Name: retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production
Uploaded: 2020-05-31T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Detta arbete stöddes av 1R01 HL107490, 1R01 HL136098, Projekt 3 av P01 HL055798, P01 HL136275-01 (C.A. McNamara) och R01GM100776 (T.P. Bender). A. Upadhye stöddes av American Heart Association Pre-doctoral fellowship 16PRE30300002 och 5T32AI007496-20. Vi tackar Joanne Lannigan, Mike Solga och Claude Chew från University of Virginia Flow Cytometry Core för deras utmärkta tekniska hjälp.

Alla djur protokoll godkändes av Animal Care and Use Committee vid University of Virginia.
1. Magnetisk separation och anrikning av peritoneal B-1 celler
<ol><li>Avliva en 12−14 veckor gammal, manlig, CD45.1+ApoE-/- mus med CO2.</li>
	<li>Gör ett ytligt snitt i buken med rak kirurgisk sax och skala tillbaka huden med böjd sax för att exponera peritoneal väggen. Spola bukhinnans hålighet med 10 ml 37 °C RPMI-1640 medium med en 10 ml spruta och 25 G n?...

<ol>
	<li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+Cell+Heterogeneity+and+the+Regulation+of+Natural+and+Antigen-Induced+IgM+Production.">B-1 Cell Heterogeneity and the Regulation of Natural and Antigen-Induced IgM Production.</a> Frontiers in Immunology. 7, 324 (2016).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1a+cell+diversity:+nontemplated+addition+in+B-1a+cell+Ig+is+determined+by+progenitor+population+and+developmental+location.">B-1a cell diversity: nontemplated addition in B-1a cell Ig is determined by progenitor population and developmental location.</a> Journal of Immunology. 192 (5), 2432-2441 (2014).</li><li>Prohaska, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Sequencing+of+Peritoneal+and+Splenic+B+Cell+Repertoires+Highlights+Unique+Properties+of+B-1+Cell+Antibodies.">Massively Parallel Sequencing of Peritoneal and Splenic B Cell Repertoires Highlights Unique Properties of B-1 Cell Antibodies.</a> Journal of Immunology. 200 (5), 1702-1717 (2018).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation Research. 125 (10), 55-70 (2019).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+mechanisms+define+murine+B+cell+lineage+immunoglobulin+heavy+chain+(IgH)+repertoires.">Distinct mechanisms define murine B cell lineage immunoglobulin heavy chain (IgH) repertoires.</a> Elife. 4, 09083 (2015).</li><li>Choi, Y. S., Dieter, J. A., Rothaeusler, K., Luo, Z., Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cells+in+the+bone+marrow+are+a+significant+source+of+natural+IgM.">B-1 cells in the bone marrow are a significant source of natural IgM.</a> European Journal of immunology. 42 (1), 120-129 (2012).</li><li>Holodick, N. E., Tumang, J. R., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin+secretion+by+B1+cells:+Differential+intensity+and+IRF4-dependence+of+spontaneous+IgM+secretion+by+peritoneal+and+splenic+B1+cells.">Immunoglobulin secretion by B1 cells: Differential intensity and IRF4-dependence of spontaneous IgM secretion by peritoneal and splenic B1 cells.</a> European Journal of Immunology. 40 (11), 3007-3016 (2010).</li><li>Moon, H., Lee, J. G., Shin, S. H., Kim, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LPS-induced+migration+of+peritoneal+B-1+cells+is+associated+with+upregulation+of+CXCR4+and+increased+migratory+sensitivity+to+CXCL12.">LPS-induced migration of peritoneal B-1 cells is associated with upregulation of CXCR4 and increased migratory sensitivity to CXCL12.</a> Journal of Korean Medical Science. 27 (1), 27-35 (2012).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+plasma+cell+alloantigen+1+defines+layered+development+of+B-1a+B-cell+subsets+with+distinct+innate-like+functions.">Expression of plasma cell alloantigen 1 defines layered development of B-1a B-cell subsets with distinct innate-like functions.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20077-20082 (2012).</li><li>Yang, Y., Tung, J. W., Ghosn, E. E., Herzenberg, L. A., Herzenberg, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Division+and+differentiation+of+natural+antibody-producing+cells+in+mouse+spleen.">Division and differentiation of natural antibody-producing cells in mouse spleen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (11), 4542-4546 (2007).</li><li>Tsiantoulas, D., Gruber, S., Binder, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-1+cell+immunoglobulin+directed+against+oxidation-specific+epitopes.">B-1 cell immunoglobulin directed against oxidation-specific epitopes.</a> Frontiers in Immunology. 3, 415 (2012).</li><li>Kaur, G., Dufour, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+lines:+Valuable+tools+or+useless+artifacts.">Cell lines: Valuable tools or useless artifacts.</a> Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).</li><li>McMahon, S. B., Norvell, A., Levine, K. J., Monroe, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transient+transfection+of+murine+B+lymphocyte+blasts+as+a+method+for+examining+gene+regulation+in+primary+B+cells.">Transient transfection of murine B lymphocyte blasts as a method for examining gene regulation in primary B cells.</a> Journal of Immunological Methods. 179 (2), 251-259 (1995).</li><li>Lin, K. I., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Introduction+of+genes+into+primary+murine+splenic+B+cells+using+retrovirus+vectors.">Introduction of genes into primary murine splenic B cells using retrovirus vectors.</a> Methods in Molecular Biology. 271, 139-148 (2004).</li><li>Moghimi, B., Zolotukhin, I., Sack, B. K., Herzog, R. W., Cao, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+Efficiency+Ex+Vivo+Gene+Transfer+to+Primary+Murine+B+Cells+Using+Plasmid+or+Viral+Vectors.">High Efficiency Ex Vivo Gene Transfer to Primary Murine B Cells Using Plasmid or Viral Vectors.</a> Journal of Genetic Syndromes and Gene Therapy. 2 (103), 1000103 (2011).</li><li>DeKoter, R. P., Lee, H. J., Singh, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PU.1+regulates+expression+of+the+interleukin-7+receptor+in+lymphoid+progenitors.">PU.1 regulates expression of the interleukin-7 receptor in lymphoid progenitors.</a> Immunity. 16 (2), 297-309 (2002).</li><li>Holodick, N. E., Vizconde, T., Hopkins, T. J., Rothstein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-Related+Decline+in+Natural+IgM+Function:+Diversification+and+Selection+of+the+B-1a+Cell+Pool+with+Age.">Age-Related Decline in Natural IgM Function: Diversification and Selection of the B-1a Cell Pool with Age.</a> The Journal of Immunology. 196 (10), 4348-4357 (2016).</li><li>Laurie, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-specific+and+efficient+expression+in+mouse+and+human+B+cells+by+a+novel+hybrid+immunoglobulin+promoter+in+a+lentiviral+vector.">Cell-specific and efficient expression in mouse and human B cells by a novel hybrid immunoglobulin promoter in a lentiviral vector.</a> Gene Therapy. 14 (23), 1623-1631 (2007).</li><li>Warncke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+in+vitro+transduction+of+naive+murine+B+cells+with+lentiviral+vectors.">Efficient in vitro transduction of naive murine B cells with lentiviral vectors.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 318 (3), 673-679 (2004).</li><li>Moon, B. G., Takaki, S., Miyake, K., Takatsu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+IL-5+for+mature+B-1+cells+in+homeostatic+proliferation,+cell+survival,+and+Ig+production.">The role of IL-5 for mature B-1 cells in homeostatic proliferation, cell survival, and Ig production.</a> Journal of Immunology. 172 (10), 6020-6029 (2004).</li><li>Takatsu, K., Kouro, T., Nagai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin+5+in+the+link+between+the+innate+and+acquired+immune+response.">Interleukin 5 in the link between the innate and acquired immune response.</a> Advances in Immunology. 101, 191-236 (2009).</li><li>Baumgarth, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+double+life+of+a+B-1+cell:+self-reactivity+selects+for+protective+effector+functions.">The double life of a B-1 cell: self-reactivity selects for protective effector functions.</a> Nature Reviews Immunology. 11 (1), 34-46 (2011).</li></ol>

Den metod som tillhandahålls här möjliggör stabil och relativt effektiv primär B-1a cell gen leverans, in vivo adoptivöverföring, och identifiering och lokalisering av injicerade celler. Celler kunde upptäckas 17 veckor post-cell överföring och behöll ökad CXCR4 uttryck. Retrovirusmedierad leverans gav 30-40% transduktionseffektivitet primära murine B-1a celler med minimal inverkan på cellens livskraft i våra händer(figur 4e). Detta är i linje med resultaten från en tidigar...

Nyligen genomförda studier har visat betydande immuncell, och specifikt B-cell, fenotypisk och funktionell heterogenitet beroende på celllokalisering1,,2,,3,,4,5. B-1a celler är en sådan population med heterogen kapacitet att producera skyddande IgM antikroppar; Benmärg B-1a celler utsöndrar IgM constitutively och bidrar avsevärt till plasma IgM titers6, medan peritoneal B-1a celler har låg nivå IgM sekretion på homeostasis och istället kan aktiveras genom medfödda vägtull-liknande receptor (TLR) eller cytokin-medierad signalerar att snabbt föröka sig, migrera och utsöndra IgM7,,8,9,10. B-1a cell IgM antikroppar känner igen oxidation-specifika epitoper (OSE) som finns på patogener, apoptotiska celler, och oxiderad LDL, och IgM bindning till OSE kan förhindra inflammatoriska nedströms signalering i sjukdomar som åderförkalkning11. Därför kan strategier för att öka IgM-produktionen via ökande peritoneal B-1a cellmigration till platser som benmärgen vara terapeutiskt användbara. Emellertid, Det är viktigt för sådana strategier som skall riktas och cell-typ specifika, som off-target effekter kan negativt påverka immunförsvaret eller hälsa.
Här beskriver vi en metod för riktad och långsiktig överuttryck av CXCR4 i primära murine B-1a celler och efterföljande adoptivöverföring för att visualisera cellmigration och funktionell IgM-antikroppsproduktion (figur 1). Genetisk manipulation av primära B-celler begränsas av låg transfection effektivitet jämfört med transfection av transformerade cellinjer. Men eftersom transformerade cellinjer kan avvika avsevärt från primära celler12,13, är användningen av primära celler sannolikt att ge resultat som närmare anpassar sig till normal fysiologi. Flera tekniker har beskrivits för genöverföring i primära murine B-celler, inklusive retroviral transduktion, adenoviral transduktion, lipofection, eller elektroporation-baserade transfection, som har varierande nivåer av effektivitet, transience, och inverkan på cellhälsa13,14,15. Följande metod utnyttjade retroviral transduktion eftersom det gav tillräcklig genöverföring effektivitet på >30% medan minimalt påverkar cellens livskraft. CXCR4-uttryck retrovirus genererades med hjälp av den tidigare beskrivna retrovirala konstruktionen murine stamceller virus-inre ribosomal posten webbplats-gröna fluorescerande protein (MSCV-IRES-GFP; MigR1)16, i vilken musen CXCR4 genen var sub-klonade4. MigR1 (control(Ctl)-GFP) och CXCR4-GFP retrovirala partiklar genererades med kalciumfosfattransfection enligt beskrivningen i tidigare publicerade protokoll4,14.
Framgångsrikt transduced B-1a celler överfördes sedan intravenöst till lymfocyter-saknas Rag1-/- möss. Både givare och mottagare möss innehöll dessutom knockout av apolipoprotein E (ApoE) genen, vilket resulterar i ökad OSE ackumulering och åderförkalkning, vilket ger en modell för in vivo B-1 cell aktivering och IgM produktion. Dessutom skilde sig donator- och mottagarmöss i cd45 allotyp. givaren B-1 celler kom från CD45.1+ ApoE-/- möss och överfördes till Rag1-/- CD45.2+ ApoE-/- mottagare. Detta möjliggjorde differentiering av givaren CD45.1 från mottagaren CD45.2 B-celler efter överföringen utan att behöva ytterligare fläck för B-cell markörer under flöde cytometri analys. De resultat som anges här visar att riktade CXCR4 överuttryck på B-1a celler associerar med ökad förmåga B-1a celler att migrera till benmärgen, som associerar med ökad plasma anti-OSE IgM. Vi tillhandahåller dessutom en metod för anrikning av bukhinnans B-1 celler genom negativt urval och visa kravet på B-1 cell aktivering för effektiv transduktion. Denna metod kan anpassas för andra retrovirala konstruktioner för att studera effekten av proteinöveruttryck på B-1a cellmigration, fenotyp eller funktion. Dessutom skulle användningen av CD45.1 jämfört med CD45.2 allotype skillnad teoretiskt tillåta överföring till andra immun-tillräckliga murine modeller som innehåller endogena B-celler.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>70 micron filter caps</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-biotin microbeads</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-090-485</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD16/CD32, or Fc block</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MFCR00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B220 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-0452-83</td>
			<td>Clone: RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta-mercaptoethanol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19 APCef780</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0193-82</td>
			<td>Clone: eBio1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0232-81</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23 PECy7</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>25-0232-82</td>
			<td>Clone: B3B4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3e biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-0033-85</td>
			<td>Clone: eBio500A2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.1 PerCP-Cy5.5</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560580</td>
			<td>Clone: A20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 BV421</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562895</td>
			<td>Clone: 104</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45.2 Rag1-/- ApoE-/- mice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Bred in house</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-0051-83</td>
			<td>Clone: 53-7.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ctl-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house using GFP-expressing retroviral plasmid MigR1 provided by Dr. T.P. Bender</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4 APC</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9991-82</td>
			<td>Clone: 2B11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CXCR4-GFP retrovirus</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Generated in house by cloning mouse CXCR4 into MigR1 retroviral plasmid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F4/80 biotin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>MF48015</td>
			<td>Clone: BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flowjo Software v. 9.9.6</td>
			<td>Treestar Inc.</td>
			<td>License required</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15710-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gr-1 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5931-82</td>
			<td>Clone: RB6-8C5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>heat-inactivated fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IgM PECF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562565</td>
			<td>Clone: R6-60.2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>329461</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Henry Schein Animal Health</td>
			<td>029405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Yellow</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L34968</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NK1.1 biotin</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553163</td>
			<td>Clone: PK136</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Non-essential amino acids</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ODN 1668</td>
			<td>InvivoGen</td>
			<td>tlrl-1668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI-1640</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11875-093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ter119 biotin</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>13-5921-82</td>
			<td>Clone: Ter119</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

retroviral overexpression of cxcr4 on murine b-1a cells and adoptive transfer for targeted b-1a cell migration to the bone marrow and igm production

Eftersom cellfunktionen påverkas av nischspecifika faktorer i den cellulära mikromiljön kan metoder för att dissekera celllokalisering och migrering ge ytterligare insikt om cellfunktionen. B-1a celler är en unik B-cell delmängd hos möss som producerar skyddande naturliga IgM antikroppar mot oxidation-specifika epitoper som uppstår under hälsa och sjukdom. B-1a cell IgM produktion skiljer sig beroende på B-1a cell plats, och därför blir det användbart ur terapeutisk synvinkel att rikta B-1a lokalisering till nischer som stöder hög antikroppsproduktion. Här beskriver vi en metod för att rikta B-1a cell migration till benmärgen genom retroviral-medierad överuttryck av C-X-C motiv chemokine receptor 4 (CXCR4). Geninduktion i primära murine B-celler kan vara utmanande och ger vanligtvis låg känsveffektivitet på 10-20% beroende på teknik. Här visar vi att retroviral transduktion av primära murine B-1a celler resulterar i 30-40% transduktion effektivitet. Denna metod använder adoptivcellöverföring av transducerade B-1a-celler till B-cell-saknas mottagare möss så att givaren B-1a cellmigrering och lokalisering kan visualiseras. Detta protokoll kan ändras för andra retrovirala konstruktioner och kan användas i olika funktionella analyser post-adoptivöverföring, inklusive analys av givaren cell eller värdcell fenotyp och funktion, eller analys av lösliga faktorer utsöndras efter B-1a cell överföring. Användningen av olika donator- och mottagarmöss som differentieras med CD45.1 och CD45.2 allotyp och förekomsten av en GFP-reporter inom den retrovirala plasmid kan också möjliggöra detektion av givarceller i andra, immun-tillräckliga musmodeller som innehåller endogena B-cellpopulationer.

En översikt över protokollet ges i figur 1. Figur 2 visar anrikning av peritoneal B-1a celler efter magnetisk utarmning av andra peritoneal celltyper. Levande singlet celler i post-utarmning fraktion har en större andel av CD19 + B-celler jämfört med F4/80+ makrofager, saknar CD5hi CD19- T-celler, och innehåller en ökad frekvens av CD19+ CD5mitten B-1a celler jämfört med pre-utarmning fraktion. <str...

Watch this Scientific Journal Video about Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production at JoVE.c

Retroviral Overexpression of CXCR4 on Murine B-1a Cells and Adoptive Transfer for Targeted B-1a Cell Migration to the Bone Marrow and IgM Production

Här beskriver vi en metod för retroviral överuttryck och adoptivöverföring av murine B-1a celler för att undersöka in vivo B-1a cell migration och lokalisering. Detta protokoll kan förlängas för olika nedströms funktionella analyser inklusive kvantifiering av givaren B-1a cell lokalisering eller analys av givaren cell-härledda utsöndrade faktorer post-adoptivöverföring.

Retroviral överuttryck av CXCR4 på Murine B-1a celler och adoptivöverföring för riktad B-1a Cell Migration till benmärgen och IgM Produktion

As cell function is influenced by niche-specific factors in the cellular microenvironment, methods to dissect cell localization and migration can provide ...

Detta protokoll kan utvärdera hur riktad genleverans påverkar B-1a cell lokalisering och funktion och kan vara en användbar proof of concept tillvägagångssätt för att undersöka gen terapeutiska potentialer in vivo. Denna metod ger en stabil och relativt effektiv gen leverans till primära B-1a celler och gör det möjligt att identifiera givaren cell fenotyp och funktion post-adoptivöverföring. Denna metod kan användas för att undersöka olika givare och värd cell processer in vivo inklusive cell överlevnad, spridning, och funktion, och kan tillämpas på andra adoptivöverföring system.Peritoneal vätskeskörd kan vara knepigt. Var noga med att grundligt koppla bort cellerna för att maximera återhämtningen och för att undvika punktering tarmarna som kan förorena din peritoneal cellpopulation. För peritoneal B-1 cell samling, använd raka kirurgiska sax för att göra en ytlig snitt i buken av en 12 till 14-veckors-gamla, hane, CD45.1 + apolipoprotein E knockout mus, och använda böjda saxar att skala tillbaka huden för att exponera peritoneal väggen.Med hjälp av en 10 milliliter spruta utrustad med en 25 gauge nål, spola peritoneal hålighet med 10 milliliter av 37 grader Celsius RPMI-1640 medium. Och ta tag i svansens bas så att musen kan skakas ordentligt från sida till sida i 15 till 20 sekunder. Efter skakning, använd sprutan för att aspirera vätskan från nedre högra sidan av bukhinnan strax ovanför höftnivån, nära tarmarna, var noga med att undvika att störa epidydimal fett depåer och underliggande organ.Efter att ha samlat sex till sju milliliter lavage, fördela vätskan i en 50 milliliter konisk rör på is. Använd forceps för att fatta tag i peritonealväggen ovanför membranet för att tillåta vertikal höjning av djuret så att eventuell kvarvarande vätska finns kvar i botten av peritonealhålan. Använd kirurgisk sax för att göra ett litet snitt i peritonealväggen ovanför levern utan att skära levern själv.Och använd en glaspip och glödlampa för att samla in eventuella återstående peritonealvätska. När all vätska har samlats in, aliquot peritoneal washout celler från alla möss och lägga till upp till en gånger 10 till åttonde celler per rör koncentration i 50 milliliter rör på is. Och sediment cellerna genom centrifugeringen.Resuspend varje pellet i en milliliter av anti-CD16/CD32 antikropp utspädd vid en ett till 50 förhållande i analysbuffert för en 10 minuters inkubation vid fyra grader Celsius. I slutet av inkubationen, tillsätt en lika stor volym av biotinylerad antikropp master mix till varje rör för en 20 minuters inkubation vid fyra grader Celsius följt av en tvätt i fem milliliter av assay buffert per rör. Resuspend pellets med lämplig volym av anti-biotin mikropärlor och lämplig inkubation varaktighet enligt cellkoncentrationen och tillverkarens rekommendation följt av en fem milliliter analys buffert tvätt per rör.Resuspend varje pellet i 500 mikroliter av analysbuffert och prime lämpligt antal magnetiska urval kolumner med tre milliliter av assay buffert per kolumn. Överför cellerna på primade kolonner som samlar eluenten som innehåller berikade B-1-celler i ett koniskt rör på 15 milliliter på is. Tvätta sedan varje magnetisk urvalskolumn med ytterligare analysbuffert tills den samlade volymen totalt är 10 milliliter och återanvänd den efterrenade cellfraktionen vid en tidpunkt 10 till de sjätte cellerna per milliliterkoncentration i B-cellkulturmedium.Att stimulera peritoneal B-1 celler avsätta minst en gånger 10 till den sjunde celler för en icke-transduced kontroll och dela de återstående cellerna i två lika stora volymer för transduktion. Späd cellerna till 1,5 gånger 10 till de femte cellerna per 150 mikroliter av medelhög koncentration och tillsätt 150 mikroliter celler till brunnar av en 96-väl rund-bottenplatta för transduktionstillstånd. Tillsätt sedan 100 nanomolar av TLR9-agonist till varje brunn och placera plattorna i cellkulturinkubatorn i 16 till 18 timmar.För retroviral transduktion av de peritoneala B-cellerna tina kalciumfosfattransfektion retrovirala partikellager på is och omedelbart lägga till kontrollen och den chemokine receptorn retroviral supernatants till varje brunn av lämplig platta och multiplicitet av infektion av 20 till en i närvaro av 8 mikrogram per milliliter av polybrene och färsk beta-merkaptoanol vid 55 micromolar slutlig koncentration. När alla virus har tillsatts, spinfect cellerna genom centrifugeringen och placera plattorna i cellodlingen inkubatorn i tre timmar. Vid slutet av inkubationen skördar du cellerna för omplatning i färskt B-cellmedium och en inkubation över natten.Efter magnetisk utarmning av andra peritoneal celltyper, levande singlet celler i efter utarmning fraktionen har en större andel CD19 + B-celler jämfört med F4/80 +makrofager, och en brist på CD5hi CD19-T-celler, och de innehåller en ökad frekvens av CD19 + CD5 medium B-1a celler jämfört med pre-utarmning fraktion. Och ökning av frekvensen av framgångsrikt transduced GFP + B-2, B-1, B-1a och B-1b cell delmängder är direkt korrelerade till ökningen av virus multiplicity av infektion. Och transduktionseffektiviteten kan ökas ytterligare med hjälp av 96 väl rundbottenplattor jämfört med användningen av 24-brunns- eller 6-brunnsplattor.CXCR4-GFP retrovirus transduktion kan framkalla en framgångsrik B-1 cell CXCR4 överuttryck och öka i in vitro-migration mot CXCL12 utan en betydande inverkan på B-cellens livskraft. Dessutom, adoptively överfört CD45.1+givare celler lidit deras CXCR4 överuttryck efter deras återvinning från benmärgen och mjälte av CD45.2 mottagare möss 17 veckor post-cell överföring. Notera, en positiv associering mellan CXCR4 uttryck och givare cell lokalisering till benmärgen men inte mjälte har fastställts.Med en positiv association observerats mellan givaren cell nummer i benmärgen och plasma mängden av anti-MDA-low density lipoprotein IgM. Många ytterligare tekniker kan användas för att svara på frågor såsom, vad är effekten av riktade gen leverans på sjukdomsutveckling eller som givaren härleder utsöndrande faktorer inverkan värd fysiologi.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

Rekombinant retroviral Produktion och infektion av B-celler

The transgenic expression of genes in eukaryotic cells is a powerful reverse genetic approach in which a gene of interest is expressed under the control ...

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Generering och märkning av murina härledd från benmärg dendritiska celler med Qdot Nanokristaller för spårning studier

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Isolering, rening och märkning av benmärg hos möss Neutrofiler för funktionella studier och adoptivföräldrar Experimentera Transfer

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Härledd från benmärg Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Assessing the Development of Murine Plasmacytoid Dendritic Cells in Peyer's Patches Using Adoptive Transfer of Hematopoietic Progenitors

Bedöma utvecklingen av murina plasmacytoid dendritiska celler i Peyers Patches Använda adoptiv överföring av hematopoetiska stamfäder

This protocol details a method to analyze the ability of purified hematopoietic progenitors to generate plasmacytoid dendritic cells (pDC) in intestinal ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

Isolering och intravenös injektion av murin benmärg härledda Monocyter

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Induktion av murina tarminflammation med adoptiv överföring av Effector CD4<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; Hög</sup&gt; T-celler i möss med immunbrist

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Retroviral Transduction of Bone Marrow Progenitor Cells to Generate T-cell Receptor Retrogenic Mice

Retroviral Transduction av benmärgsstamceller för att generera T-cellreceptor Retrogenic Möss

T cell receptor (TCR) signaling is essential in the development and differentiation of T cells in the thymus and periphery, respectively.  The vast array ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Lårben Fönster Chamber modell för<em&gt; In Vivo</em&gt; Cell Spårning i murina benmärgs

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overuttryck och rening av människa<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferas i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...