Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Diese Arbeit wurde unterstützt von 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Project 3 von P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) und R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye wurde von American Heart Association Pre-Doctoral Fellowship 16PRE30300002 und 5T32AI007496-20 unterstützt. Wir danken Joanne Lannigan, Mike Solga und Claude Chew von der University of Virginia Flow Cytometry Core für ihre ausgezeichnete technische Unterstützung.

Alle Tierprotokolle wurden vom Animal Care and Use Committee der University of Virginia genehmigt.
1. Magnetische Trennung und Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen
<ol><li>Euthanisieren Sie eine 12-14 Wochen alte, männliche, CD45.1+ApoE-/- Maus mit CO2.</li>
	<li>Machen Sie einen oberflächlichen Schnitt in den Bauch mit geraden chirurgischen Schere und schälen Sie rücken Die Haut mit gebogenen Schere, um die Peritonealwand auszusetzen. Unterspülen Si...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

Die hier angebotene Methode ermöglicht eine stabile und relativ effiziente primäre B-1a-Zellgenabgabe, in vivo-Adoptivübertragung sowie die Identifizierung und Lokalisierung der injizierten Zellen. Zellen konnten 17 Wochen nach der Zellübertragung nachgewiesen und eine erhöhte CXCR4-Expression beibehalten werden. Retrovirus-vermittelte Abgabe ergab 30-40% Transduktionseffizienz der primären murinen B-1a-Zellen mit minimalen Auswirkungen auf die Zelllebensfähigkeit in unseren Händen (Abbildung...

Jüngste Studien haben eine beträchtliche Immunzelle, insbesondere B-Zelle, phänotypische und funktionelle Heterogenität in Abhängigkeit von der Zelllokalisierung1,2,3,4,5gezeigt. B-1a-Zellen sind eine solche Population mit heterogener Fähigkeit, schützende IgM-Antikörper zu produzieren; Knochenmark B-1a-Zellen sezernieren IgM konstitutiv und tragen signifikant zu Plasma-IgM-Titers6bei, während peritoneale B-1a-Zellen bei Homöostase eine niedrige IgM-Sekretion haben und stattdessen durch angeborenen mautähnlichen Rezeptor (TLR) oder zytokinvermittelte Signalisierung aktiviert werden können, um sich schnell zu vermehren, zu migrieren und igM7,8,9,10zu sezernieren. B-1a-Zell-IgM-Antikörper erkennen oxidationsspezifische Epitope (OSE), die auf Krankheitserregern, apoptotischen Zellen und oxidierter LDL vorhanden sind, und IgM-Bindung an OSE kann entzündliche nachgeschaltete Signalisierung bei Krankheiten wie Arteriosklerose verhindern11. Daher können Strategien zur Erhöhung der IgM-Produktion durch erhöhung der peritonealen B-1a-Zellmigration zu Orten wie dem Knochenmark therapeutisch nützlich sein. Jedoch, Es ist wichtig, dass solche Strategien gezielt und zellspezifisch sind, da Off-Target-Effekte die Immunfunktion oder Gesundheit negativ beeinflussen können.
Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten und langfristigen Überexpression von CXCR4 in primären murinen B-1a-Zellen und nachfolgender Adoptivübertragung zur Visualisierung der Zellmigration und der funktionellen IgM-Antikörperproduktion (Abbildung 1). Die genetische Manipulation von primären B-Zellen wird durch niedrige Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Transfektion transformierter Zelllinien eingeschränkt. Da transformierte Zelllinien jedoch erheblich von den Primärzellen12,13abweichen können, ist es wahrscheinlich, dass die Verwendung von Primärzellen Ergebnisse liefert, die sich stärker an der normalen Physiologie ausrichten. Mehrere Techniken wurden für den Gentransfer in primären murinen B-Zellen beschrieben, einschließlich retroviraler Transduktion, adenoviraler Transduktion, Lipofektion oder elektroporationsbasierter Transfektion, die unterschiedliche Effizienz, Vergänglichkeit und Auswirkungen auf die Zellgesundheit haben13,14,15. Die folgende Methode nutzte die retrovirale Transduktion, da sie eine ausreichende Genübertragungseffizienz von >30 % bei minimaler Auswirkung auf die Zelllebensfähigkeit ergab. Das CXCR4-exezierende Retrovirus wurde mit dem zuvor beschriebenen retroviralen Konstrukt murinen Stammzellvirus-internen ribosomalen Eintrag site-greenescent Protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, in das das Maus-CXCR4-Gen 4 subkloniert4wurde. MigR1 (Control(Ctl)-GFP) und CXCR4-GFP retrovirale Partikel wurden mit Calciumphosphattransfektion erzeugt, wie in den zuvor veröffentlichten Protokollen4,14beschrieben.
Erfolgreich transduzierte B-1a-Zellen wurden dann intravenös in lymphozyten-defizientenRag1-/- Mäusen übertragen. Sowohl Spender- als auch Empfängermäuse enthielten zusätzlich Knockout des Apolipoproteins E (ApoE)-Gens, was zu einer erhöhten OSE-Akkumulation und Arteriosklerose führt und somit ein Modell für die In-vivo-B-1-Zellaktivierung und IgM-Produktion darstellt. Darüber hinaus unterschieden sich Spender- und Empfängermäuse in CD45-Allotyp; Spender-B-1-Zellen stammten von CD45.1+ ApoE-/- Mäusen und wurden in Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- Empfänger übertragen. Dies ermöglichte die Differenzierung von Spender-CD45.1 von Empfänger-CD45.2-B-Zellen nach der Übertragung, ohne dass b-Zellmarker während der Durchflusszytometrieanalyse zusätzlich gefärbt werden mussten. Die hier bereitgestellten Ergebnisse zeigen, dass die gezielte CXCR4-Überexpression auf B-1a-Zellen mit einer erhöhten Fähigkeit von B-1a-Zellen zur Migration in das Knochenmark assoziiert, was mit erhöhtem Plasma-Anti-OSE-IgM assoziiert. Darüber hinaus bieten wir ein Verfahren zur Anreicherung von peritonealen B-1-Zellen durch negative Selektion an und demonstrieren die Anforderung der B-1-Zellaktivierung für eine effiziente Transduktion. Diese Methode kann für andere retrovirale Konstrukte angepasst werden, um die Wirkung der Proteinüberexpression auf die B-1a-Zellmigration, den Phänotyp oder die Funktion zu untersuchen. Darüber hinaus könnte die Verwendung von CD45.1 im Vergleich zu CD45.2-Allotyp-Unterscheidung theoretisch den Transfer in andere immunausreichende murine Modelle ermöglichen, die endogene B-Zellen enthalten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

Da die Zellfunktion von Nischen-spezifischen Faktoren in der zellulären Mikroumgebung beeinflusst wird, können Methoden zur Sezieren von Zelllokalisierung und Migration weitere Einblicke in die Zellfunktion liefern. B-1a-Zellen sind eine einzigartige B-Zell-Untergruppe in Mäusen, die schützende natürliche IgM-Antikörper gegen oxidationsspezifische Epitope produzieren, die während Gesundheit und Krankheit entstehen. Die B-1a-Zell-IgM-Produktion unterscheidet sich je nach B-1a-Zellposition, und daher wird es aus therapeutischer Sicht nützlich, die B-1a-Lokalisierung auf Nischen auszurichten, die eine hohe Antikörperproduktion unterstützen. Hier beschreiben wir eine Methode zur gezielten B-1a-Zellmigration in das Knochenmark durch retroviral-vermittelte Überexpression des C-X-C-Motiv-Chemokinrezeptors 4 (CXCR4). Die Geninduktion in primären murinen B-Zellen kann eine Herausforderung darstellen und führt je nach Technik zu niedrigen Transfektionseffizienzen von 10-20%. Hier zeigen wir, dass die retrovirale Transduktion von primären murinen B-1a-Zellen zu einer Transduktionseffizienz von 30-40% führt. Diese Methode nutzt die Adoptivzellübertragung von transduzierten B-1a-Zellen in B-Zell-mangelhafte Empfängermäuse, so dass spender-B-1a-Zellmigration und -lokalisierung visualisiert werden können. Dieses Protokoll kann für andere retrovirale Konstrukte modifiziert werden und kann in verschiedenen funktionellen Assays nach der Adoption verwendet werden, einschließlich der Analyse des Phänotyps und der Funktion von Spenderzellen oder Wirtszellen oder der Analyse von löslichen Faktoren, die nach der B-1a-Zellübertragung abgesondert werden. Die Verwendung von unterschiedlichen Spender- und Empfängermäusen, die nach CD45.1- und CD45.2-Allotyp unterschieden werden, und das Vorhandensein eines GFP-Reporters innerhalb des retroviralen Plasmids könnten auch den Nachweis von Spenderzellen in anderen, immunreichen Mausmodellen ermöglichen, die endogene B-Zellpopulationen enthalten.

Eine Übersicht über das Protokoll finden Sie in Abbildung 1. Abbildung 2 zeigt die Anreicherung von peritonealen B-1a-Zellen nach magnetischer Erschöpfung anderer Peritonealzelltypen. Lebende Singletzellen in der Post-Depletion-Fraktion haben einen größeren Anteil an CD19+ B-Zellen im Vergleich zu F4/80+ Makrophagen, fehlen CD5hi CD19- T-Zellen und enthalten eine erhöhte Frequenz von CD19+ CD5-Mittel-B-1a-Zellen ...

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Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Hier beschreiben wir eine Methode zur retroviralen Überexpression und Adoptivübertragung von murinen B-1a-Zellen zur Untersuchung der in vivo B-1a-Zellmigration und -lokalisierung. Dieses Protokoll kann für verschiedene nachgelagerte funktionelle Assays erweitert werden, einschließlich der Quantifizierung der Spender-B-1a-Zelllokalisierung oder der Analyse von spenderzellabgeleiteten sekretierten Faktoren nach der Übertragung.

Retrovirale Überexpression von CXCR4 auf murine B-1a-Zellen und Adoptivtransfer für gezielte B-1a-Zellmigration zur Knochenmark- und IgM-Produktion

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Dieses Protokoll kann bewerten, wie sich die gezielte Genabgabe auf die B-1a-Zelllokalisierung und -funktion auswirkt, und kann ein nützlicher Beweis für den Konzeptansatz für die Untersuchung von Gentherapiepotenzialen in vivo sein. Diese Methode bietet eine stabile und relativ effiziente Genabgabe an primäre B-1a-Zellen und ermöglicht die Identifizierung des Spenderzellphäphänotyps und der Funktion nach der Adoption. Diese Methode kann verwendet werden, um verschiedene Spender- und Wirtszellprozesse in vivo zu untersuchen, einschließlich Zellüberleben, Proliferation und Funktion, und kann auf andere Adoptivtransfersysteme angewendet werden.Peritoneale Flüssigkeitsernte kann schwierig sein. Achten Sie darauf, die Zellen gründlich zu lösen, um die Erholung zu maximieren und zu vermeiden, dass der Darm, der Ihre Peritonealzellpopulation kontaminieren kann, durchsetzt wird. Für die peritoneale B-1-Zellsammlung verwenden Sie eine gerade chirurgische Schere, um einen oberflächlichen Schnitt im Bauch einer 12 bis 14 Wochen alten, männlichen, CD45.1+apolipoprotein E Knockout-Maus zu machen, und verwenden Sie eine gekrümmte Schere, um die Haut zurückzuschälen, um die Peritonealwand freizulegen.Mit einer 10-Milliliter-Spritze mit einer 25-Meter-Nadel, spülen Sie die Peritonealhöhle mit 10 Milliliter 37 Grad Celsius RPMI-1640 Medium. Und greifen Sie die Basis des Schwanzes, damit die Maus 15 bis 20 Sekunden lang gründlich von Seite zu Seite geschüttelt werden kann. Nach dem Schütteln, verwenden Sie die Spritze, um die Flüssigkeit von der unteren rechten Seite des Peritoneums knapp über dem Niveau der Hüfte, in der Nähe des Darms zu aspirieren, wobei darauf zu achten ist, dass die epidydimalen Fettdepots und die darunter liegenden Organe nicht gestört werden.Nachdem Sie sechs bis sieben Milliliter Lavage gesammelt haben, geben Sie die Flüssigkeit in eine 50 Milliliter konische Röhre auf Eis. Verwenden Sie Zangen, um die Peritonealwand über dem Zwerchfell zu erfassen, um eine vertikale Höhe des Tieres zu ermöglichen, so dass die verbleibende Flüssigkeit am Boden der Peritonealhöhle verbleibt. Verwenden Sie eine chirurgische Schere, um einen kleinen Schnitt in der Peritonealwand über der Leber zu machen, ohne die Leber selbst zu schneiden.Und verwenden Sie eine Glaspipette und Glühbirne, um die verbleibende peritoneale Flüssigkeit zu sammeln. Wenn die gesamte Flüssigkeit gesammelt wurde, aliquot die peritonealen Auswaschzellen von allen Mäusen und addieren bis zu einem mal 10 zu den achten Zellen pro Rohrkonzentration in 50 Milliliter Röhren auf Eis. Und sedimentieren Sie die Zellen durch Zentrifugation.Setzen Sie jedes Pellet in einem Milliliter Anti-CD16/CD32-Antikörper aus, der im Verhältnis eins bis 50 im Assaypuffer für eine 10-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius verdünnt wird. Am Ende der Inkubation, fügen Sie ein gleiches Volumen der biotinylierten Antikörper-Master-Mix zu jedem Rohr für eine 20-minütige Inkubation bei vier Grad Celsius gefolgt von einer Wäsche in fünf Milliliter Assaypuffer pro Tube. Setzen Sie die Pellets mit dem entsprechenden Volumen an Antibiotin-Mikroperlen und der entsprechenden Inkubationsdauer gemäß der Zellkonzentration und der Empfehlung des Herstellers auf, gefolgt von einer Fünf-Milliliter-Assay-Pufferwäsche pro Tube.Setzen Sie jedes Pellet in 500 Mikroliter Assaypuffer wieder auf und grundieren Sie die entsprechende Anzahl magnetischer Selektionsspalten mit drei Millilitern Assaypuffer pro Spalte. Übertragen Sie die Zellen auf grundierte Säulen, die das Eluent mit angereicherten B-1-Zellen in einem 15 Milliliter konischen Rohr auf Eis sammeln. Waschen Sie dann jede magnetische Selektionssäule mit zusätzlichem Assaypuffer, bis das gesamte gesammelte Volumen 10 Milliliter beträgt, und setzen Sie die postgereinigte Zellfraktion um ein mal 10 bis die sechste Zelle pro Milliliter Konzentration im B-Zellkulturmedium wieder auf.Um die peritonealen B-1-Zellen zu stimulieren, legen Sie mindestens ein mal 10 zu den siebten Zellen für eine nicht transduzierte Kontrolle beiseite und teilen Sie die verbleibenden Zellen in zwei gleiche Volumina für die Transduktion auf. Verdünnen Sie die Zellen auf 1,5 mal 10 bis zu den fünften Zellen pro 150 Mikroliter mittlerer Konzentration und fügen Sie 150 Mikroliter Zellen zu Denbrunnen einer 96-Well-Rundbodenplatte für transduktionsbedingte Bedingungen hinzu. Dann fügen Sie 100 Nanomolar TLR9 Agonist zu jedem Brunnen und legen Sie die Platten in der Zellkultur Inkubator für 16 bis 18 Stunden.Zur retroviralen Transduktion der peritonealen B-Zellen tauen die retroviralen Partikelbestände an Calciumphosphattransfektion auf Eis auf und tragen sofort die Kontrolle und den Chemokinrezeptor retrovirale Überräube in jedem Brunnen der geeigneten Platte und eine Vielzahl von Infektionen von 20 bis eins in Gegenwart von 8 Mikrogramm pro Milliliter Polybren und frischem Beta-Mercaptoethanol bei 55 Mikromollar-Endkonzentration hinzu. Wenn alle Viren hinzugefügt wurden, spritzen Sie die Zellen durch Zentrifugation und legen Sie die Platten drei Stunden lang in den Zellkultur-Inkubator. Am Ende der Inkubation ernten Sie die Zellen zum Replatieren in frischem B-Zellmedium und einer nächtlichen Inkubation.Nach der magnetischen Erschöpfung anderer Peritonealzelltypen haben lebende Einzelzellen in der Post-Depletion-Fraktion einen größeren Anteil an CD19+B-Zellen im Vergleich zu F4/80+Makrophagen und einem Mangel an CD5hi CD19-T-Zellen, und sie enthalten eine erhöhte Frequenz von CD19+CD5-Medium-B-1a-Zellen im Vergleich zur Vorerschöpfungsfraktion. Und die Erhöhung der Häufigkeit der erfolgreich transduced GFP+B-2, B-1, B-1a, und B-1b Zellteilmengen ist direkt mit der Zunahme der Virusvielfalt der Infektion korreliert. Und die Transduktionseffizienz kann mit 96 gut runden Bodenplatten im Vergleich zur Verwendung von 24-Well- oder 6-Well-Platten weiter gesteigert werden.Die CXCR4-GFP-Retrovirus-Transduktion kann eine erfolgreiche B-1-Zell-CXCR4-Überexpression auslösen und die In-vitro-Migration in Richtung CXCL12 erhöhen, ohne dass dies erhebliche Auswirkungen auf die B-Zell-Lebensfähigkeit hat. Darüber hinaus erhielten adoptiert übertragene CD45.1+Spenderzellen ihre CXCR4-Überexpression nach ihrer Genesung aus dem Knochenmark und Milz von CD45.2-Empfängermäusen 17 Wochen nach der Zellübertragung. Bemerkenswert ist, dass ein positiver Zusammenhang zwischen der CXCR4-Expression und der Spenderzelllokalisierung zum Knochenmark, aber nicht milden festgestellt wurde.Mit einem positiven Zusammenhang zwischen Spenderzellzahlen im Knochenmark und der Plasmamenge von Anti-MDA-Low Density Lipoprotein IgM. Viele zusätzliche Techniken können verwendet werden, um Fragen zu beantworten, wie, was sind die Auswirkungen der gezielten Genabgabe auf die Krankheitsentwicklung oder welcher Spender abgesonderte Faktoren beeinflussen wirphysiologie.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinanten retroviralen Produktion und Infektion von B-Zellen

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Erzeugung und Kennzeichnung von Murine Knochenmark gewonnenen dendritischen Zellen mit Qdot Nanokristalle für Tracking-Studien

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolierung, Reinigung und Kennzeichnung von Knochenmark der Maus Neutrophile für funktionelle Studien und Experimente adoptiven Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen-Produktion

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Die Beurteilung der Entwicklung der Murine Plasmazytoide dendritischen Zellen in Peyer-Patches mit Adoptiv Übertragung von hämatopoetischen Vorläuferzellen

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolierung und intravenöse Injektion von Maus-Knochenmark stammenden Monozyten

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Die Induktion von Murine Darmentzündungen durch adoptiven Transfer von Effektor CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hoch</sup&gt; T-Zellen in immundefizienten Mäusen

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retrovirale Transduktion von Knochenmark-Progenitorzellen zu generieren T-Zell-Rezeptor Retrogenic Mäuse

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Fensterkammer Modell für<em&gt; In Vivo</em&gt; Zelltracking im Knochenmark der Maus

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Überexpression und Reinigung des Menschen<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase in<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...