Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

이 작업은 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, P01 HL055798의 프로젝트 3, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) 및 R01GM100776 (T.P. 벤더)에 의해 지원되었습니다. A. 우파디는 미국 심장 협회 전 박사 펠로우십 16PRE30300002 및 5T32AI007496-20의 지원을 받았습니다. 우리는 그들의 우수한 기술 지원을 위한 버지니아 흐름 세포 분석 코어의 대학에서 조앤 라니건, 마이크 솔가, 클로드 츄에게 감사드립니다.

모든 동물 프로토콜은 버지니아 대학의 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인되었습니다.
1. 자성 분리 및 각막 B-1 세포의 농축
<ol><li>CO2를사용하여 12-14 주 된, 남성, CD45.1+ApoE-/- 마우스를 안락사 .</li>
	<li>직선 수술 가위를 사용하여 복부에 피상적 인 컷을 확인하고 복막 벽을 노출 곡선 가위를 사용하여 다시 피부를 껍질. 10 mL 주사기 및 25 G 바늘을 ?...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

여기에 제공된 방법은 안정적이고 비교적 효율적인 1차 B-1a 세포 유전자 전달, 생체 내 입양 전달, 주입된 세포의 식별 및 국소화를 가능하게 한다. 세포는 세포 전이 후 17주 동안 검출될 수 있었고 증가된 CXCR4 발현을 유지하였다. 레트로바이러스 매개 전달은 우리의 손에 있는 세포 생존에 최소한의 충격으로 1 차 적인 murine B-1a 세포의 30-40% transduction 효율성을 산출했습니다(그림 4e...

최근 연구는 상당한 면역 세포, 특히 B 세포, 특히 세포 국소화에 따라 자형질 및 기능적 이질성을입증했다1,2,,3,,4,5.5 B-1a 세포는 보호 IgM 항체를 생성하는 이기종 용량을 가진 하나의 그러한 집단; 골수 B-1a 세포는 IgM을 분비하고 혈장 IgM 타이터6에크게 기여하며, 복막 B-1a 세포는 항상성에서 낮은 수준의 IgM 분비를 가지며 대신 선천적 톨-유사 수용체(TLR) 또는 사이토카인 매개 신호를 통해7,8,9,활성화될 수 있으며, 70 , 70 , 70 , 70 ,70. B-1a 세포 IgM 항체는 병원균, 세포자멸 세포 및 산화된 LDL에 존재하는 산화 특이적 에피토프(OSE)를 인식하고, OSE에 결합하는 IgM은 죽상동맥경화증 과 같은 질병에서 염증성 하류 신호를 방지할 수 있다11. 따라서, 골수와 같은 부위로의 후막 B-1a 세포 이동을 증가시켜 IgM 생산을 증가시키는 전략이 치료적으로 유용할 수 있다. 그러나, 이러한 전략에 대 한 중요 한 대상 및 세포 유형 특정, 오프 타겟 효과 면역 기능 또는 건강에 부정적인 영향을 미칠 수 있습니다.
여기서 우리는 1차 뮤린 B-1a 세포에서 CXCR4의 표적화 및 장기 과발현에 대한 방법을 설명하고 세포 이동 및 기능적 IgM 항체 생산을 시각화하기 위한 후속 입양 전달을설명한다(도 1). 1 차적인 B 세포의 유전 조작은 형질전환된 세포주의 형질전환에 비해 낮은 형광 효율성에 의해 제한됩니다. 그러나, 형질전환된 세포주들이1차 세포(12,,13)로부터현저하게 이탈할 수 있기 때문에, 1차 세포의 사용은 정상 생리학에 보다 밀접하게 부합하는 결과를 제공할 가능성이 높다. 몇몇 기술은 레트로바이러스 전달, 아데노바이러스 전달, 지방흡입, 또는 세포 건강에 미치는 영향의 다양한 수준을 가지는 전기천공 기반 형질감염을 포함하는 1차 뮤린 B 세포에서유전자 전달을 위해 기술되었다13,,14,,15. 다음 방법은 레트로바이러스 전달을 활용하여 세포 생존율에 최소한의 영향을 미치면서 >30%의 적절한 유전자 전달 효율을 산출하였다. 앞서 설명한 레트로바이러스 를 사용하여 생성된 CXCR4-뮤린 줄기세포 바이러스-내부 리보솜 진입 부위-녹색 형광 단백질(MSCV-IRES-GFP; MigR1)16,마우스 CXCR4 유전자가 서브클로론된 4. MigR1(대조군(Ctl)-GFP) 및 CXCR4-GFP 레트로바이러스 입자는 이전에 발표된 프로토콜4,,14에기재된 바와 같이 칼슘 인산염 형질감염을 사용하여 생성되었다.
성공적으로 변환된 B-1a 세포를 정맥내 림프구 결핍Rag1-/- 마우스로 옮겼다. 기증자 및 수용자 마우스 는 또한 아포리포프로테인 E (ApoE) 유전자의 녹아웃을 포함, 이는 증가 OSE 축적 및 동맥 경화증의 결과, 따라서 생체 내 B-1 세포 활성화 및 IgM 생산을위한 모델을 제공. 더욱이, 기증자 및 수용자 마우스는 CD45 동형에서 달랐다; 공여자 B-1 세포는 CD45.1+ApoE-/- 마우스로부터 왔고Rag1-/- CD45.2+ApoE-/- 수용자로 옮겨졌다. 이는 유세포분석 동안 B 세포 마커에 대한 추가적인 얼룩을 가할 필요 없이 수용자 CD45.2 B 세포로부터 의 기증자 CD45.1의 분화를 허용했다. 여기에 제공된 결과는 B-1a 세포에 대한 표적 CXCR4 과발현이 B-1a 세포의 증가된 능력과 연관되어 골수로 이동하는 것을 보여 주며, 이는 증가된 혈장 항 OSE IgM과 연관되어 있다. 우리는 또한 부정적인 선택을 통해 후막 B-1 세포의 농축을위한 방법을 제공하고 효율적인 전달을위한 B-1 세포 활성화의 요구 사항을 입증합니다. 이 방법은 B-1a 세포 이동, 표현형 또는 기능에 대한 단백질 과발현의 효과를 연구하기 위해 다른 레트로바이러스 구조에 적응될 수 있다. 더욱이, CD45.1 대 CD45.2 동형 구별의 사용은 이론적으로 내인성 B 세포를 포함하는 그밖 면역 충분한 뮤린 모형으로 전송을 허용할 수 있었습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

세포 기능이 세포 미세 환경의 틈새 특이적 요인에 의해 영향을 받므로 세포 국소화 및 이동을 해부하는 방법은 세포 기능에 대한 추가 통찰력을 제공할 수 있습니다. B-1a 세포는 건강과 질병 도중 발생하는 산화 특이적 에피토프에 대하여 보호천연 IgM 항체를 생성하는 마우스에 있는 유일한 B 세포 서브세트입니다. B-1a 세포 IgM 생산은 B-1a 세포 위치에 따라 다르며, 따라서 높은 항체 생산을 지지하는 틈새 시장까지 B-1a 국소화를 표적으로 하는 치료적 관점에서 유용하게 된다. 여기서 우리는 C-X-C 모티프 케모카인 수용체 4(CXCR4)의 레트로바이러스 매개 과발현에 의해 골수로B-1a 세포 이동을 표적으로 하는 방법을 설명한다. 1 차적인 murine B 세포에 있는 유전자 유도는 도전적일 수 있고 전형적으로 기술에 따라서 10-20%의 낮은 형혈 성 효율성을 산출합니다. 여기에서 우리는 1 차적인 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 성 환전이 30-40% 형질전환 효율을 초래한다는 것을 보여줍니다. 이 방법은 기증자 B-1a 세포 이동 및 국소화가 가시화될 수 있도록 B 세포 결핍 수용자 마우스로 변환된 B-1a 세포의 입양 세포 전달을 이용합니다. 이 프로토콜은 다른 레트로바이러스 구성을 위해 변형될 수 있으며, 기증자 세포 또는 숙주 세포 표현형 및 기능의 분석, 또는 B-1a 세포 전달 후 분비된 수용성 인자의 분석을 포함하여 다양한 기능성 분석사에서 사용될 수 있다. CD45.1 및 CD45.2 동형및 레트로바이러스 플라스미드 내에 GFP 리포터의 존재에 의해 분화된 뚜렷한 공여자 및 수용인자 마우스의 사용은 또한 내인성 B 세포 집단을 포함하는 다른, 면역 이충분한 마우스 모델에서 공여자 세포의 검출을 가능하게 할 수 있었다.

프로토콜의 개요는 그림 1에있습니다. 그림 2는 다른 각막 세포 유형의 자기 고갈 후 후막 B-1a 세포의 농축을 표시합니다. 고갈 후 분획에서 살아있는 단일 세포는 F4/80+ 대식세포에 비해+ CD19+ B 세포의 더 큰 비율을 가지며, CD5hi CD19-T 세포가 결여되고, CD19+CD5 미드 B-1a 세포의 증가된 주파수를 함유하고 있다.- + <st...

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Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

여기서 우리는 생체 내 B-1a 세포 이동 및 국소화를 검사하기 위해 뮤린 B-1a 세포의 레트로바이러스 과발현 및 입양 전달방법을 설명한다. 본 프로토콜은 기증자 B-1a 세포 국소화의 정량화 또는 기증자 세포 유래 분비 인자의 분석 후 입양 전달을 포함하는 다양한 다운스트림 기능 성 분석을 위해 확장될 수 있다.

뮤린 B-1a 세포에 CXCR4의 레트로 바이러스 과발현 및 골수와 IgM 생산에 표적 B-1a 세포 이동을 위한 채택 전송

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

이 프로토콜은 표적 유전자 전달이 B-1a 세포 국소화 및 기능에 어떻게 영향을 미치는지 평가할 수 있고 생체 내의 유전자 치료 잠재력을 검토하기위한 개념 접근법의 유용한 증거가 될 수 있습니다. 이 방법은 1차 B-1a 세포에 안정적이고 비교적 효율적인 유전자 전달을 제공하고 기증자 세포 표현형 및 기능 사후 입양 전달의 식별을 허용한다. 이 방법은 세포 생존, 증식 및 기능을 포함하는 생체 내의 다양한 기증자 및 숙주 세포 프로세스를 검사하는 데 사용될 수 있으며, 다른 입양 전달 시스템에 적용될 수 있다.수막 유체 수확은 까다로울 수 있습니다. 회복을 극대화하고 하원 세포 인구를 오염시킬 수 있는 장에 구멍을 뚫지 않도록 세포를 철저히 분리하십시오. 복막 B-1 세포 수집의 경우 직선 수술 가위를 사용하여 12 주에서 14 주 된 남성, CD45.1 + 아폴리포폴단백질 E 녹아웃 마우스의 복부에 피상적 인 컷을 만들고 곡선 가위를 사용하여 피부를 벗겨 내어 복막 벽을 노출시하십시오.25 게이지 바늘이 장착된 10 밀리리터 주사기를 사용하여 복막 구멍을 37도 RPMI-1640 배지의 10 밀리리터로 플러시합니다. 그리고 마우스가 15~20초 동안 좌우로 완전히 흔들릴 수 있도록 꼬리의 베이스를 잡습니다. 흔들린 후 주사기를 사용하여 주사기를 사용하여 고관절 의 오른쪽 아래에서 액체를 흡인하고 창자 근처의 장 근처에서 주사기를 사용하여 주사기를 사용하여 주사기지방 창고와 기본 장기를 방해하지 않도록 주의하십시오.6~7밀리리터의 라베이지를 수집한 후 얼음 위에 50밀리리터 원추형 튜브에 액체를 분배합니다. 집게를 사용하여 다이어프램 위의 복막 벽을 파악하여 동물의 수직 고도를 허용하여 나머지 유체가 복막 구멍의 바닥에 남아 있게 합니다. 간 자체를 절단하지 않고 간 위의 회막 벽에 작은 절단을 만들기 위해 외과 가위를 사용합니다.그리고 유리 파이프와 전구를 사용하여 남은 수막 유체를 수집합니다. 모든 유체가 수집되면, 모든 마우스로부터 복막 세척 세포를 알리쿼트와 얼음에 50 밀리리터 튜브에서 튜브 농도당 8번째 세포에 최대 10배까지 첨가한다. 그리고 원심분리에 의한 세포를 퇴적시한다.각 펠릿을 항 CD16/CD32 항체의 1밀리리터로 재보설하여 4°C에서 10분 동안 분석 버퍼에서 1-50 비율로 희석하였다. 인큐베이션의 끝에서, 4섭씨에서 20분 배양에 생체개화 항체 마스터 믹스의 동일한 볼륨을 추가하고 튜브 당 분석 버퍼의 5 밀리리터에 세척한다. 항 비오틴 마이크로비드의 적절한 부피와 적절한 인큐베이션 지속 시간으로 펠릿을 다시 중단하고 세포 농도 및 제조업체의 권고에 따라 튜브 당 5 밀리리터 분석 버퍼 워시를 한다.각 펠릿을 500 마이크로리터의 분석 버퍼로 재보선하고 컬럼당 3밀리리터의 분석 버퍼가 있는 적절한 자기 선택 컬럼수를 누를 수 있습니다. 얼음 위에 15 밀리리터 원추형 튜브에서 농축 된 B-1 세포를 포함하는 용출을 수집하는 프라이밍 컬럼에 세포를 전달합니다. 그런 다음 전체 수집 된 부피가 10 밀리리터가 될 때까지 추가 분석 버퍼로 각 자기 선택 컬럼을 세척하고 B 세포 배양 배지에서 밀리리터 농도당 10 내지 여섯 번째 세포로 10 시에 정수 된 세포 분획을 재연한다.회중 B-1 세포를 비유도 제어를 위해 7번째 세포에 10번 이상 따로 설정하고 나머지 세포를 트랜스포팅을 위한 두 개의 동등한 부피로 분할한다. 중간 농도의 150 마이크로 리터 당 다섯 번째 세포에 1.5 배 10으로 세포를 희석하고 트랜스듀션 상태를 위해 96 웰의 우물에 세포의 150 마이크로 리터를 추가합니다. 그런 다음 TLR9 작용제 100나노몰러를 각 우물에 넣고 16~18시간 동안 세포 배양 인큐베이터에 플레이트를 배치한다.복막 B 세포의 레트로바이러스 트랜스듀션을 위해 얼음에 칼슘 인산염 트랜스페이션 레트로바이러스 입자 를 해동하고 즉시 폴리브레인및 신선한 베타 메랑골의 밀리리터 당 8 마이크로그램의 존재에 20 대 1의 적절한 플레이트 및 복합 감염의 각 우물에 제어 및 케모킨 수용체 레트로 바이러스 과민제를 추가합니다. 모든 바이러스가 추가되면, 원심분리에 의해 세포를 소독하고 3시간 동안 세포 배양 배양 인큐베이터에 판을 놓는다. 인큐베이션의 끝에서, 신선한 B 세포 배지와 하룻밤 배양에 replating세포를 수확.다른 하막 세포 유형의 자기 고갈 후, 후 고갈 분획에 있는 살아있는 단일 세포는 F4/80+대식세포에 비해 CD19+B 세포의 더 큰 비율을 가지며, CD5hi CD19-T 세포의 부족은, 그리고 그(것)들은 CD19+CD5 배지 B-1a 세포의 증가한 주파수를 포함하고 있습니다 전 고갈 분획에 비교된. 그리고 성공적으로 전염된 GFP+B-2, B-1, B-1a 및 B-1b 세포 서브셋의 빈도증가는 감염의 바이러스 복합성 증가와 직접적으로 상관된다. 그리고 24웰 또는 6웰 플레이트의 사용에 비해 96개의 잘 둥근 바닥 플레이트를 사용하여 트랜스듀션 효율을 더욱 높일 수 있다.CXCR4-GFP 레트로바이러스 트랜스듀션은 B 세포 생존가능성에 큰 영향을 미치지 않으면서 성공적인 B-1 세포 CXCR4 과발현및 CXCL12로의 체외 이동증가를 유도할 수 있다. 또한, 채택적으로 전송된 CD45.1+기증자 세포는 CD45.2 수신자 마우스의 골수 및 비장에서 회복한 후 CXCR4 과발현을 17주 후 세포 전달하였다. 참고, CXCR4 발현과 골수에 대한 기증자 세포 국소화 사이의 양성 연관성이 결정되었지만 비장은 결정되었다.골수의 기증자 세포 수와 항 MDA-저밀도 지단백 IgM의 혈장 양 사이에서 관찰된 긍정적인 연관성. 많은 추가 기술은 질병 발달에 표적으로 한 유전자 전달의 충격 또는 기증자가 호스트 생리학에 영향을 미치는 분비한 요인을 파생하는 것과 같은 질문에 대답하기 위하여 이용될 수 있습니다.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

B 세포의 재조합 생산 및 Retroviral 감염

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

연구

면역학 및 감염병학

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

추적 연구 Qdot Nanocrystals와 Murine 골수 파생 돌기 세포의 생성 및 라벨링

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

뼈 대식 세포 생산에게 골수 유래

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

조혈 전구 세포의 입양 전송을 사용 Peyer의 패치에 쥐과 Plasmacytoid 수지상 세포의 개발을 평가

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

분리 및 설치류 골수의 정맥 주사 유래 단핵구

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

골수 전구 세포의 레트로 바이러스 형질 도입은 T 세포 수용체 Retrogenic 마우스를 생성하는

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

대한 대퇴골 창 회의소 모델<em&gt; 생체</em쥐의 골수에서&gt; 셀 추적

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

인간의 과발현과 정제<em&gt; 시스</em&gt; - 프레 닐 트랜스퍼 라제<em&gt; 대장균</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...