Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

עבודה זו נתמכת על ידי 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, פרויקט 3 של P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. מקנמרה), ו R01GM100776 (ט בנדר). A. Upadhye נתמך על ידי איגוד הלב האמריקני האגודה טרום דוקטורט 16PRE30300002 ו 5T32AI007496-20. אנו מודים לג'ואן לאנניגן, מייק סולגה, וקלוד ללעוס מאוניברסיטת וירג פלו ליבת הליבה על הסיוע הטכני המעולה שלהם.

כל פרוטוקולי החיות אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים והשתמש באוניברסיטת וירג.
1. הפרדה מגנטית והעשרה של תאים בעלי 1 הצפק
<ol><li>המתת חסד 12-14-שבוע בן, זכר, CD 45.1+apoe-/- עכבר באמצעות CO2.</li>
	<li>לעשות חתך שטחי בבטן באמצעות מספריים כירורגי ישר לקלף את העור האחורי באמ?...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

השיטה המסופקת כאן מאפשרת יציבה ויעילה באופן יחסי B-1a משלוח גנטי התא, בהעברה המאמצת vivo, זיהוי ולוקליזציה של תאים מוזרק. תאים זוהו 17 שבועות העברה לאחר התאים ונשמר ביטוי CXCR4 גדל. וירוס בתיווך המסירה הניבה 30-40% יעילות התמרה של הראשונית murine B-1a תאים עם השפעה מינימלית על הכדאיות התא בידינו (<strong class="x...

מחקרים שנעשו לאחרונה הפגינו תא החיסון ניכר, ובמיוחד B תא, פנוטיic ו טרוגניות פונקציונלי בהתאם לוקליזציה של התא1,2,3,4,5. B-1a תאים הם אחד כזה אוכלוסיה עם יכולת הטרוגנית לייצר נוגדנים IgM מגן; מח עצם B-1a תאים להפריש באופן קונסטיטוטיבי ולתרום בצורה משמעותית את מגדל פלזמה מטרים6, בעוד בתאי הצפק B-1a יש ברמה נמוכה igm הפרשה ב הומאוסטזיס ובמקום זאת ניתן להפעיל דרך קולטן מולדים שיחת כמו (tlr) או cytokine בתיווך איתות כדי להתרבות במהירות, להעביר, ו להפריש igm7,8,9,10. B-1a בתאי IgM לזהות אפיסקופים ספציפיים לחמצון (OSE) הנמצאים על פתוגנים, תאים אפוטוטיים, ו-LDL תחמוצת, ו-IgM קשירה כדי OSE יכול למנוע דלקת במורד הזרם מחלות כמו טרשת עורקים11. לכן, אסטרטגיות כדי להגדיל את ייצור IgM באמצעות הגדלת הצפק B-1a תא הגירה לאתרים כמו מח העצם עשוי להיות שימושי מבחינה רפואית. עם זאת, חשוב עבור אסטרטגיות כאלה כדי להיות ממוקד ותא סוג ספציפי, כמו תופעות מחוץ ליעד עלול להשפיע באופן שלילי על תפקוד המערכת החיסונית או בריאות.
כאן אנו מתארים שיטה ממוקדת לטווח ארוך הביטוי של CXCR4 ב-murine הראשי B-1a תאים העברה המאמצת הבאים כדי להמחיש את הגירה התא וליצור נוגדנים IgM פונקציונלי (איור 1). מניפולציה גנטית של תאי B ראשי מוגבל על ידי יעילות הזיהום נמוך לעומת העברה של קווי תאים שהפכו שינוי. עם זאת, כאשר קווי תאים שעברו שינוי יכולים לסטות באופן משמעותי מתאים ראשוניים12,13, השימוש בתאים ראשיים עשוי לספק תוצאות הדוקות יותר לפיזיולוגיה נורמלית. טכניקות מספר תוארו עבור העברת גנים בתאי murine הראשי, כולל התמרה ויראלית, התמרה ויראלית, ליפוגן, או אלקטרופורציה המבוססת על מעבר, אשר יש רמות שונות של יעילות, ארעיות, והשפעה על בריאות התא13,14,15. השיטה הבאה מנוצל התמרה ויראלי כפי שהוא הניב יעילות העברת גנים נאותה של > 30% בעוד מינימלית להשפיע על הכדאיות התא. וירוס CXCR4-הביע הופק באמצעות המבנה הקודם שתוארו כretroviral יעיל לבנות תא גזע מורטין הנגיף-פנימי הזנה ריבוזומאתר-חלבון פלורסנט ירוק (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, שבו העכבר CXCR4 הגן היה משוכפל משנה4. MigR1 (בקרה (Ctl)-gfp) ו-CXCR4-gfp החלקיקים נוצרו באמצעות הזיהום סידן פוספט כפי שמתואר פרוטוקולים שפורסמו בעבר4,14.
לאחר מכן הותמרה בהצלחה בתאים B-1a והועברו באופן מידי אל לימפוציטים Rag1-/- עכברים. גם עכברים התורם וגם הנמען הכילו נוקאאוט של הגנים אפוליפופרוטאין E (apoe), אשר תוצאות הצטברות OSE מוגברת טרשת עורקים, ובכך לספק מודל עבור vivo B-1 תא הפעלה ו igm הייצור. יתר על כן, עכברים תורמים ונמענים שונים ב-CD45 allotype; התאים התורמים B-1 הגיעו מתקליטור 45.1 + ApoE-/- עכברים והועברו לתוך Rag1- Cd 45.2 + apoe-/- הנמענים. זה מותר הבידול של 45.1 CD התורם מתקליטור הנמען 45.2 B תאים שלאחר ההעברה ללא צורך להכתים בנוסף עבור סמנים תא B במהלך הניתוח cy, try הזרימה. התוצאות המסופקות כאן להדגים כי ממוקדות CXCR4 overexpression על B-1a תאים מקורביו עם יכולת מוגברת של תאים B-1a לעבור את מח העצם, אשר מקורביו עם פלזמה מוגברת anti-OSE IgM. אנו מספקים בנוסף שיטה להעשרת התאים הפריפריאלית ב -1 באמצעות בחירה שלילית ולהדגים את הדרישה של הפעלת תא B-1 לצורך התמרה יעילה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת עבור מבנים retroviral יעיל אחרים כדי ללמוד את ההשפעה של ביטוי יתר חלבון על B-1a תא הגירה, פנוטיפ, או פונקציה. יתר על כן, השימוש CD 45.1 לעומת הבחנה CD 45.2 allotype יכול תיאורטית לאפשר העברה לתוך דגמי murine אחרים מספיק החיסונית המכילים תאים אנדוגניים B.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

כאשר פונקציית התא מושפעת מגורמים ספציפיים לנישה בסביבת מיקרו-הסביבה הסלולרית, שיטות לנתח את הלוקליזציה של תאים והגירה יכולות לספק תובנה נוספת בנוגע לתפקוד התא. התאים b-1a הם קבוצת משנה ייחודית של תא B בעכברים לייצר נוגדנים IgM טבעי המגן נגד האפיסקופים ספציפיים חמצון הנובעים במהלך בריאות ומחלות. B-1a הייצור של תא IgM משתנה בהתאם למיקום התא B-1a, ולכן הוא הופך להיות שימושי מבחינה טיפולית כדי למקד את B-1a לוקליזציה לתמיכה נישות של ייצור נוגדנים גבוהה. כאן אנו מתארים שיטה למקד את ה-B-1a תא הגירה מח העצם על ידי retroviral-ביטוי overexpression של C-X-C מוטיב קולטן כימוקין 4 (CXCR4). האינדוקציה ג'ין בתאי murine הראשי B יכול להיות מאתגר ובדרך כלל לתשואות יעילות החצייה נמוכה של 10-20% בהתאם לטכניקה. כאן אנו מדגימים כי התמרה ויראלי של התאים הראשוניים B-1a התוצאות 30-40% יעילות התמרה. שיטה זו מנצלת העברת תאים המאמצת של תאים B-1a לתוך עכבר לקוי של הנמען תא כדי להפוך את העברת התאים של התורם B-1a ולוקליזציה ניתן לדמיין. פרוטוקול זה יכול להיות שונה עבור מבנים retroviral יעיל אחרים ניתן להשתמש בתוך מגוון פונקציונלי שלאחר העברה המאמצת, כולל ניתוח של תא התורם או המחשב המארח של תאים ותפקוד, או ניתוח של גורמים מסיסים מופרש post B-1a העברת תאים. השימוש של תורמים ועכברים הנמען ברורים הבדיל על-ידי CD 45.1 ו-CD 45.2 allotype ואת הנוכחות של עיתונאי GFP בתוך הפלסטלינה הretroviral יעיל אמצע יכול גם לאפשר זיהוי של תאים תורמים אחרים, החיסונית מספיק מודלים של העכבר המכיל את אוכלוסיית התאים האנדוגניים B.

מבט כולל על הפרוטוקול מוענק באיור 1. איור 2 מציג העשרת תאים בעלי הצפק B-1a לאחר דלדול מגנטי של סוגים אחרים של תאי הצפק. לחיות סינגתן תאים בשבר פוסט-דלדול יש שיעור גדול יותר שלCD19 + B תאים לעומת F4/80 מקרופאגים, חסרים CD5hi CD19- T תאים, ולהכיל תדירות מוגב?...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

פרוטוקול זה יכול להעריך כיצד אספקת גנים ממוקדת משפיעה על לוקליזציה ותפקוד של תאי B-1a והוא יכול להיות גישה שימושית של הוכחת מושג לבחינת פוטנציאל טיפולי גנים ב- vivo. שיטה זו מספקת אספקת גנים יציבה ויעילה יחסית לתאי B-1a ראשוניים ומאפשרת זיהוי של פנוטיפ תא תורם והעברה לאחר אימוץ. שיטה זו יכולה לשמש לבחינת תהליכי תאים מגוונים של תורמים ומארחים ב-vivo, כולל הישרדות תאים, התפשטות ותפקוד, וונית ליישם אותה על מערכות העברה מאמצות אחרות.קציר נוזלים צפי יכול להיות מסובך. הקפד לנתק ביסודיות את התאים כדי למקסם את ההתאוששות כדי למנוע ניקור המעיים אשר יכול לזהם את אוכלוסיית התאים הצפק שלך. עבור אוסף תאים B-1 הצפק, להשתמש במספריים כירורגיים ישר לעשות חתך שטחי בבטן של 12 עד 14 שבועות, זכר, CD45.1 + אפוליפופרוטאין E נוקאאוט עכבר, ולהשתמש מספריים מעוגלים לקלף בחזרה את העור כדי לחשוף את הקיר הצפק.באמצעות מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 25 מד, לשטוף את חלל צפדית עם 10 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI-1640 בינוני. ולתפוס את הבסיס של הזנב כדי לאפשר לעכבר להיות מזועזע ביסודיות מצד לצד במשך 15 עד 20 שניות. לאחר רעידות, להשתמש במזרק כדי לשאוף את הנוזל מהצד הימני התחתון של הצפירה ממש מעל רמת הירך, ליד המעיים, דואג כדי למנוע שיבוש מחסני שומן אפידידימלי ואיברים הבסיסית.לאחר איסוף שישה עד שבעה מיליליטר של lavage, לחלק את הנוזל לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר על קרח. השתמש מטלפים כדי לתפוס את הקיר צפק מעל הסרעפת כדי לאפשר העלאה אנכית של החיה, כך שכל הנוזל הנותר נשאר בתחתית חלל צפק. השתמש מספריים כירורגיים לעשות חתך קטן בקיר צפי מעל הכבד מבלי לחתוך את הכבד עצמו.ולהשתמש צינור זכוכית ונורה כדי לאסוף כל נוזל צפק שנותר. כאשר כל הנוזל נאסף, aliquot תאי שטיפה צפי מכל העכברים ולהוסיף עד פעם אחת 10 לתאים השמיניים לכל ריכוז צינור ב 50 צינורות מיליליטר על קרח. ולהרוס את התאים על ידי צנטריפוגה.יש להתריע מחדש על כל גלולה במיליליטר אחד של נוגדן נגד CD16/CD32 מדולל ביחס של 1 עד 50 במאגר הבדיקות לדגירה של 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, מוסיפים נפח שווה של תערובת אב נוגדנים biotinylated לכל צינור עבור דגירה של 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס ואחריו לשטוף בחמישה מיליליטר של חיץ assay לכל צינור. תן את הכדורים עם הנפח המתאים של microbeads אנטי ביוטין ומשך הדגירה המתאים לפי ריכוז התא והממלצת היצרן ואחריו לשטוף חיץ בדיקה חמישה מיליליטר לכל צינור.תן שימוש חוזר בכל גלולה ב- 500 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה והצב מחדש את המספר המתאים של עמודות בחירה מגנטית עם שלושה מיליליטר של מאגר בדיקה לעמודה. מעבירים את התאים לעמודים מוזהרים שאוספים את האלונט המכיל תאי B-1 מועשרים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על קרח. לאחר מכן שטפו כל עמודת בחירה מגנטית עם מאגר בדיקה נוסף עד שהנפח הכולל שנאסף יהיה 10 מיליליטר והשקיעו מחדש את שבר התא לאחר הטיהור פי 10 לריכוז השישי למיליליטר במדיום תרבות תאי B.כדי לעורר את תאי B-1 צפי להפריש לפחות פעם אחת 10 לתאים השביעי עבור פקד שאינו מתמר ולפצל את התאים הנותרים לשני כרכים שווים עבור ההעתקה. לדלל את התאים 1.5 פעמים 10 לתאים החמישיים לכל 150 microliters של ריכוז בינוני ולהוסיף 150 microliters של תאים בארות של צלחת אחת 96 היטב עגול התחתון עבור מצב התמרה. לאחר מכן להוסיף 100 nanomolar של אגוניסט TLR9 לכל באר ולמקום את הצלחות ב החממה תרבות התא במשך 16 עד 18 שעות.לתמורת רטרו-ויראלית של תאי B צפי להפשיר סידן פוספט transfection חלקיקים רטרו-ויראליים מניות על קרח מיד להוסיף לשליטה ואת קולטן כימוקין retroviral על טבעי לכל אחד גם של הצלחת המתאימה ואת ריבוי הזיהום של 20 לאחד בנוכחות 8 מיקרוגרם למיליליטר של פוליברן ובטא-mercaptoethanol טרי ב 55 ריכוז סופי micromolar. כאשר כל הווירוסים נוספו, ספיןfect התאים על ידי צנטריפוגה למקם את הצלחות באינקובטור תרבות התא במשך שלוש שעות. בסוף הדגירה, לקצור את התאים עבור replating בינוני תא B טרי דגירה לילה.לאחר דלדול מגנטי של סוגי תאים צפיוניים אחרים, לתאי סינגלט חיים בשבר שלאחר הדלדול יש שיעור גדול יותר של תאי CD19+B בהשוואה ל- F4/80+מקרופאגים, ומחסור בתאי CD5hi CD19-T, והם מכילים תדירות מוגברת של תאי B-1a בינוניים CD19+CD5 בהשוואה לשבר טרום דלדול. והגברת התדירות של ערכות משנה של תאים GFP+B-2, B-1, B-1a ו- B-1b המתווספת בהצלחה לעלייה בריבוי וירוסים של זיהום. ואת יעילות ההעתקה ניתן להגדיל עוד יותר באמצעות 96 צלחות עגולות היטב לעומת השימוש של 24 היטב או 6 צלחות היטב.התמרה רטרווירוס CXCR4-GFP יכול לגרום מוצלחת B-1 תא CXCR4 overexpression ולהגדיל את ההגירה במבחנה לכיוון CXCL12 ללא השפעה משמעותית על הכדאיות של תא B. בנוסף, תאים המועברים באימוץ CD45.1+תורם סבלו מלחץ יתר של CXCR4 לאחר החלמתם ממח העצם ו הטחול של עכברים נמען CD45.2 17 שבועות לאחר העברת התא. יש לציין כי נקבע קשר חיובי בין הביטוי CXCR4 לבין לוקליזציה של תאי התורם למח העצם אך לא טחול.עם קשר חיובי שנצפה בין מספרי תאים תורמים במח העצם לבין כמות הפלזמה של ליפופרוטאין IgM בצפיפות נמוכה נגד מד"א. ניתן להשתמש בטכניקות נוספות רבות כדי לענות על שאלות כגון, מהי ההשפעה של אספקת גנים ממוקדת על התפתחות המחלה או אילו תורמים מפיקים גורמים מופרשים המשפיעים על הפיזיולוגיה המארחת.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

הדור וסימון של Murine מח עצם הנגזרות תאים דנדריטים עם nanocrystals Qdot ללימודי מעקב

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

בידוד, טיהור וסימון של נויטרופילים מח עצם עכבר ללימודים פונקציונליים וניסויי העברת מאמצת

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

מח עצם נגזרות Macrophage הפקה

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

הערכת התפתחותם של תאי Murine Plasmacytoid דנדריטים בתיקונים של Peyer באמצעות העברת מאמצת של אבות Hematopoietic

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

המונוציטים בידוד והזרקה תוך ורידית של Murine מח העצם נגזר

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

אינדוקציה של Murine דלקת מעיים על ידי העברת המאמצת של מפעיל CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; גבוה</sup&gt; תאי T לעכברי immunodeficient

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral התמרה של ובתאים מח עצם כדי ליצור תאי T קולטן Retrogenic עכברים

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

חלון ירך דגם קאמרי<em&gt; In vivo</em&gt; מעקב תא Murine מח עצם

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression וטיהור האדם<em&gt; Cis</em&gt; פרנליטרונפרפרז ב<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...