Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Wellcome Trust (091549 til SG og 109093/Z/15/A til S.M.), Wellcome Trust Center for Cell Biology core grant (092076) og Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 til S.G.), European Molecular Biology Organization under et langsigtet postdoc-stipendium (ALTF 1070-2017 til R.A.C), og Danmarks Frie Forskningsfond (T.H.J).

A. Langford og W. Worboys er tilknyttet UVO3, et kommercielt selskab. De havde ingen rolle i undersøgelsesdesign, dataindsamling og fortolkning eller beslutningen om at indsende arbejdet til offentliggørelse.

χCRAC-metoden kombineret med de nye krydsbindings- og cellehøstningsanordninger har et stort potentiale, fordi den kan anvendes på en lang række modelorganismer og derfor bør være af almen interesse for RNA-feltet. Der er mange områder, hvor χCRAC kan anvendes. For eksempel kan metoden bruges til at måle den hierarkiske samling af proteiner i store makromolekylære komplekser, såsom spliceosomet og ribosomet, som ofte involverer dynamiske interaktioner mellem proteiner og RNA-molekyler. Vi bruger det nu også rutinemæssigt til at overvåge interaktioner mellem RNA-henfaldsfaktorer og deres substrater, når celler udsættes for forskellige former for stress. Dette gør det muligt for os at bestemme, på hvilket stadium af det adaptive respons disse faktorer er mest aktive, hvilke substrater de binder til, og hvor dynamiske disse interaktioner er. Sådanne data skal sætte forskerne i stand til at bestemme hver enkelt faktors relative bidrag til tilpasningen til miljøændringer.
χCRAC bruger dual affinity purification tags (HTF eller HTP) til at rense proteinet under meget strenge og denaturerende betingelser. Dette sikrer, at det copurified RNA er stærkt beriget for RNA'er, der var kovalent tværbundet til proteinet af interesse. Det har dog ulemper at stole på affinitetsmærker. For eksempel kan mærket forstyrre proteinfunktionen, hvilket kan give en forvrænget aflæsning af dets RNA-bindende interaktom. Derudover er det for nogle modelorganismer måske ikke altid muligt at bruge tags, fordi de genetiske værktøjer til at integrere DNA-fragmenter i genomet eller til at transformere ekspressionsplasmider endnu ikke er tilgængelige. Det er imidlertid ligetil at ændre nogle dele af χCRAC-protokollen for at gøre den kompatibel med CLIP-baserede protokoller, der er afhængige af antistoffer til oprensning af RBP. Faktisk viste denne undersøgelse, at det er muligt at kombinere iCLIP-baserede oprensninger med vores tværbinding. Vi er nu i gang med at udvikle CLIP-protokoller til at studere den tidsmæssige sammenhæng mellem humane RNA-bindende proteiner og spirende RNA-transkripter.
Når der udføres χCRAC på et nyt protein, skal UV-eksponeringen optimeres for at inducere maksimal tværbinding. Dette er vigtigt, fordi høje UV-eksponeringer kan reducere genopretningen af RNA under rensningstrinnet. Celler, der udtrykte den rekombinante RBP, blev udsat for forskellige UV-doser, 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 og 1J/cm2. RNP'erne blev derefter fanget, og RNA'erne blev fragmenteret og radioaktivt mærket. Derefter blev RNP'erne løst af SDS-PAGE, og der blev taget et autoradiogram for at udlede, hvilken eksponering der gav det mest intense signal (dvs. den maksimale tværbinding).
Når forsøgsbetingelserne er optimeret, anbefales flere kontroleksperimenter ved udførelse af χCRAC. For det første kan en UV-bestrålet, umærket prøve bruges til at overvåge baggrundsbinding til rensningsperlerne. For det andet, når der anvendes χCRAC under et skifteksperiment, muliggør en anden tidsserie, hvor cellerne forskydes tilbage til det oprindelige medium, undersøgelse af, om filtreringen af cellerne selv inducerer ændringer i RNA-niveauer eller protein-RNA-interaktioner.
Som nævnt i indledningen foreslår adskillige nyligt offentliggjorte papirer en række optimeringer af CLIP-protokollen. Dette inkluderer brugen af fluorescerende mærkede adaptere til påvisning af protein-RNA-komplekset gennem infrarød scanning10 samt optimeringer til forskellige nukleinsyrerensnings- og størrelsesvalgstrin, der har vist sig at øge kompleksiteten af de resulterende biblioteker 12,45. Vi er i øjeblikket ved at gennemføre nogle af disse forbedringer for yderligere at forbedre χCRAC-protokollen. Den protokol, der præsenteres her, indeholder allerede en række forbedringer af de oprindelige CRAC- og χCRAC-protokoller, som øger dataenes kompleksitet. For eksempel blev de tidligere, efter at have opløst de tværbundne, radioaktive protein-RNA-komplekser på SDS-PAGE-geler, overført til en nitrocellulosemembran, og det tværbundne RNA blev isoleret fra blottet. Imidlertid kan overførslen af RNP og efterfølgende RNA-ekstraktion være meget ineffektiv, især når man beskæftiger sig med store RBP'er såsom RNA-polymeraseunderenheder. Dette kan resultere i en signifikant reduktion i genopretningen af det tværbundne RNA. I den nuværende protokol ekstraheres det tværbundne RNA direkte fra SDS-PAGE gelskiver som illustreret i figur 1. Dette øgede genopretningen af tværbundne RNA'er. Derudover blev produktet efter PCR-amplifikation af cDNA'erne oprindeligt opløst på 3%, agarosegeler med lav smeltetemperatur, og derefter blev 175-300 bp PCR-produkter ekstraheret fra gelen. Imidlertid kan disse geler let overbelastes, hvilket resulterer i meget dårlig adskillelse af DNA'et. Udskiftning af agarosegeler med præfabrikerede TBE-geler resulterede i mere ensartet størrelsesadskillelse og bedre genopretning af PCR-produkter.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA'er er ofte afhængige af RBP'er for at udøve deres funktion, hvilket har ført til stor interesse for at forstå dynamikken mellem disse molekyler. Mange RBP'er er blevet identificeret i en lang række organismer. Det har dog altid været notorisk vanskeligt at studere RBP-RNA-interaktioner in vivo. Et stort gennembrud i studiet af sådanne interaktioner kom med fremkomsten af CLIP1. Denne metode anvender ultraviolet (UV, 254 nm) bestråling til at inducere kovalente bindinger mellem RBP'er og deres direkte bundne RNA'er (dvs. nul-distance tværbinding). Derefter immunrenses RBP af interesse under strenge betingelser for at sikre, at kun RNA'er, der er kovalent tværbundet til proteinerne, identificeres. Bundne RNA'er fordøjes derefter delvist med RNaser og omdannes derefter til cDNA-biblioteker til sekventering. Den høje oprensningsstrenghed er vigtig, da den i høj grad øger specificiteten af protein- og RNA-gendannelse, hvilket også forbedres yderligere gennem SDS-PAGE-oprensning af det tværbundne ribonukleoproteinkompleks (RNP). CLIP og relaterede metoder giver også nukleotidopløsningsindsigt i proteinbindingsstedet, fordi aminosyrer, der tværbundet til RNA'et under forberedelsen af sekventeringsbiblioteket, ofte afslutter revers transkriptasen eller får enzymet til at introducere mutationer på dette sted 1,2,3.
Siden introduktionen har den originale CLIP-protokol produceret en bemærkelsesværdig række afledte metoder. Et særligt vigtigt gennembrud kom med udviklingen af HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som fusionerer high-throughput sekventering med CLIP tilgang3. Dette er siden blevet vedtaget af alle CLIP-baserede metoder. iCLIP introducerede forbedringer i de RNase-medierede trimnings- og adapterligeringsteknikker, der letter en mere nøjagtig kortlægning af RBP-bindingsstederne4. PAR-CLIP kombinerede 4thio-uridin/uracil-mærkning med tværbinding ved 365 nm, hvilket gjorde det muligt at kortlægge tværbindingssteder ved at analysere T-C-substitutioner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP og uvCLAP introducerede denatureringsbetingelser og trin med dobbelt affinitetsrensning, der yderligere reducerer baggrundsbinding til affinitetsharpiksen og yderligere øger specificiteten af proteinfangst 2,6,7,8,9. Derudover introducerede CRAC, uvCLAP og dCLIP mærkning af RBP af interesse med et affinitetsmærke og overvandt dermed behovet for at generere specifikke antistoffer.
Der er også foretaget flere optimeringer for at fremskynde CLIP-metoden. Den oprindelige CLIP-protokol anvendte radiomærkning af de fangede RNA'er for at visualisere RBP-RNA-komplekserne efter SDS-PAGE. Brugen af radioaktivitet kan imidlertid være problematisk for laboratorier, der ikke er oprettet til sådant arbejde. irCLIP indeholder en fluoroforkoblet adapter, der letter visualisering gennem infrarød billeddannelse10 , og sCLIP anvender biotinylering af indfangede RNA'er for at visualisere dem gennem streptavidin-konjugeret HRP11. Desuden giver eCLIP helt afkald på RNA-mærkning; I stedet udskæres proteinet udelukkende baseret på dets kendte størrelse12. Streptavidin-baseret oprensning er også blevet brugt til at fremskynde processen med biblioteksforberedelse i FAST-iCLIP, hvor en biotinyleret 3'-adapter ligeres på RNA'erne og bruges til at muliggøre oprensning efter revers transkription og cirkularisering13. Yderligere forbedringer af iCLIP-protokollen øgede også bibliotekernes kompleksitetbetydeligt.
Endelig er CLIP blevet modificeret for at muliggøre indfangning af RBP'er fra forskellige cellulære underrum 14,15, for at visualisere nyligt transkriberede RNA'er ved hjælp af pulserende induktion af fotoaktiverbare ribonukleosider 5,16,17, for at fange methylerede RNA'er 18,19,20, for at undersøge RNA-RNA-interaktioner 21,22 og for at kortlægge 3' ender 23,24.
På trods af de store bidrag fra CLIP-baserede teknikker til at hjælpe vores forståelse af interaktionerne mellem RBP'er og RNA'er, har det været begrænset af ineffektiviteten af UV-tværbinding. Selvom dyrkningsceller dyrket i et monolag generelt er relativt lette at tværbinde, er dette betydeligt mere udfordrende i væv eller celler i opløsning. Væv kan kræve flere runder UV-eksponering for at trænge ind i de krævede cellelag, mens mikrobielle celler ofte dyrkes i rige medier, der indeholder aromatiske, UV-absorberende forbindelser25. Faktisk er UV-bestrålingstider på op til 30 min blevet brugt til at generere tilstrækkelig tværbinding mellem RBP'er og deres bundne RNA'er til sådanne prøver26,27,28. Denne udvidede UV-eksponering inducerer stressresponser i cellen, såsom UV-induceret DNA-skade, som kan forurene de endelige data i nogle applikationer.
De fleste CLIP-undersøgelser har fokuseret på at generere enkelte "snapshots" af specifikke protein-RNA-interaktioner i en celle. Imidlertid er protein-RNA-interaktioner iboende dynamiske, især når celler udsættes for ændringer i deres miljø. Dette kan omfatte en pludselig reduktion i tilgængeligheden af essentielle næringsstoffer eller hurtige temperaturændringer. For virkelig at forstå en RBP's rolle under stress er det bedst at udføre tidsopløste analyser, fordi de kan fange hele spektret af RBP-mål under stress og bestemme, på hvilket stadium af stressresponsen den valgte RBP er aktiv. Især undersøgelser i gær viste, at de første par minutters tilpasning er helt afgørende for overlevelse, og RNA-halveringstider i bakterier kan variere fra minutter til sekunder 29,30,31,32,33. Derfor bør sådanne tidsopløste analyser ideelt set udføres ved høj tidsmæssig opløsning. De lange tværbindingstider gør imidlertid undersøgelsen af adaptive reaktioner på tidlige stadier særligt udfordrende.
For at overvinde disse problemer udviklede vi for nylig en forbedret metode, der er i stand til at krydsbinde og høste celler på minutlange tidsskalaer. Vores χCRAC metode tillader kvantitativ måling af dynamiske ændringer i RBP-RNA interaktioner ved tidligere uvidne opløsning. Afgørende for denne metode var udviklingen af en ny UV-bestrålingsanordning32 , der reducerer den krævede tværbindingstid i gær og bakterier i opløsning omkring 10 gange, hvilket effektivt fryser RBP-RNA-interaktioner øjeblikkeligt. For hurtigt at høste cellerne efter UV-bestråling udviklede vi desuden en vakuumfiltreringsanordning, der kan høste eksponentielt voksende gær i en 0,5 L kultur på omkring 30 s32. Disse teknologiske innovationer tillader undersøgelse af RBP-RNA-dynamik ved opløsning i minutskala. Derudover introducerede vi også flere optimeringer til den originale CRAC protokol2 for at øge dens anvendelighed.
Ved hjælp af χCRAC studerede vi for nylig targetomet for en gærnuklear RBP, Nab3, som reaktion på glukosemangel. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 danne et kompleks med Nrd1, en RBP og RNA-helicase Sen1 for at danne NNS-komplekset. NNS-binding til RNA-polymerasen og det spirende transkript kan udløse transkriptionel afslutning34. Dette kompleks er for det meste involveret i fjernelse af kryptiske ikke-kodende RNA-transkripter, men har også vist sig at regulere ekspression af proteinkodende gener. Undersøgelsen viste differentiel målretning af Nab3 til ikke-kodende og kodende udskrifter efter kun et minuts stress32. Vi demonstrerede, at co-transkriptionel afslutning af Nab3 resulterer i en meget forbigående, pulslignende ekspression af retrotransposongener, som ville have været vanskelige at opdage ved hjælp af traditionelle CLIP-baserede tilgange. Derudover øgede de korte UV-bestrålingstider i vores UV-tværbinding også signifikant genvindingen af kortlivede ikke-kodende RNA'er32. χCRAC vil sandsynligvis være et afgørende redskab til at belyse ikke blot, hvordan vandområdeplaner former reaktionen på stress på umiddelbare tidshorisonter, men også deres skiftende roller i hele en respons' livscyklus. Dette manuskript giver en detaljeret oversigt over alle trin i χCRAC-protokollen. Til illustrative formål blev metoden brugt til at studere gær Nrd1-proteinet, som er involveret i transkriptionel terminering og RNA-henfald35,36, og dets RNA-targetom som reaktion på glukosemangel over en lang række tidspunkter. Endelig demonstrerer vi også, at vores UV-bestrålingsenhed hurtigt kan krydsbinde RBP'er til RNA i HeLa-celler, hvilket gør det muligt også at udføre tidsopløste analyser med høj opløsning i vedhængende celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

Interaktionen mellem RNA-bindende proteiner (RBP'er) og deres RNA-substrater udviser fluiditet og kompleksitet. Inden for sin levetid kan et enkelt RNA være bundet af mange forskellige RBP'er, der regulerer dets produktion, stabilitet, aktivitet og nedbrydning. Som sådan er der gjort meget for at forstå dynamikken, der eksisterer mellem disse to typer molekyler. Et særligt vigtigt gennembrud kom med fremkomsten af 'cross-l inking and immunoprecipitation' (CLIP). Denne teknik tillod streng undersøgelse af, hvilke RNA'er der er bundet af en bestemt RBP. Kort sagt er proteinet af interesse UV-tværbundet til dets RNA-substrater in vivo, oprenset under meget strenge betingelser, og derefter omdannes RNA'erne, der er kovalent tværbundet til proteinet, til cDNA-biblioteker og sekventeres. Siden grundlæggelsen er der udviklet mange afledte teknikker for at gøre CLIP egnet til bestemte fagområder. Imidlertid er tværbinding ved hjælp af ultraviolet lys notorisk ineffektiv. Dette resulterer i forlængede eksponeringstider, der gør den tidsmæssige undersøgelse af RBP-RNA-interaktioner umulig. For at løse dette problem har vi for nylig designet og bygget meget forbedrede UV-bestrålings- og cellehøstningsenheder. Ved hjælp af disse nye værktøjer udviklede vi en protokol til tidsopløste analyser af RBP-RNA-interaktioner i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning: Kinetisk CR-oss-binding og Analysis of cDNAs (χCRAC). Vi brugte for nylig denne teknik til at studere rollen som gær RBP'er i næringsstofstresstilpasning. Dette manuskript giver et detaljeret overblik over χCRAC-metoden og præsenterer de seneste resultater, der er opnået med Nrd1 RBP.

For at demonstrere effektiviteten af χCRAC-metoden blev der udført et tidsforløbsforsøg med gærstammer, der udtrykte et HTP-mærket Nrd1-protein. Figur 1 indeholder en detaljeret skematisk fremstilling, der beskriver, hvordan metoden fungerer. Ligesom Nab3 er Nrd1 involveret i nukleært RNA-henfald af en række RNA-transkripter37. Tidligere arbejde fra Corden-laboratoriet foreslog, at Nrd1-binding til dets RNA-mål ændres markant, når celler udsættes for glukosesult28,38. Som sådan blev celler, der voksede eksponentielt i medium indeholdende glucose (SD-TRP), flyttet til det samme medium uden glukose (S-TRP) over et tidsforløb for at overvåge dynamiske ændringer i Nrd1-RNA-interaktioner. Prøver blev taget og tværbundet i Vari-X-linkerkammeret (figur 3A) før skiftet og derefter efter 1, 2, 4, 8, 14 og 20 min. Mediet, der anvendes til cellevækst, var bevidst mangelfuldt i tryptofan for at reducere UV-absorptionen af denne aromatiske aminosyre. Bemærk, at det er bedst at bruge syntetisk medium, der er filtreret, steriliseret, fordi autoklavering af mediet kan føre til karamellisering af sukkerarterne. Dette reducerer derefter tværbindingseffektiviteten.
Figur 4A viser et repræsentativt autorøntgenbillede fra et χCRAC eksperiment. Bemærk, at prøverne i dette eksempel ikke blev samlet sammen. I stedet blev hver kørt individuelt på gelen. Dette anbefales til indledende eksperimentelle tests for at vise, at proteinet krydsbinder effektivt til RNA på alle de testede tidspunkter. Et særligt intenst signal blev observeret ved den forventede molekylvægt af RBP, der repræsenterer proteinet bundet til meget korte, radioaktivt mærkede RNA'er, der ikke er modtagelige for sekventering. Derfor blev smearysignalet over dette bånd, som er proteinet tværbundet til længere RNA-fragmenter, isoleret. Fragmentet blev skåret fra lige over proteinbåndet plus omkring 30 kDa. Figur 4B viser et autoradiogram efter excision, hvor proteinet er krydsbundet til korte RNA'er tilbage i gelen, og det tidligere smære signal nu er udskåret.
Efter omvendt transkription skal cDNA-biblioteket amplificeres ved hjælp af PCR. Overforstærkning af biblioteket skal dog undgås, da dette kan introducere bias mod sekvenser, der fortrinsvis forstærkes af polymerasen og generere PCR-artefakter. Overforstærkede biblioteker indeholder også et stort antal duplikatsekvenser, som spilder læser på sequenceren. For at beregne det ideelle antal PCR-cyklusser til amplifikation af det endelige bibliotek blev en alikvote af cDNA'et amplificeret gennem qPCR under anvendelse af P5- og BC-oligonukleotiderne. Den første cyklus, hvor biblioteket nåede maksimal fluorescens, blev valgt som PCR-cyklustælling. Figur 4C giver et eksempel på en qPCR fra et typisk cDNA-bibliotek, som gav et topcyklustal på 16. Denne værdi blev derefter anvendt til den endelige χCRAC PCR. For at behandle de sekventerede data brugte vi software, der tidligere var udviklet i vores laboratorium (pyCRAC) og den tilsvarende pipeline til analyse af de kinetiske CRAC-data (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Disse open source-softwareværktøjer muliggør demultiplexing og trimning af dataene, fjernelse af PCR-duplikater, identifikation af statistisk signifikante toppe, klyngelæsninger i sammenhængende sekvenser og identifikation af bindingsmotiver39. Yderligere oplysninger om, hvordan disse værktøjer fungerer, findes på deres respektive websider.
Vi begyndte også at udvikle en χCRAC protokol for pattedyrceller. Størstedelen af pattedyrs cellelinjer dyrkes som et monolag, og bakken i vores tværbinding med den UV-gennemtrængelige pose er ikke egnet til forsøg med klæbende celler. For at overvinde dette problem udviklede vi et trin, hvor brugerne kan UV-bestråle 1-2 petriskåle (150 mm i diameter og 25 mm i dybden) med klæbende celler (figur 3B). Som en første test blev effektiviteten af tværbindingen til pattedyrceller målt gennem tværbinding og indfangning af stabilt mærket GFP-RBM7 ved hjælp af anti-GFP-antistoffer og en traditionel CLIP-baseret oprensning. Som vist i figur 5A var tværbindingen i stand til at genvinde protein-RNA-komplekser fra pattedyrceller dyrket som et monolag ved hjælp af 254 nm UV-bestråling ved effektiviteter, der kan sammenlignes med en almindeligt anvendt UV-bestrålingsanordning. Imidlertid er standard cellekulturplastvarer, der normalt anvendes til UV-tværbindingseksperimenter, uigennemtrængelige for 254 nm UV. Derfor ville cellerne i vores tværbinding kun modtage bestråling fra den øverste bred af UV-lamper. For at overvinde dette udviklede vi en UV-permeabel kvarts petriskål til cellevækst og tværbinding. Anvendelse af kvartskulturen viste robust genvinding af protein-RNA-komplekser med så få som 2 s UV-bestråling (figur 5B). Når de kombineres med RBP-indfangningsmetoder for pattedyrceller, såsom CLIP-teknologier, er disse korte tværbindingstider tilgængelige med tidsforløb til at genvinde spatiotemporale RNA-bindingsprofiler af RBP'er som reaktion på genotoksiske belastninger eller hurtige udtømninger af proteinfaktorer eller parallelt med transkriptionel eller cellecyklussynkronisering.
Figur 6 viser flere eksempler på Nrd1-data, der behandles af χCRAC-rørledningen. Dette tal blev udarbejdet ved hjælp af de bedgraph-filer, der genereres af pipelinen og python GenomeBrowser-pakken (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), som vi har designet til at forenkle gengivelsen af genombrowserbilleder af dataene i publikationskvalitet. De grå rektangler repræsenterer genomiske regioner, der udtrykte ikke-kodende RNA'er, såsom det kryptiske ustabile transkript (CUT'er), stabile ukarakteriserede transkripter (SUT'er)40 og Xrn1-følsomme ustabile transkripter (XUT'er)41. Dataene i figur 6 viser, at Nrd1 binder til mange af disse ikke-kodende RNA-transkripter, i overensstemmelse med ideen om, at dette protein er involveret i nedbrydning af denne klasse af transkripter42. Figur 6A viser en ~ 15 kb region på kromosom IV. Her var der en signifikant stigning i binding af Nrd1 til transkripter, der koder for glukosetransportørerne med høj affinitet HXT6 og HXT7, som begge opreguleres under glukosesult. Det er sandsynligt, at transkriptionsafslutning af NNS-komplekset kan påvirke induktionskinetikken af disse gener under glukosesult. Figur 6B viser et eksempel på Nrd1-tværbinding til Imd3-transkriptet, som vides at være reguleret af Nab343. I dette tilfælde viste dataene en signifikant reduktion i binding ved glukosesult. Tidligere arbejde viste nedsat binding af Nab3 til Tye7-transkriptet under glukosesult44. I overensstemmelse med denne observation tyder χCRAC-dataene på, at bindingen af Nrd1 faldt under glukosesult, og Nrd1-tværbindingen til Tye7 var på sit laveste efter 8 minutters stress (figur 4C). Det ser imidlertid ud til, at denne effekt kun var forbigående, fordi Nrd1-bindingen efter 14 minutters glukosesult gik tilbage til startniveauerne.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Figur 1: Skematisk gengivelse af χCRAC-protokollen. Mærkede stammer blev dyrket indtil den ønskede tæthed. RBP indikerer RNA-bindende protein. Derefter blev der taget en referenceprøve og tværbundet med 254 nm UV-lys. De resterende celler blev høstet ved filtrering og derefter hurtigt skiftet til det stressfremkaldende medium. Til χCRAC eksperimentet, der er beskrevet her, blev der udtaget prøver og tværbundet 1, 2, 4, 8, 14 og 20 minutter efter skiftet (1). RBP af interesse blev derefter renset ved hjælp af en meget streng to-trins affinitetsrensning (2). Derefter blev de fangede tværbundne RNA'er delvist fordøjet med RNaser, radioaktivt mærket i 5'-enden, og adaptere blev ligeret på dem (3). 5'-adapterne indeholdt unikke "in-read" stregkodesekvenser, så de enkelte prøver kunne adskilles bioinformatisk efter sekventering. RBP-RNA-komplekserne blev derefter elueret, samlet og udfældet sammen (4), opløst af SDS-PAGE og visualiseret gennem autoradiografi (5). Derefter blev en enkelt gelskive indeholdende det radioaktive signal lige over hovedbåndet, illustreret med stiplet rød boks i autoradiografibilledet, skåret fra gelen (5). Gelskiverne blev behandlet med protease K, og RNA'et blev efterfølgende ekstraheret (6), omdannet til cDNA'er og amplificeret gennem PCR (7). PCR-trinnet introducerede yderligere stregkoder (gul blok introduceret af P7 oligo), så mange biblioteker kunne multiplexeres til en enkelt bane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figur 2: Tværbinding og vakuumfiltrering. a) Tværbindingen. Cellesuspensionen hældes i en tragt øverst til højre på maskinen (se også figur 3A for nærbillede) og opbevares i en UV-gennemsigtig pose placeret i den midterste bakke. Denne pose flankeres af to skodder, der forbliver lukkede, indtil brugeren instruerer maskinen i at starte bestrålingstrinnet. Cellerne bestråles med UV-lys fra bakkerne både over og under. Maskinen leveres med 254 og 365 nm UV-lamper, hvor sidstnævnte kan anvendes til PAR-CLIP-eksperimenter. Maskinen betjenes via et berøringsskærmpanel placeret øverst til højre, som gør det muligt at kontrollere UV-dosering eller eksponeringstid. (B) Efter tværbinding drænes cellerne fra maskinens venstre side. Cellesuspensioner genvindes gennem vakuum og drænes i en glaskolbe, hvor de efterfølgende kan hældes i en vakuumfiltreringsanordning til høst. C) Vakuumfiltreringsanordninger. Disse åbnes og lukkes via et klip, og der indsættes et filter mellem det. Fire filtreringsanordninger blev brugt parallelt i meget korte tidsserier for ikke at miste tid som følge af udskiftning af filtre. D) Efter filtrering blev mediesupernatanten drænet i kolber med henblik på senere bortskaffelse. Ventiler blev installeret under vakuumfiltreringsanordningerne for at opretholde vakuumet i systemet, når filteret fjernes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figur 3: Tværbinding suspenderet vs. klæbende celler. A) Tværbindingen med Vari-X-bindingskammeret for suspensionsceller. Cellekulturen hældes i prøveindløbet (tragten) placeret øverst til højre på bakken. (B) Bakke, der kan indeholde plast- eller kvartspetriskåle til tværbinding af klæbende celler eller små mængder suspensionsceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figur 4: Forberedelse af biblioteket. (A) Eksempel på et autoradiogram fra et Nrd1-HTP χCRAC eksperiment. Det stærke, koncentrerede signal repræsenterer proteinet tværbundet til meget korte RNA'er, mens udstrygningen ovenfor repræsenterer proteinet tværbundet til RNA'er af tilstrækkelig længde til sekventering. (B) Udstrygningen blev udskåret som vist i et autoradiogram taget efter geludskæring. (C) En repræsentativ qPCR fra et χCRAC cDNA-bibliotek. I dette eksempel blev maksimal amplifikation af cDNA'et nået ved 16 cyklusser. Således blev 16 cyklusser brugt til den endelige forstærkning. Fejllinjen repræsenterer standardafvigelsen for tre tekniske qPCR-replikater. (D) Eksempel på et fosforbillede fra et cDNA-bibliotek på en 6% TBE-gel. E) cDNA-længde og kvalitetsanalyse fra en chipbaseret kapillærelektroforese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figur 5: High RNase-test iCLIP-eksperiment for at teste tværbinding i pattedyrceller. Vist er autoradiogrammer fra GFP-RBM7 iCLIP-eksperimenter, der testede effektiviteten af RNP-genvinding på tværs af forskellige tværbindingsenergier. Immunudfældninger blev udført ved anvendelse af anti-GFP-antistoffer koblet til magnetiske perler på tværbundne celler, som stabilt udtrykte GFP-RBM7. Immunoprecipitater blev inkuberet med høje koncentrationer af RNase I for at trimme associerede RNA'er til korte, ensartede længder. RNP'er blev visualiseret ved 32P-mærkning og SDS-PAGE og migrerer som et defineret bånd tæt på migrationen af det ikke-tværbundne protein. Kvantificering indikerer resultaterne af densitometriske analyser af radioaktivt mærket RBM7-RNA-signal normaliseret til anti-GFP western blot-signalet. (A) Tværbindingstidsforløb for den almindeligt anvendte UVP-tværbinding versus vores tværbinding (Vari-X-linker; VxL). (B) Tværbindingstidsforløb for vores tværbinding på kvarts (venstre) og plast (højre) kulturartikler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figur 6: Eksempel på genombrowserplot, der viser χCRAC's evne til at vise differentiel, tidsmæssig binding af Nrd1 til dens mål. Hver boks viser plots for individuelle genomiske regioner. Pilene angiver, hvilken streng generne er kodet på (venstre pegepil = minusstreng; højre pegepil = plusstreng). Tidspunkterne (min) er angivet med t0, t1, t2 osv. på y-akserne i hvert delområde. Romertal, der angiver kromosomerne og koordinaterne, vises. (A) Ved glukosemangel binder Nrd1 to glukosetransportører med høj affinitet, HXT6 og HXT7, som begge er opreguleret i denne tilstand. (B) Nrd1 observeres at binde til Imd3, et allerede valideret mål for Nab344, med faldende intensitet efter glukosesult. (C) Nrd1-binding af Tye7 udviser en dynamisk og forbigående karakter, der falder efter glukosesult til et minimum efter 8 minutters stress. Imidlertid vender bindingen efterfølgende tilbage til basale niveauer efter 14 min. Læsninger blev normaliseret til "læsninger pr. million" (RPM; y-akse). Grå felter angiver regioner, der koder for ikke-kodende RNA'er. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Kinetisk tværbinding og analyse af cDNA er en metode, der muliggør undersøgelse af dynamikken i protein-RNA-interaktioner i levende celler ved høj tidsmæssig opløsning. Her beskrives protokollen detaljeret, herunder vækst af gærceller, UV-tværbinding, høst, proteinrensning og næste generations sekventeringsbiblioteksforberedelsestrin.

Overvågning af protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo ved høj tidsmæssig opløsning ved hjælp af χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

High-resolution single particle analyse fra elektronkryo-mikroskopi billeder ved hjælp af SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruger i Vitro fluorescens resonans energioverførsel at studere dynamikken i proteinkomplekser på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium Imaging i C. elegans krop væg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantificering af mærkning homogenitet på enkelt-molekyle niveau

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøge dynamikken i cellulære vedhæftning og spredning af Epiteliale celler på Fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantificering af protein interaktions netværk dynamik ved hjælp af Multiplexed Co-Immunopræcipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescens Krydskorrelation Spektroskopi til undersøgelse protein-protein interaktion og protein dynamik i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Overvågning af proteinaggregeringskinetik in vivo ved hjælp af automatiseret inklusionstælling i caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...