinar a capacidade das células cancerígenas de migrare e invadir diversas condições de tratamento é crucial para avaliar estratégias terapêuticas. Este protocolo apresenta um método para avaliar as habilidades metastáticas em tempo real de uma linha de células cancerígenas do glioblastoma.

Medição em tempo real da migração e invasão de células cancerígenas

Cancer arises due to uncontrolled proliferation of cells initiated by genetic instability, mutations, and environmental and other stress factors. These ...

Usando este protocolo, a migração celular e a invasão podem ser reveladas em condições em tempo real, permitindo que a cinética celular sob perda ou ganho de função genética e drogas sejam determinadas. Ao contrário de outros métodos, não é necessário coloração, dano celular mecânico ou marcadores fluorescentes. Mais importante, a cinética celular em tempo real pode ser determinada de forma eficaz.Quando a cultura da linha celular U-118MG atingir 70 a 80% de confluência, lave as células com PBS antes de tratar as células com dois mililitros de 0,5% de trippsina-EDTA. Após 30 segundos a 37 graus Celsius, pare a reação com 10 mililitros de cultura fresca e transfira as células separadas para um tubo cônico de 15 mililitros. Após a contagem, colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em seis vezes 10 para a quinta célula por concentração de condição no volume adequado de meio fresco.Transfira seis vezes 10 para as quintas células em um tubo de microcentrífuga por condição e adicione 800 microliters de PBS de Dulbecco a cada tubo. Após a centrifugação, resuspengue cada pelota em 60 microliters de tampão de resuspensão R e seis micromolar do siRNA de interesse. Misture cada tubo com toques suaves antes de eletroporar 10 alíquotas de microliter de cada suspensão celular com três pulsos de 10 milissegundos de 1,350 volts.Após cada tratamento, acumule as células eletroporadas de cada condição em alíquotas individuais de cinco mililitros de meio de cultura fresca. Em seguida, semeou as células em dois pratos de cultura de 35 milímetros por condição e colocar as células na incubadora de cultura celular por três dias. Cinco a seis horas antes da análise celular em tempo real, coloque o sistema de análise celular em tempo real na incubadora de cultura celular.Para configurar um ensaio de invasão, use tubulação reversa para colocar 50 microliters de DMEM suplementados com 0,1 micrograma por mililitro de gel de matriz extracelular em cada poço da câmara superior de uma placa de invasão celular. Imediatamente após o revestimento, remova 30 microliters da solução de matriz extracelular de cada poço e coloque a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas. Para configurar um programa de medição de impedância, seis horas antes da medição, substitua o meio em todas as culturas de células eletroporadas por meio de soro baixo.Sob a guia Layout no software de medição de impedância associado, selecione poços quadruplicados para cada condição biológica. Na guia Agendar, defina uma etapa de varredura de medição de linha de base única com um intervalo de um minuto e defina um segundo passo para medir a impedância celular nos respectivos berços individuais para o experimento real. Uma hora antes do início da medição da impedância celular, adicione 160 microliters de médio suplementado com soro bovino 10% fetal como quimioattractant nos poços da câmara inferior da placa de invasão celular e migração.Para medir a invasão, monte a câmara superior contendo os poços revestidos de gel de matriz extracelular. Para medir a migração, use poços não revestidos na câmara superior. Para qualquer tipo de experimento, preencha os poços na câmara superior com 50 microliters de meio de soro baixo e coloque as câmaras no berço do sistema.Clique na guia Mensagem no software para determinar se todos os poços são reconhecidos pela unidade de controle. Se a mensagem for exibida como esperado, a placa no berço está pronta para o experimento. Em seguida, coloque as placas completamente embaladas na incubadora de cultura celular no berço do sistema de análise celular em tempo real por uma hora para aclimatar a placa às condições de cultura celular.Enquanto as placas estão se equilibrando, colde as células de glioblastoma como demonstrado e resuspensa as células de cada condição em oito vezes 10 para as quintas células por 800 microliters de baixa concentração média sérica. Além disso, reserve três vezes 10 para as quintas células em dois mililitros de cultura média para semeadura em um prato de 35 milímetros para análise de manchas ocidentais a jusante. Para medir a leitura pré-migração da linha de base, no final da aclimatação, clique no botão iniciar o berço.Após a aquisição da medição da linha de base, transfira a migração e as placas de invasão de seus respectivos berços para um armário de biossegurança. Pipeta reversa 100 microliters de células em poços de câmara superior quadruplicando para cada condição biológica no poço apropriado da invasão celular e placas de migração como programado na unidade de controle do berço. Após a semeadura, mantenha as placas no armário de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que as células se acomodem uniformemente no fundo da placa antes de transferir as placas para seus respectivos berços.Clique no botão iniciar o berço para começar a medir a impedância da célula. Para visualizar as alterações na impedância celular como o índice celular de forma dependente do tempo durante ou após a conclusão do experimento, abra a guia Análise de Dados. Para visualizar os dados de cada uma das respectivas condições individualmente ou como médias e/ou desvios padrão, clique nas caixas de opção para desvio médio e padrão.Para exportar os dados do índice celular para um arquivo de planilha, coloque o cursor no meio da janela de análise de dados e clique com o botão direito do mouse. Na caixa de diálogo que aparece, selecione os dados de cópia na opção de formato de lista e cole os dados em uma planilha aberta. Para liberar o experimento, clique no botão Soltar em cada berço.O knockdown de proteína do adaptador crk diminui os níveis de proteína crk1 e crk2 em 85% e 86%, respectivamente, sem induzir níveis de proteína semelhantes a Crk. O knockdown do tipo Crk reduz a expressão proteica semelhante ao Crk em 85% com pequenas reduções nos níveis de proteína Crk1 e Crk2. A combinação de ambas as siRNAs reduz a expressão crk1, Crk2 e crk em mais de 80%, enquanto nem a expressão vinculina nem alfa-tubulin é afetada por qualquer combinação de knockdown semelhante a Crk ou Crk.As células de glioblastoma cerebral humano migram ao longo de um gradiente em resposta a altas concentrações de soro atingindo o nível máximo de migração em 13 horas. Nas células de knockdown de Crk, embora a migração seja inicialmente adiada, as células continuaram a migrar até 23 horas. O knockdown semelhante a CRK reduz substancialmente a migração celular com a linha celular glioblastoma perdendo completamente sua capacidade migratória após o knockdown tanto do Crk quanto do Crk sugerindo que crk e crk-like desempenham papéis essenciais sobrepostos na migração de células cancerosas.No entanto, quando a invasão celular é monitorada ao longo de vários dias, as células de knockdown crk atingem um nível máximo semelhante de invasão celular em comparação com as células de glioblastoma de controle em 60 horas com células semelhantes a Crk recuperando parcialmente sua capacidade invasiva em 90 horas e células crk-crk duplas demonstrando uma capacidade reduzida de invadir após 40 horas. Os resultados apoiam claramente a sugestão de que a invasão celular deve ser analisada durante todo o período do experimento. Semear o número certo de células e evitar as bolhas de ar ao registrar a matriz extracelular para ensaios de invasão e células de semeadura são pontos-chave para o sucesso deste experimento.Seguindo procedimento semelhante, mas usando placas e, a adesão celular e cinética de proliferação celular podem ser determinadas.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Model for Perineural Invasion in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Um Modelo para Perineural Invasion em cabeça e pescoço carcinoma espinocelular

Perineural invasion (PNI) is found in approximately 40% of head and neck squamous cell carcinomas (HNSCC). Despite multimodal treatment with surgery, ...

Pesquisa do câncer

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

Avaliação do processo de migração e invasão celular: uma comparação da risque baseado no microscópio a ferida do ensaio e o ensaio de câmara Boyden

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Using the Dot Assay to Analyze Migration of Cell Sheets

Usando o ensaio de ponto para analisar a migração de células de folhas

Although complex organisms appear static, their tissues are under a continuous turnover. As cells age, die, and are replaced by new cells, cells move ...

Serum and Plasma Copy Number Detection Using Real-time PCR

Soro e Plasma cópia número deteção usando PCR em tempo real

Serum and plasma cell free DNA (cfDNA) has been shown as an informative, non-invasive source of biomarkers for cancer diagnosis, prognosis, monitoring, ...

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Se movendo para cima: Um simples e flexível em Vitro invasão tridimensional protocolo do ensaio

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Imagem latente da viver-pilha ensaios de migração de células-tronco do estudo Glioblastoma cerebral Tumor e invasão

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

3-D Cell Culture System for Studying Invasion and Evaluating Therapeutics in Bladder Cancer

Sistema de cultura de células 3D para estudar a invasão e avaliação terapêutica em câncer de bexiga

Bladder cancer is a significant health problem. It is estimated that more than 16,000 people will die this year in the United States from bladder cancer. ...

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Real Time Detection of In Vitro Tumor Cell Apoptosis Induced by CD8+ T Cells to Study Immune Suppressive Functions of Tumor-infiltrating Myeloid Cells

Detecção de tempo real em Vitro Tumor celular apoptose induzida por CD8+ T células para estudar as funções imunológicas supressora de Tumor infiltrando células mieloides

Potentiation of the tumor-killing ability of CD8+ T cells in tumors, along with their efficient tumor infiltration, is a key element of successful ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Um fluxo de trabalho simples migração/invasão usando um automatizado Imager viver-pilha

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

Real-Time Monitoring of Human Glioma Cell Migration on Dorsal Root Ganglion Axon-Oligodendrocyte Co-Cultures

Monitoramento em tempo real da migração humana de células glioma em co-culturas de raiz dorsal Ganglion Axon-Oligodendrocyte

Glioblastoma is one of the most aggressive human cancers due to extensive cellular heterogeneity and the migration properties of hGCs. In order to better ...