الكتاب شاكرون لدال Leitman للتدريب الأولي في استخدام المقايسات العابرة لتحديد النشاط الاستروجيني للأغذية النباتية الرئيسيات. بفضل برادفورد ويستريتش وC. اريك جونسون للمساعدة في إعداد معدات المختبر وتدريب الطلاب على أساليب الاستخراج. وأخيراً، شكراً لجامعة إنديانا على تمويل هذا البحث.

1- إعداد المواد النباتية
<ol><li>تجميد المواد النباتية الجافة التي تم جمعها طازجة باستخدام مزيل ا لهذا المرض.<ol>
<li>لحماية العينات من الضوء، تغطية الغرف مع رقائق الألومنيوم أثناء عملية التجفيف.</li>
		<li>لضمان أن العينات جافة تماما، التجميل حتى غرف لم تعد تشعر الباردة للمس والمواد النباتية لم تعد...

<ol>
	<li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+consumption+predicts+red+colobus+monkey+(Procolobus+rufomitratus)+hormonal+state+and+behavior.">Estrogenic plant consumption predicts red colobus monkey (Procolobus rufomitratus) hormonal state and behavior.</a> Hormones and Behavior. 62 (5), 553-562 (2012).</li><li>Wasserman, M. D., Milton, K., Chapman, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+roles+of+phytoestrogens+in+primate+ecology+and+evolution.">The roles of phytoestrogens in primate ecology and evolution.</a> International Journal of Primatology. 34 (5), 861-878 (2013).</li><li>DeGabriel, J. L., Moore, B. D., Foley, W. J., Johnson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effects+of+plant+defensive+chemistry+on+nutrient+availability+predict+reproductive+success+in+a+mammal.">The effects of plant defensive chemistry on nutrient availability predict reproductive success in a mammal.</a> Ecology. 90 (3), 711-719 (2009).</li><li>Wasserman, M. D., Steiniche, T., Despr&#233;s-Einspenner, M. -. L., Lambert, J. E., Rothman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Primate Diet &amp; Nutrition. , (2020).</li><li>Benavidez, K. M., Chapman, C. A., Leitman, D. C., Harris, T. R., Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intergroup+variation+in+oestrogenic+plant+consumption+by+black-and-white+colobus+monkeys.">Intergroup variation in oestrogenic plant consumption by black-and-white colobus monkeys.</a> African Journal of Ecology. , (2019).</li><li>Bennetts, H. W., Underwood, E. J., Shier, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+specific+breeding+problem+of+sheep+on+subterranean+clover+pastures+in+Western+Australia.">A specific breeding problem of sheep on subterranean clover pastures in Western Australia.</a> Australian Veterinary Journal. 22 (1), 2-12 (1946).</li><li>Tubbs, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenicity+of+captive+southern+white+rhinoceros+diets+and+their+association+with+fertility.">Estrogenicity of captive southern white rhinoceros diets and their association with fertility.</a> General and Comparative Endocrinology. 238, 32-38 (2016).</li><li>Shen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observation+of+the+influences+of+diosgenin+on+aging+ovarian+reserve+and+function+in+a+mouse+model.">Observation of the influences of diosgenin on aging ovarian reserve and function in a mouse model.</a> European Journal of Medical Research. 22 (1), 42 (2017).</li><li>Bou&#233;, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+estrogenic+effects+of+legume+extracts+containing+phytoestrogens.">Evaluation of the estrogenic effects of legume extracts containing phytoestrogens.</a> Journal of Agricultural and Food Chemistry. 51 (8), 2193-2199 (2003).</li><li>Klinge, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen+receptor+interaction+with+estrogen+response+elements.">Estrogen receptor interaction with estrogen response elements.</a> Nucleic Acids Research. 29 (14), 2905-2919 (2001).</li><li>Nishikawa, J. -. i., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+screening+methods+for+chemicals+with+hormonal+activities+using+interaction+of+nuclear+hormone+receptor+with+coactivator.">New screening methods for chemicals with hormonal activities using interaction of nuclear hormone receptor with coactivator.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 154 (1), 76-83 (1999).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Human Estrogen Receptor Beta (ERb; ESR2; NR3A2) Reporter Assay System. , (2020).</li><li>Wasserman, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogenic+plant+foods+of+red+colobus+monkeys+and+mountain+gorillas+in+uganda.">Estrogenic plant foods of red colobus monkeys and mountain gorillas in uganda.</a> American Journal of Physical Anthropology. 148 (1), 88-97 (2012).</li><li>Vivar, O. I., Saunier, E. F., Leitman, D. C., Firestone, G. L., Bjeldanes, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+activation+of+estrogen+receptor-&#946;+target+genes+by+3,+3'-diindolylmethane.">Selective activation of estrogen receptor-&#946; target genes by 3, 3'-diindolylmethane.</a> Endocrinology. 151 (4), 1662-1667 (2010).</li><li>Whitten, P. L., Patisaul, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cross-species+and+interassay+comparisons+of+phytoestrogen+action.">Cross-species and interassay comparisons of phytoestrogen action.</a> Environmental Health Perspectives. 109, 5-20 (2001).</li><li>Di Gioia, F., Petropoulos, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Advances in Food and Nutrition Research. , (2019).</li><li>Lutz, I., Kloas, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amphibians+as+a+model+to+study+endocrine+disruptors:+I.+Environmental+pollution+and+estrogen+receptor+binding.">Amphibians as a model to study endocrine disruptors: I. Environmental pollution and estrogen receptor binding.</a> Science of The Total Environment. 225 (1), 49-57 (1999).</li><li>Felcyn, J. R., Davis, J. C. C., Tran, L. H., Berude, J. C., Latch, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aquatic+Photochemistry+of+Isoflavone+Phytoestrogens:+Degradation+Kinetics+and+Pathways.">Aquatic Photochemistry of Isoflavone Phytoestrogens: Degradation Kinetics and Pathways.</a> Environmental Science &amp; Technology. 46 (12), 6698-6704 (2012).</li><li>Jeng, Y. -. J., Kochukov, M. Y., Watson, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+estrogen+receptor-alpha-mediated+nongenomic+actions+of+phytoestrogens+in+GH3/B6/F10+pituitary+tumor+cells.">Membrane estrogen receptor-alpha-mediated nongenomic actions of phytoestrogens in GH3/B6/F10 pituitary tumor cells.</a> Journal of Molecular Signaling. 4, 2-2 (2009).</li><li>Dixon, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytoestrogens.">Phytoestrogens.</a> Annual Review of Plant Biology. 55, (2004).</li><li>Kuiper, G. G. J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+Estrogenic+Chemicals+and+Phytoestrogens+with+Estrogen+Receptor+&#946;.">Interaction of Estrogenic Chemicals and Phytoestrogens with Estrogen Receptor &#946;.</a> Endocrinology. 139 (10), 4252-4263 (1998).</li><li>Wasserman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Feeding on Phytoestrogens: Implications of Estrogenic Plants for Primate Ecology. , (2011).</li><li>Jefferson, W. N., Patisaul, H. B., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reproductive+consequences+of+developmental+phytoestrogen+exposure.">Reproductive consequences of developmental phytoestrogen exposure.</a> Reproduction. 143 (3), 247-260 (2012).</li></ol>

وERβ مقايسة مراسل وضعت لفحص فردي وكلاء الأدوية هي أيضا مناسبة لفحص الأغذية النباتية ل phytoestrogens النشطة بيولوجيا من خلال ERβ. وتشمل الاعتبارات الهامة في البروتوكول معالجة عينات النباتات بعناية: المواد النباتية الطازجة تحتاج إلى تجفيف بسرعة لمنع صب أو التحلل البيولوجي الأخرى، وأنه يحتاج إلى أ...

النباتات هي مصدر ضروري للغذاء لكثير من الحيوانات، وتوفير السعرات الحرارية والمواد المغذية الحاسمة للبقاء على قيد الحياة، والتكاثر، والنمو، والتنمية، والسلوك1. تنتج النباتات الآلاف من المواد الكيميائية، وكثير منها كتكييفات لنموها الخاص، والصيانة التناسخية، والتكاثر. مركبات أخرى, يعتبر الأيض النباتية الثانوية (PSMs), لها وظائف أقل وضوحا, على الرغم من أن بعض سامة ومن المرجح أن تستخدم كدفاع ضد شعيرات وتطفلية (على سبيل المثال, قلويدات, العفص)2,3. بعض هذه المواد الكيميائية لديها القدرة على التأثير على العمليات الفسيولوجية على المدى الطويل في الحيوانات، مثل وظائف الغدد الصماء، على الرغم من أن السبب في هذه المواد الكيميائية النباتية النشطة الغدد الصماء تتفاعل مع نظام الغدد الصماء الفقاريات لا يزال غير واضح2،4.
Phytoestrogens، الأكثر دراسة جيدا الغدد الصماء النشطة المواد الكيميائية النباتية، هي PSMs بوليفينوليك التي تحاكي هيكليا ووظيفيا الاستروجين، والتفاعل مباشرة مع محور gonadal تحت النخامية تحت النخامية من نظام الغدد الصماء الفقارية5. ابتلاع فيتويستروغنز في النظام الغذائي البشري يرتبط مع الحماية ضد بعض أنواع السرطان, أمراض القلب, وأعراض انقطاع الطمث, على الرغم من آثار أخرى تشمل مشاكل الخصوبة. في الواقع، تم اكتشاف الآثار الفسيولوجية لهذه المركبات في 1940s عندما العقم في الأغنام كان يعزى إلى رعيهم على البرسيم النباتي الغني(Trifolium subterrareum)6. عند تناولها، يمكن أن تنتقل فيتويستروغنز إلى الخلايا وتقليد آثار هرمون الاستروجين. في حين أن فيتويستروغنز له آثار سلبية على خصوبة الأغنام، والعلاقة بين فيتويستروغنز وعلم وظائف الأعضاء ليست بسيطة. مثل الأغنام، يظهر وحيد القرن الأبيض الجنوبي حساسية للمركبات الإستروجينية في الأعلاف المشتقة من كميات عالية من الصويا والبرسيم. بنات الإناث تغذية هذا النظام الغذائي أثناء الحمل هم أقل عرضة للتكاثر7. ومع ذلك، فقد أظهرت دراسات أخرى أن فيتويستروغنز قد يكون لها آثار إيجابية كذلك، بما في ذلك نضوج بصيلات المبيض في الفئران القديمة8، والوقاية من بعض أنواع السرطان، والنشاط المضادة للأكسدة، وآثار مضادة للبروبروليفية9.
اتساع آثار فيتويستروغنز ليست مفاجئة نظرا لأن هرمون الاستروجين تؤثر على مجموعة واسعة من الوظائف البيولوجية, بما في ذلك النمو, التنمية, وتنظيم الجهاز العصبي الإنجابية والمركزية10. على الرغم من أن هناك العديد من آليات العمل, فيتويستروغنز غالبا ما يكون القدرة على تعديل, تعزيز, أو تعطيل إشارات هرمون الاستروجين من خلال قدرتها على العمل كيغاندس لمستقبلات هرمون الاستروجين داخل النواة ألفا وبيتا (ERα وERβ). العديد من فيتويستروغنز لديها بنية حلقة فينولية مماثلة لهرمون الاستروجين الذي يسمح لهم لربط مستقبلات هرمون الاستروجين. أولئك الذين لديهم وظيفة النشاط الاستروجيني ناهض مثل هرمون الاستروجين، وتشكيل تنشيط ER-ligand المعقدة التي يمكن أن يمتم ربطها عنصر استجابة هرمون الاستروجين (ERE) وتحريك النسخ الجيني11. وهكذا، هرمون الاستروجين وفيتويستروغنز تنظيم نشاط الخلية ووظائف النظام من خلال أعمالهم كعوامل النسخ.
هنا نقدم استخدام رواية من الخلية القائمة على مقايسة لفحص المستخلصات النباتية لوجود المركبات التي استروجين النشاط البيولوجي. يستخدم هذا الفحص الخلايا الصينية الصينية CHO المبيض الهامستر المهندسة لERβ التعبير عن للغاية, التي تم transed مع اليراعات (Photinus pyralis) لوسيفيراز جين مرتبطة المروج ERE12. عندما تكون المركبات الإستروجين موجودة، فإنها ترتبط إلى ER، يمرم، وربط إلى ERE، مما يؤدي إلى نسخ الجين luciferase. عند إضافة محلول الركيزة ، يحفز luciferase رد فعل يؤدي إلى انبعاث الفوتون. ولذلك، تعطي عينات إيجابية عينات الضوء والسلبية لا.
هذا المقايسة المتاحة تجاريا يلغي الحاجة إلى مختبرات نقل الخلايا الثديية مع مستقبلات الجينات والإستروجين مراسل13,14, الذي كان غير مستقر ومتغير في فعالية. يوفر المقايسة منصة مستقرة transfection التي تسمح بسرعة وببساطة تحديد ما إذا كان المصنع لديه نشاط استروجين عبر مستقبلات ملزمة.
نحن اختبار فرضية أن فول الصويا لديها نشاط استروجين أعلى من جميع الأطعمة الأخرى نظرا لتركيزات معروفة من الإيسوفلافوناتإستروجين 15 باستخدام الأطعمة البشرية من البقالين المحليين.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:721px;" width="722">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">1000 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:308px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">20 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">200 &#181;L pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">37 &#8451; water bath</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:215px;">37 &#8451;, humidified 5% CO2 incubator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">70% ethanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">analytical balance</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:215px;">cell culture-rated laminar flow hood</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">dimethyl sulfoxide</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">disposable media basin, sterile</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">drip filtration system</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Erlenmeyer flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>125 mL and 250 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">HPLC grade methanol</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">Human ER&#946; Reporter Assay System, 1 x 96-well format assays</td>
			<td style="width:80px;">Indigo Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">IB00411</td>
			<td>Assay kit - analyzes 24 samples plus standard curve</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">lyophilizer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">multi-channel pipette</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">orbital shaker</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">plate-reading luminometer</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>ex. Bioteck Synergy HTX</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">rotory evaporator</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">round bottom flasks</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>50 mL and 300 mL</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:215px;">sterile microcentrifuge tubes or sterile multi-channel media basins</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">sterile tips</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>200 &#181;L and 1000 &#181;L</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">Whatman grade 1 paper</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:215px;">whirl-pak bags</td>
			<td style="width:80px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>sterile polyethylene bags</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

screening for phytoestrogens using a cell-based estrogen receptor  &#946; reporter assay

النباتات هي مصدر للغذاء لكثير من الحيوانات، وأنها يمكن أن تنتج الآلاف من المواد الكيميائية. بعض هذه المركبات تؤثر على العمليات الفسيولوجية في الفقاريات التي تستهلك لهم، مثل وظيفة الغدد الصماء. Phytoestrogens، الأكثر دراسة جيدا الغدد الصماء النشطة المواد الكيميائية النباتية، تتفاعل مباشرة مع محور gonadal تحت الغدة النخامية hypothalamo من نظام الغدد الصماء الفقاريات. هنا نقدم استخدام رواية من الخلية القائمة على مقايسة لفحص المستخلصات النباتية لوجود المركبات التي استروجين النشاط البيولوجي. يستخدم هذا الفحص خلايا الثدييات المهندسة للتعبير عن مستقبلات الإستروجين (ERβ) التي تم نقلها مع جين luciferase. التعرض للمركبات مع النشاط الاستروجيني النتائج في الخلايا المنتجة للضوء. هذا الفحص هو وسيلة موثوقة وبسيطة لاختبار النشاط استروجين البيولوجية. لديها العديد من التحسينات على مقايسات عابرة عابرة، وأبرزها، سهولة الاستخدام، واستقرار الخلايا، وحساسية من الفحص.

تم فحص 22 مقتطفات من الفواكه والخضروات الموجودة عادة في الوجبات الغذائية البشرية لوجود مركبات استروجين. تم فحص مجموعة متنوعة من الأطعمة، بما في ذلك البقوليات، مثل فول الصويا والبازلاء الثلجية والبازلاء المفاجئة، حيث أن عائلة البازلاء هي مصدر معروف للـ phytoestrogens16، وكذلك التين ?...

Watch this Scientific Journal Video about Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  Î² Reporter Assay at JoVE.com

Screening for Phytoestrogens using a Cell-based Estrogen Receptor  &#946; Reporter Assay

لقد قمنا بتحسين مستقبلات هرمون الاستروجين المتاحة تجاريا β مقولي فحص الأطعمة الرئيسية البشرية وغير البشرية لنشاط إستروجين. نحن التحقق من صحة هذا الفحص من خلال إظهار أن الغذاء البشري استروجين معروف فول الصويا يسجل عالية، في حين أن الأطعمة الأخرى تظهر أي نشاط.

فحص Phytoestrogens باستخدام مستقبلات الاستروجين القائم على الخلية β مراسل Assay

Plants are a source of food for many animals, and&#160;they can produce thousands of chemicals. Some of these compounds affect physiological processes in ...

We use this assay to assess whether plant foods contain phytosteriods, which can affect physiological processes in animals, as well as behavior and reproductive success. This assay provides a simple and reliable method for determining whether plants produce estrogenic compounds with biological activity. This method was developed initially to screen drugs with xenoestrogen activity for applications in medicine.For example, inhibiting cell proliferation. We are using it to provide insight into primate ecology and evolution. It is important to have practice working with aseptic technique in a clean environment prior to attempting this assay, as it is very sensitive to contamination.Begin by freeze-drying the fresh plant items with the lyophilizer, then finely grind them using a grinding mill with a 0.85 millimeter mesh screen. Store the ground samples in bags in the dark until extraction. To extract any potential phytosteroids in the plants, add dried sample to an appropriately sized flask, then at HPLC grade methanol.Cover the plant methanol solution with aluminum foil and set it to rotate at 100 RPM for three days on an orbital shaker. After three days, use filter paper to decant the supernate and into a drip filtration system. Dry the plant extract with a rotary evaporator until it is thickened, but pourable in a 300 milliliter round bottom flask.Pour the sample into a 50 milliliter flask and rinse the large flask with a small amount of methanol, then continue to dry the sample in the small flask until the methanol is completely evaporated. When finished, weigh the sample residue with an analytical balance and record the mass. Dissolve the plant extract in DMSO at a concentration of 0.1 gram of extract to two milliliters of DMSO and vortex it until homogenized.DMSO is not toxic on its own, but it is a vehicle that allows other substances to cross membranes. Since we do not know if our plants contain toxic chemicals, all are treated as if they're hazardous. Do not allow the solution to touch skin, replace gloves if contaminated, and wear thick, close-toed shoes and lab coats.Store the sample at four degrees Celsius in amber glass vials until ready to use. Vortex the samples, then add four microliters of each sample to 496 microliters of compound screening medium to yield a 0.8%DMSO solution. Disinfect the outside surface of a pre-warmed cell recovery medium tube with 70%ethanol and transfer 10 milliliters of the medium into a tube of frozen reporter cells to thaw them.Close the tube of reporter cells and place it in a 37 degrees Celsius water bath for five to 10 minutes. After retrieving the cells from the water bath, gently invert the tube several times to break up aggregates of cells and produce a homogenous suspension, then clean the surface of the tube with 70%ethanol. Use a multi-channel pipette to dispense 100 microliters of the reporter cell suspension into each well of a 96 well plate, then dispense 100 microliters of samples in triplicate into the appropriate wells.Incubate the plate at 37 degrees Celsius and 5%carbon dioxide for 22 to 24 hours. Just prior to the end of the plate incubation remove detection substrate and detection buffer from the refrigerator and place them in a low light area until equilibrated to room temperature, then gently invert each tube to mix the solutions. Immediately before the plate incubation is complete, pour the entire contents of the detection buffer into the tube of detection substrate to create luciferase detection reagent.Mix the tube gently so as not to produce foam. Discard the contents of the sample plate into inappropriate waste container and gently tap it on a clean absorbent paper towel to remove the last droplets from the wells. Add 100 microliters of the luciferase detection reagent to each well and allow the assay plate to rest at room temperature for 15 minutes, then quantify the luminescence using a 96 well plate reading luminometer.22 extracts of fruits and vegetables commonly found in human diets were screened for the presence of estrogenic compounds. Estrogenic activity is presented in an ordinal qualitative manner of high, medium, low, or no activity. Organic and non-organic soybeans screened at high levels of activity, while all other fruit and vegetable items registered no activity.Comparing soybean results to the standard curve also shows that they have high estrogenic activity levels at this concentration. Soybean extract, a known potent source of the isoflavones, daidzein and genistein, was further used to determine the dilution yielding a 50%signal to the maximum. This extract requires 422 times more dilution to produce half the signal of our standard dilution protocol.Samples identified with activity could be sent for analysis by mass spectrometry to identify the active chemicals. Using an antagonist method, we could also determine if the plant food contains chemicals that reduce the binding and activity of endogenous estrogens. This technique allows us to further our understanding of how prevalent estrogenic foods are in primate diets, as well as how consumption of phytoestrogens affects physiology and behavior when the assay is combined with fecal hormone analyses and field data.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

High-throughput Screening of Carbohydrate-degrading Enzymes Using Novel Insoluble Chromogenic Substrate Assay Kits

فحص الإنتاجية العالية من الكربوهيدرات المهينة الانزيمات عن طريق رواية غير قابل للذوبان اللونية الركيزة الفحص أطقم

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper ...

Bacterial Inner-membrane Display for Screening a Library of Antibody Fragments

العرض الداخلية غشاء البكتيريا لفحص مكتبة من الأجسام المضادة شظايا

Antibodies engineered for intracellular function must not only have affinity for their target antigen, but must also be soluble and correctly folded in ...

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

A Simple Method for High Throughput Chemical Screening in Caenorhabditis Elegans

طريقة بسيطة لفحص المواد الكيميائية عالية الإنتاجية في ايليجانس كاينورهابديتيس

Caenorhabditis elegans is a useful organism for testing chemical effects on physiology. Whole organism small molecule screens offer significant advantages ...

Extracellular Protein Microarray Technology for High Throughput Detection of Low Affinity Receptor-Ligand Interactions

البروتين خارج الخلية ميكرواري تكنولوجيا للكشف عن ارتفاع الإنتاجية منخفضة تقارب مستقبلات-يجند التفاعلات

Secreted factors, membrane-tethered receptors, and their interacting partners are main regulators of cellular communication and initiation of signaling ...

An In Vivo Estrogen Deficiency Mouse Model for Screening Exogenous Estrogen Treatments of Cardiovascular Dysfunction After Menopause

A في فيفيفو نقص الإستروجين نموذج الماوس لفحص علاجات الإستروجين الخارجية من خلل القلب والأوعية الدموية بعد انقطاع الطمث

Postmenopausal women are at greater risk of developing cardiovascular diseases than premenopausal women. Female mice ovariectomized (OVX) at weaning ...

Kinetic Screening of Nuclease Activity using Nucleic Acid Probes

الفحص الحركي للنشاط النواسي باستخدام مجسات الحمض النووي

Nucleases are a class of enzymes that break down nucleic acids by catalyzing the hydrolysis of the phosphodiester bonds that link the ribose sugars. ...

A Semi-High-Throughput Adaptation of the NADH-Coupled ATPase Assay for Screening Small Molecule Inhibitors

تكييف شبه عالي الإنتاجية لفحص ATPase المقترن بـ NADH لفحص مثبطات الجزيئات الصغيرة

ATPase enzymes utilize the free energy stored in adenosine triphosphate to catalyze a wide variety of endergonic biochemical processes in vivo that would ...

Visualization of Estrogen Receptors in Colons of Mice with TNBS-Induced Crohn's Disease using Immunofluorescence

تصور مستقبلات هرمون الاستروجين في كولونات الفئران مع مرض كرون TNBS الناجم ة باستخدام الفلورسينالمناعي

Crohn&#39;s disease is the most diagnosed type of inflammatory bowel disease. Chronic inflammation developing in the intestine leads to peristalsis ...

Parallel Interrogation of &#946;-Arrestin2 Recruitment for Ligand Screening on a GPCR-Wide Scale using PRESTO-Tango Assay

استجواب مواز لـ α-Arrestin2 تجنيد لـ Ligand الفحص على نطاق GPCR على نطاق واسع باستخدام PRESTO-Tango assay

As the largest and most versatile gene superfamily and mediators of a gamut of cellular signaling pathways, G-protein-coupled receptors (GPCRs) represent ...

NMR-Based Fragment Screening in a Minimum Sample but Maximum Automation Mode

فحص الأجزاء القائم على الرنين المغناطيسي النووي في الحد الأدنى من العينة ولكن وضع الأتمتة الأقصى

Fragment-based screening (FBS) is a well-validated and accepted concept within the drug discovery process both in academia and industry. The greatest ...