تم دعم هذا العمل بمنح من Wellcome Trust (091549 إلى SG و 109093 / Z / 15 / A إلى SM) ، ومركز Wellcome Trust للمنحة الأساسية لبيولوجيا الخلية (092076) وزمالة البحوث العليا غير السريرية لمجلس البحوث الطبية (MR / R008205 / 1 إلى SG) ، المنظمة الأوروبية للبيولوجيا الجزيئية في إطار زمالة ما بعد الدكتوراه طويلة الأجل (ALTF 1070-2017 إلى R.A.C) ، وصندوق البحوث المستقل في الدانمرك (T.H.J).

ينتمي A. Langford و W. Worboys إلى UVO3 ، وهي شركة تجارية. لم يكن لهم أي دور في تصميم الدراسة أو جمع البيانات وتفسيرها أو قرار تقديم العمل للنشر.

تتمتع طريقة χCRAC ، جنبا إلى جنب مع أجهزة الربط المتقاطع وحصاد الخلايا الجديدة ، بإمكانات كبيرة لأنها قابلة للتطبيق على مجموعة واسعة من الكائنات النموذجية ، وبالتالي يجب أن تكون ذات أهمية عامة لمجال الحمض النووي الريبي. هناك العديد من المجالات التي يمكن فيها استخدام χCRAC. على سبيل المثال ، يمكن استخدام الطريقة لقياس التجمع الهرمي للبروتينات في معقدات جزيئية كبيرة ، مثل spliceosome والريبوسوم ، والتي غالبا ما تتضمن تفاعلات ديناميكية بين البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي. كما نستخدمه الآن بشكل روتيني لمراقبة التفاعلات بين عوامل اضمحلال الحمض النووي الريبي وركائزها عندما تتعرض الخلايا لأنواع متنوعة من الضغوط. وهذا يمكننا من تحديد مرحلة الاستجابة التكيفية الأكثر نشاطا لهذه العوامل، والركائز التي ترتبط بها، ومدى ديناميكية هذه التفاعلات. وينبغي أن تمكن هذه البيانات الباحثين من تحديد المساهمة النسبية لكل عامل في التكيف مع التغيرات البيئية.
يستخدم χCRAC علامات تنقية التقارب المزدوج (HTF أو HTP) لتنقية البروتين في ظل ظروف صارمة للغاية وتغيير طبيعة المرض. هذا يضمن أن الحمض النووي الريبي المنقى عالي التخصيب للحمض النووي الريبي الذي كان مرتبطا تساهميا بالبروتين محل الاهتمام. ومع ذلك ، فإن الاعتماد على علامات التقارب له عيوب. على سبيل المثال ، يمكن أن تتداخل العلامة مع وظيفة البروتين ، مما قد يعطي قراءة مشوهة لتفاعل ربط الحمض النووي الريبي. بالإضافة إلى ذلك ، بالنسبة لبعض الكائنات الحية النموذجية ، قد لا يكون من الممكن دائما استخدام العلامات لأن الأدوات الجينية لدمج شظايا الحمض النووي في الجينوم أو لتحويل بلازميدات التعبير ليست متاحة بعد. ومع ذلك ، من السهل تغيير بعض أجزاء بروتوكول χCRAC لجعله متوافقا مع البروتوكولات المستندة إلى CLIP التي تعتمد على الأجسام المضادة لتنقية RBP. في الواقع ، أظهرت هذه الدراسة أنه من الممكن الجمع بين عمليات التنقية المستندة إلى iCLIP مع الرابط المتشابك الخاص بنا. نحن الآن بصدد تطوير بروتوكولات CLIP لدراسة الارتباط الزمني للبروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي البشري مع نسخ الحمض النووي الريبي الوليدة.
عند إجراء χCRAC على بروتين جديد ، يجب تحسين التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل إحداث أقصى قدر من الربط المتقاطع. هذا مهم لأن التعرض العالي للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن يقلل من استعادة الحمض النووي الريبي أثناء خطوة التنقية. تعرضت الخلايا التي تعبر عن RBP المؤتلف لجرعات مختلفة من الأشعة فوق البنفسجية ، 100 مللي جول / سم 2 ، 250 مللي جول / سم 2 ، 500 مللي جول / سم 2 ، و 1 جول / سم 2. ثم تم التقاط RNPs وتم تجزئة الحمض النووي الريبي وتمييزه إشعاعيا. بعد ذلك ، تم حل RNPs بواسطة SDS-PAGE وتم أخذ مخطط إشعاعي ذاتي من أجل استنتاج التعرض الذي أعطى الإشارة الأكثر كثافة (أي الارتباط المتقاطع الأقصى).
بمجرد تحسين الظروف التجريبية ، يوصى بإجراء العديد من تجارب التحكم عند إجراء χCRAC. أولا ، يمكن استخدام عينة مشعة بالأشعة فوق البنفسجية وغير موسومة لمراقبة ارتباط الخلفية بخرز التنقية. ثانيا ، عند تطبيق χCRAC أثناء تجربة التحول ، فإن سلسلة زمنية ثانية حيث يتم نقل الخلايا مرة أخرى إلى الوسط الأصلي تمكن من التحقيق فيما إذا كان ترشيح الخلايا نفسها يؤدي إلى تغييرات في مستويات الحمض النووي الريبي أو تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي.
كما هو مذكور في المقدمة ، تقترح العديد من الأوراق المنشورة مؤخرا عددا من التحسينات على بروتوكول CLIP. يتضمن ذلك استخدام محولات ذات علامات فلورية للكشف عن مركب البروتين والحمض النووي الريبي من خلال المسح بالأشعة تحت الحمراء10 بالإضافة إلى التحسينات على مختلف خطوات تنقية الحمض النووي واختيار الحجم التي تظهر لزيادة تعقيد المكتبات الناتجة12,45. نقوم حاليا بتنفيذ بعض هذه التحسينات لزيادة تحسين بروتوكول χCRAC. يحتوي البروتوكول المقدم هنا بالفعل على عدد من التحسينات على بروتوكولات CRAC و χCRAC الأصلية التي تزيد من تعقيد البيانات. على سبيل المثال ، في السابق ، بعد حل مجمعات الحمض النووي الريبي للبروتين المشع المتشابكة على المواد الهلامية SDS-PAGE ، تم نقلها إلى غشاء النيتروسليلوز وتم عزل الحمض النووي الريبي المتقاطع من اللطخة. ومع ذلك ، فإن نقل RNP واستخراج الحمض النووي الريبي اللاحق يمكن أن يكون غير فعال للغاية ، لا سيما عند التعامل مع كرات الدم الحمراء الكبيرة مثل الوحدات الفرعية لبوليميراز الحمض النووي الريبي. هذا يمكن أن يؤدي إلى انخفاض كبير في استعادة الحمض النووي الريبي عبر الارتباط. في البروتوكول الحالي ، يتم استخراج الحمض النووي الريبي المتقاطع مباشرة من شرائح هلام SDS-PAGE كما هو موضح في الشكل 1. هذا زاد من استعادة الحمض النووي الريبي عبر الارتباط. بالإضافة إلى ذلك ، بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل ل cDNAs ، تم حل المنتج في الأصل على 3٪ ، وهلام الأغاروز بدرجة حرارة انصهار منخفضة ، ثم تم استخراج منتجات PCR 175-300 bp من الجل. ومع ذلك ، يمكن تحميل هذه المواد الهلامية بسهولة ، مما يؤدي إلى فصل ضعيف للغاية للحمض النووي. أدى استبدال جل الأغاروز بجل TBE مسبق الصب إلى فصل حجم أكثر اتساقا واستعادة أفضل لمنتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

غالبا ما تعتمد الحمض النووي الريبي على كرات الدم الحمراء لممارسة وظيفتها ، مما أدى إلى اهتمام كبير بفهم الديناميات بين هذه الجزيئات. تم تحديد العديد من الممارسات التجارية التقييدية في مجموعة واسعة من الكائنات الحية. ومع ذلك ، كان من الصعب دائما دراسة تفاعلات RBP-RNA في الجسم الحي. جاء اختراق كبير في دراسة مثل هذه التفاعلات مع ظهور CLIP1. تستخدم هذه الطريقة الأشعة فوق البنفسجية (الأشعة فوق البنفسجية ، 254 نانومتر) للحث على الروابط التساهمية بين كرات الدم الحمراء والحمض النووي الريبي المرتبط بها مباشرة (أي الربط المتقاطع بدون مسافة). بعد ذلك ، يتم تنقية RBP ذات الأهمية في ظل ظروف صارمة لضمان تحديد الحمض النووي الريبي فقط المرتبط تساهميا بالبروتينات. ثم يتم هضم الحمض النووي الريبي المرتبط جزئيا باستخدام RNases ثم تحويله لاحقا إلى مكتبات cDNA للتسلسل. تعد صرامة التنقية العالية مهمة لأنها تزيد بشكل كبير من خصوصية استعادة البروتين والحمض النووي الريبي ، والتي يتم تعزيزها أيضا من خلال تنقية SDS-PAGE لمركب البروتين النووي الريبي المتصالب (RNP). يوفر CLIP والطرق ذات الصلة أيضا نظرة ثاقبة لدقة النوكليوتيدات في موقع ارتباط البروتين ، لأنه أثناء إعداد مكتبة التسلسل ، فإن الأحماض الأمينية المرتبطة بالحمض النووي الريبي تنهي بشكل متكرر النسخ العكسي أو تتسبب في قيام الإنزيم بإدخال طفرات في هذا الموقع1،2،3.
منذ تقديمه ، أنتج بروتوكول CLIP الأصلي مجموعة متنوعة رائعة من المنهجيات المشتقة. جاء اختراق مهم بشكل خاص مع تطوير HITS-CLIP (أو CLIP-seq) ، والذي يدمج التسلسل عالي الإنتاجية مع نهج CLIP3. وقد تم اعتماد هذا منذ ذلك الحين من قبل جميع المنهجيات القائمة على CLIP. أدخلت iCLIP تحسينات في تقنيات التشذيب وربط المحول بوساطة RNase التي تسهل رسم خرائط أكثر دقة لمواقع ربط RBP4. يجمع PAR-CLIP بين وضع العلامات 4thio-uridine / uracil مع الربط المتقاطع عند 365 نانومتر ، مما يجعل من الممكن تعيين مواقع الربط المتقاطع من خلال تحليل بدائل T-C5. قدم CRAC و urea-iCLIP و dCLIP و uvCLAP ظروف تغيير طبيعة وخطوات تنقية مزدوجة التقارب تقلل من ارتباط الخلفية براتنج التقارب وتزيد من خصوصية التقاط البروتين2،6،7،8،9. بالإضافة إلى ذلك ، قدم CRAC و uvCLAP و dCLIP وضع علامات على RBP محل الاهتمام بعلامة تقارب ، وبالتالي التغلب على الحاجة إلى توليد أجسام مضادة محددة.
كما تم إجراء العديد من التحسينات لتسريع منهجية CLIP. استخدم بروتوكول CLIP الأصلي وضع العلامات الإشعاعية على الحمض النووي الريبي الملتقط من أجل تصور معقدات RBP-RNA بعد SDS-PAGE. ومع ذلك ، يمكن أن يكون استخدام النشاط الإشعاعي مشكلة بالنسبة للمختبرات التي لم يتم إنشاؤها لمثل هذا العمل. يشتمل irCLIP على محول مقترن بالفلوروفور يسهل التصور من خلال التصوير بالأشعة تحت الحمراء10 ويستخدم sCLIP البيوتينيل للحمض النووي الريبي الملتقط من أجل تصورها من خلال HRP11 المترافق بالستربتافيدين . علاوة على ذلك ، يتخلى eCLIP تماما عن وضع العلامات على الحمض النووي الريبي ؛ بدلا من ذلك ، يتم استئصال البروتين بناء على حجمه المعروف12 فقط. كما تم استخدام التنقية القائمة على الستربتافيدين لتسريع عملية إعداد المكتبة في FAST-iCLIP ، حيث يتم ربط محول 3 'بيوتينيل على الحمض النووي الريبي ويستخدم لتمكين التنقية بعد النسخ العكسي والتعميم13. كما أدت التحسينات الإضافية لبروتوكول iCLIP إلى زيادة تعقيد المكتباتبشكل كبير 4.
أخيرا ، تم تعديل CLIP لتمكين التقاط كرات الدم الحمراء من مقصورات فرعية خلوية مختلفة 14,15 ، لتصور الحمض النووي الريبي المنسوخ حديثا باستخدام الحث النبضي للريبونوكليوسيدات القابلة للتنشيط الضوئي5،16،17 ، لالتقاط الحمض النووي الريبي الميثيلي18،19،20 ، لفحص تفاعلات الحمض النووي الريبي - الحمض النووي الريبي 21,22 ، ولتعيين 3' ينتهي 23,24.
على الرغم من المساهمات الكبيرة للتقنيات القائمة على CLIP في مساعدتنا على فهم التفاعلات بين RBPs و RNAs ، فقد تم تقييدها بسبب عدم كفاءة الربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية. على الرغم من أن الخلايا المستزرعة المزروعة في طبقة أحادية يسهل ربطها نسبيا بشكل عام ، إلا أن هذا يمثل تحديا أكبر بكثير في الأنسجة أو الخلايا الموجودة في المحلول. يمكن أن تتطلب الأنسجة جولات متعددة من التعرض للأشعة فوق البنفسجية من أجل اختراق طبقات الخلايا المطلوبة ، بينما غالبا ما تزرع الخلايا الميكروبية في وسائط غنية تحتوي على مركبات عطرية تمتص الأشعة فوق البنفسجية25. في الواقع ، تم استخدام أوقات تشعيع الأشعة فوق البنفسجية التي تصل إلى 30 دقيقة لتوليد ربط متقاطع كاف بين RBPs والحمض النووي الريبي المرتبط بها لمثلهذه العينات 26،27،28. يؤدي هذا التعرض الممتد للأشعة فوق البنفسجية إلى استجابات الإجهاد داخل الخلية ، مثل تلف الحمض النووي الناجم عن الأشعة فوق البنفسجية ، والذي يمكن أن يلوث البيانات النهائية في بعض التطبيقات.
ركزت غالبية دراسات CLIP على توليد "لقطات" مفردة لتفاعلات معينة بين البروتين والحمض النووي الريبي في الخلية. ومع ذلك ، فإن تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي ديناميكية بطبيعتها ، خاصة عندما تكون الخلايا عرضة للتغيرات في بيئتها. يمكن أن يشمل ذلك انخفاضا مفاجئا في توافر العناصر الغذائية الأساسية أو التغيرات السريعة في درجة الحرارة. على هذا النحو ، لفهم دور RBP حقا أثناء الإجهاد ، من الأفضل إجراء تحليلات تم حلها بمرور الوقت لأنها يمكن أن تلتقط مجموعة كاملة من أهداف RBP أثناء الإجهاد وتحديد في أي مرحلة من الاستجابة للإجهاد يكون RBP المختار نشطا. على وجه الخصوص ، أظهرت الدراسات التي أجريت على الخميرة أن الدقائق القليلة الأولى من التكيف حاسمة للغاية للبقاء على قيد الحياة ويمكن أن يختلف نصف عمر الحمض النووي الريبي في البكتيريا من دقائق إلى ثوان29،30،31،32،33. ولذلك، ينبغي أن تجرى هذه التحليلات التي تم حلها زمنيا بدقة زمنية عالية. ومع ذلك ، فإن أوقات الترابط الطويلة تجعل دراسة الاستجابات التكيفية في المرحلة المبكرة صعبة بشكل خاص.
من أجل التغلب على هذه المشكلات ، قمنا مؤخرا بتطوير طريقة محسنة قادرة على ربط الخلايا وحصادها على نطاقات زمنية مدتها دقائق. تسمح طريقة χCRAC الخاصة بنا بالقياس الكمي للتغيرات الديناميكية في تفاعلات RBP-RNA بدقة لم يسبق لها مثيل. كان من الأهمية بمكان في هذه الطريقة تطوير جهاز تشعيع جديد للأشعة فوق البنفسجية32 يقلل من وقت الربط المتقاطع المطلوب في الخميرة والبكتيريا في المحلول حوالي 10 أضعاف ، مما يؤدي إلى تجميد تفاعلات RBP-RNA بشكل فعال على الفور. بالإضافة إلى ذلك ، من أجل حصاد الخلايا بسرعة بعد الأشعة فوق البنفسجية ، قمنا بتطوير جهاز ترشيح فراغي يمكنه حصاد الخميرة المتنامية بشكل كبير في مزرعة 0.5 لتر في حوالي 30 ثانية32. تسمح هذه الابتكارات التكنولوجية بدراسة ديناميكيات RBP-RNA بدقة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، قدمنا أيضا العديد من التحسينات على بروتوكول CRAC2 الأصلي من أجل زيادة عمليته.
باستخدام χCRAC ، درسنا مؤخرا الهدف من الخميرة النووية RBP ، Nab3 ، استجابة للحرمان من الجلوكوز. في Saccharomyces cerevisiae ، يمكن أن يشكل Nab3 معقدا مع Nrd1 ، و RBP ، و RNA helicase Sen1 لتشكيل مجمع NNS. يمكن أن يؤدي ارتباط NNS ببوليميراز الحمض النووي الريبي والنسخة الوليدة إلى إنهاء النسخ34. يشارك هذا المركب في الغالب في إزالة نسخ الحمض النووي الريبي المشفرة غير المشفرة ولكن ثبت أيضا أنه ينظم التعبير عن الجينات المشفرة للبروتين. أظهرت الدراسة الاستهداف التفاضلي ل Nab3 إلى النصوص غير المشفرة والترميز بعد دقيقة واحدة فقط من الإجهاد32. لقد أثبتنا أن الإنهاء المشترك للنسخ بواسطة Nab3 ينتج عنه تعبير عابر للغاية يشبه النبض لجينات retrotransposon ، والتي كان من الصعب اكتشافها باستخدام الأساليب التقليدية القائمة على CLIP. بالإضافة إلى ذلك ، فإن أوقات تشعيع الأشعة فوق البنفسجية القصيرة في الرابط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية لدينا زادت أيضا بشكل كبير من استعادة الحمض النووي الريبي غير المشفر قصير العمر32. من المحتمل أن تكون CRAC أداة حاسمة في توضيح ليس فقط كيف تشكل الممارسات التجارية التقييدية الاستجابة للإجهاد على الجداول الزمنية الفورية ولكن أيضا أدوارها المتغيرة خلال دورة حياة الاستجابة بأكملها. تقدم هذه المخطوطة نظرة عامة مفصلة على جميع الخطوات في بروتوكول χCRAC. لأغراض توضيحية ، تم استخدام الطريقة لدراسة بروتين الخميرة Nrd1 ، الذي يشارك في إنهاء النسخ وتحلل الحمض النووي الريبي35,36 ، وهدف الحمض النووي الريبي الخاص به استجابة للحرمان من الجلوكوز عبر العديد من النقاط الزمنية. أخيرا ، نوضح أيضا أن وحدة الأشعة فوق البنفسجية الخاصة بنا يمكنها ربط كرات الدم الحمراء بسرعة بالحمض النووي الريبي في خلايا هيلا ، مما يجعل من الممكن أيضا إجراء تحليلات عالية الدقة لحل الوقت في الخلايا الملتصقة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

التفاعل بين البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) وركائز الحمض النووي الريبي الخاصة بهم يظهر سيولة وتعقيد. خلال فترة حياته ، يمكن ربط الحمض النووي الريبي الواحد بالعديد من RBPs المختلفة التي ستنظم إنتاجه واستقراره ونشاطه وتدهوره. على هذا النحو ، تم عمل الكثير لفهم الديناميكيات الموجودة بين هذين النوعين من الجزيئات. جاء اختراق مهم بشكل خاص مع ظهور "cross-l intombation و immunoprecipitation" (CLIP). سمحت هذه التقنية بإجراء تحقيق صارم في أي الحمض النووي الريبي مرتبط ب RBP معين. باختصار ، البروتين محل الاهتمام هو الأشعة فوق البنفسجية المرتبطة بركائز الحمض النووي الريبي في الجسم الحي ، ويتم تنقيتها في ظل ظروف صارمة للغاية ، ثم يتم تحويل الحمض النووي الريبي المرتبط تساهميا بالبروتين إلى مكتبات cDNA وتسلسلها. منذ إنشائها ، تم تطوير العديد من التقنيات المشتقة من أجل جعل CLIP قابلة لمجالات معينة من الدراسة. ومع ذلك ، فإن الربط المتقاطع باستخدام الأشعة فوق البنفسجية غير فعال بشكل معروف. ينتج عن هذا أوقات تعرض ممتدة تجعل الدراسة الزمنية لتفاعلات RBP-RNA مستحيلة. للتغلب على هذه المشكلة ، قمنا مؤخرا بتصميم وبناء أجهزة محسنة للأشعة فوق البنفسجية وحصاد الخلايا. باستخدام هذه الأدوات الجديدة ، قمنا بتطوير بروتوكول للتحليلات التي تم حلها زمنيا لتفاعلات RBP-RNA في الخلايا الحية بدقة زمنية عالية: ربط CRoss الحركي والتحليل Aللحمض النووي c(χCRAC). استخدمنا هذه التقنية مؤخرا لدراسة دور الخميرة RBPs في التكيف مع الإجهاد الغذائي. تقدم هذه المخطوطة نظرة عامة مفصلة على طريقة χCRAC وتعرض النتائج الحديثة التي تم الحصول عليها باستخدام Nrd1 RBP.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

الربط المتقاطع الحركي وتحليل cDNA هو طريقة تسمح بالتحقيق في ديناميكيات تفاعلات البروتين والحمض النووي الريبي في الخلايا الحية بدقة زمنية عالية. هنا يتم وصف البروتوكول بالتفصيل ، بما في ذلك نمو خلايا الخميرة ، والربط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية ، والحصاد ، وتنقية البروتين ، وخطوات إعداد مكتبة تسلسل الجيل التالي.

مراقبة ديناميكيات تفاعل البروتين والحمض النووي الريبي في الجسم الحي بدقة زمنية عالية باستخدام χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

عالية الدقة تحليل الجسيمات واحد من البريد الإلكتروني المجهر الصور باستخدام سفير

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

استخدام الأنابيب الفلورية الرنين نقل الطاقة لدراسة ديناميات البروتين المجمعات في مقياس زمني ميلي ثانية

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

تحديد كمية البروتين على نطاق المنظومة وسم التجانس على مستوى جزيء واحد

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

دراسة ديناميات التصاق الخلوي وانتشار الخلايا الظهاريه علي الفيبرونكتين اثناء الاكسده

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

القياس الكمي لديناميات شبكة تفاعل البروتين باستخدام الترسيب المناعي المشترك المتعدد

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

التحليل الطيفي المزدوج اللون للفلورسين المترابط لدراسة التفاعل بين البروتين والبروتين وديناميكيات البروتين في الخلايا الحية

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

مراقبة حركية تجميع البروتين في الجسم الحي باستخدام عد التضمين الآلي في Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

الجمع الروتيني لمجموعات بيانات التبريد EM عالية الدقة باستخدام المجهر الإلكتروني الناقل 200 كيلو فولت

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

مطيافية نيوترونية عالية الدقة لدراسة ديناميكيات بيكو ثانية-نانوثانية للبروتينات ومياه الترطيب

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...