Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Wellcome Trust (091549 aan S.G. en 109093/Z/15/A aan S.M.), de Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) en Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 to S.G.), de European Molecular Biology Organization onder een langdurige postdoctorale fellowship (ALTF 1070-2017 tot R.A.C.), en het Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

A. Langford en W. Worboys zijn aangesloten bij UVO3, een commercieel bedrijf. Ze hadden geen rol in de opzet van de studie, het verzamelen en interpreteren van gegevens, of de beslissing om het werk voor publicatie in te dienen.

De χCRAC-methode, in combinatie met de nieuwe crosslinking- en celoogstapparaten, heeft een groot potentieel omdat het toepasbaar is op een breed scala van modelorganismen en daarom van algemeen belang zou moeten zijn voor het RNA-veld. Er zijn veel gebieden waarop χCRAC kan worden gebruikt. De methode kan bijvoorbeeld worden gebruikt om de hiërarchische assemblage van eiwitten in grote macromoleculaire complexen te meten, zoals het spliceosoom en het ribosoom, waarbij vaak dynamische interacties tussen eiwitten en RNA-moleculen betrokken zijn. We gebruiken het nu ook routinematig om interacties tussen RNA-vervalfactoren en hun substraten te volgen wanneer cellen worden blootgesteld aan verschillende soorten spanningen. Dit stelt ons in staat om te bepalen in welk stadium van de adaptieve respons deze factoren het meest actief zijn, aan welke substraten ze binden en hoe dynamisch deze interacties zijn. Dergelijke gegevens moeten onderzoekers in staat stellen de relatieve bijdrage van elke factor aan de aanpassing aan veranderingen in het milieu te bepalen.
χCRAC maakt gebruik van dubbele affiniteitszuiveringslabels (HTF of HTP) om het eiwit te zuiveren onder zeer strenge en denaturerende omstandigheden. Dit zorgt ervoor dat het gecopureerde RNA sterk verrijkt is voor RNA's die covalent verknoopt waren met het eiwit van belang. Vertrouwen op affiniteitstags heeft echter nadelen. De tag kan bijvoorbeeld interfereren met de eiwitfunctie, wat een vervormde uitlezing van het RNA-bindende interactoom zou kunnen geven. Bovendien is het voor sommige modelorganismen niet altijd mogelijk om tags te gebruiken omdat de genetische hulpmiddelen om DNA-fragmenten in het genoom te integreren of expressieplasmiden te transformeren nog niet beschikbaar zijn. Het is echter eenvoudig om sommige delen van het χCRAC-protocol te wijzigen om het compatibel te maken met CLIP-gebaseerde protocollen die afhankelijk zijn van antilichamen voor de zuivering van de RBP. Deze studie toonde inderdaad aan dat het mogelijk is om iCLIP-gebaseerde zuiveringen te combineren met onze crosslinker. We zijn nu bezig met het ontwikkelen van CLIP-protocollen om de temporele associatie van menselijke RNA-bindende eiwitten met ontluikende RNA-transcripten te bestuderen.
Bij het uitvoeren van χCRAC op een nieuw eiwit moet de UV-blootstelling worden geoptimaliseerd om maximale cross-linking te induceren. Dit is belangrijk omdat hoge UV-blootstellingen het herstel van RNA tijdens de zuiveringsstap kunnen verminderen. Cellen die de recombinante RBP tot expressie brachten, werden blootgesteld aan verschillende UV-doses, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 en 1 J/cm 2. De RNP's werden vervolgens gevangen en de RNA's werden gefragmenteerd en radioactief gelabeld. Daarna werden de RNP's opgelost door SDS-PAGE en werd een autoradiogram gemaakt om af te leiden welke blootstelling het meest intense signaal gaf (d.w.z. de maximale cross-linking).
Zodra de experimentele omstandigheden zijn geoptimaliseerd, worden verschillende controle-experimenten aanbevolen bij het uitvoeren van χCRAC. Ten eerste kan een UV-bestraald, ongelabeld monster worden gebruikt om de achtergrondbinding aan de zuiveringsparels te controleren. Ten tweede, bij het toepassen van χCRAC tijdens een verschuivingsexperiment, maakt een tweede tijdreeks waarbij de cellen terug naar het oorspronkelijke medium worden verplaatst, onderzoek mogelijk naar de vraag of de filtratie van de cellen zelf veranderingen in RNA-niveaus of eiwit-RNA-interacties induceert.
Zoals vermeld in de inleiding, suggereren tal van recent gepubliceerde artikelen een aantal optimalisaties van het CLIP-protocol. Dit omvat het gebruik van fluorescerend gelabelde adapters voor het detecteren van het eiwit-RNA-complex door middel van infraroodscanning10, evenals optimalisaties voor verschillende nucleïnezuurzuiverings- en grootteselectiestappen die zijn aangetoond om de complexiteit van de resulterende bibliotheken te vergroten12,45. We implementeren momenteel enkele van deze verbeteringen om het χCRAC-protocol verder te verfijnen. Het hier gepresenteerde protocol bevat al een aantal verbeteringen ten opzichte van de oorspronkelijke CRAC- en χCRAC-protocollen die de complexiteit van de gegevens vergroten. Bijvoorbeeld, eerder, na het oplossen van de cross-linked, radioactieve proteïne-RNA-complexen op SDS-PAGE-gels, werden ze overgebracht naar een nitrocellulosemembraan en werd het cross-linked RNA geïsoleerd uit de vlek. De overdracht van de RNP en de daaropvolgende RNA-extractie kan echter zeer inefficiënt zijn, vooral wanneer het gaat om grote RBP's zoals RNA-polymerase-subeenheden. Dit kan resulteren in een significante vermindering van het herstel van het cross-linked RNA. In het huidige protocol wordt het cross-linked RNA rechtstreeks geëxtraheerd uit SDS-PAGE-gelplakken, zoals geïllustreerd in figuur 1. Dit verhoogde het herstel van cross-linked RNA's. Bovendien werd het product na PCR-amplificatie van de cDNA's oorspronkelijk opgelost op 3%, agarose-gels met lage smelttemperatuur en vervolgens werden 175-300 bp PCR-producten uit de gel geëxtraheerd. Deze gels kunnen echter gemakkelijk overbelast raken, wat resulteert in een zeer slechte scheiding van het DNA. Het vervangen van agarose-gels door geprefabriceerde TBE-gels resulteerde in een consistentere groottescheiding en een beter herstel van PCR-producten.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA's vertrouwen vaak op RBP's om hun functie uit te oefenen, wat heeft geleid tot grote interesse in het begrijpen van de dynamiek tussen deze moleculen. Veel RBP's zijn geïdentificeerd in een grote verscheidenheid aan organismen. Het is echter altijd notoir moeilijk geweest om RBP-RNA-interacties in vivo te bestuderen. Een belangrijke doorbraak in het bestuderen van dergelijke interacties kwam met de opkomst van CLIP1. Deze methode maakt gebruik van ultraviolette (UV, 254 nm) bestraling om covalente bindingen tussen RBP's en hun direct gebonden RNA's (d.w.z. nul-afstand cross-linking) te induceren. Vervolgens wordt de relevante RBP onder strikte voorwaarden geimmunozuiverd om ervoor te zorgen dat alleen RNA's die covalent aan de eiwitten zijn gekoppeld, worden geïdentificeerd. Gebonden RNA's worden vervolgens gedeeltelijk verteerd met RNases en vervolgens omgezet in cDNA-bibliotheken voor sequencing. De hoge zuiveringsstrengheid is belangrijk omdat het de specificiteit van eiwit- en RNA-herstel aanzienlijk verhoogt, wat ook verder wordt verbeterd door SDS-PAGE-zuivering van het cross-linked ribonucleoproteïne (RNP) -complex. CLIP en aanverwante methoden geven ook inzicht in de nucleotideresolutie in de eiwitbindingsplaats, omdat tijdens de voorbereiding van de sequencingbibliotheek aminozuren die aan het RNA zijn gekoppeld vaak de reverse transcriptase beëindigen of ervoor zorgen dat het enzym mutaties op deze plaats introduceert 1,2,3.
Sinds de introductie heeft het oorspronkelijke CLIP-protocol een opmerkelijke verscheidenheid aan afgeleide methodologieën opgeleverd. Een bijzonder belangrijke doorbraak kwam met de ontwikkeling van HITS-CLIP (of CLIP-seq), die high-throughput sequencing combineert met de CLIP-benadering3. Dit is sindsdien overgenomen door alle CLIP-gebaseerde methodologieën. iCLIP introduceerde verbeteringen in de RNase-gemedieerde trim- en adapterligatietechnieken die een nauwkeurigere mapping van de RBP-bindingsplaatsen mogelijk maken4. PAR-CLIP combineerde 4thio-uridine/uracil labeling met cross-linking bij 365 nm, waardoor het mogelijk is om cross-linking sites in kaart te brengen door T-C substitutieste analyseren 5. CRAC, ureum-iCLIP, dCLIP en uvCLAP introduceerden denatureringscondities en dubbele affiniteitszuiveringsstappen die de achtergrondbinding aan de affiniteitshars verder verminderen en de specificiteit van eiwitvangst verder verhogen 2,6,7,8,9. Bovendien introduceerden CRAC, uvCLAP en dCLIP het taggen van de RBP van belang met een affiniteitstag, waardoor de noodzaak om specifieke antilichamen te genereren werd overwonnen.
Er zijn ook verschillende optimalisaties doorgevoerd om de CLIP-methodologie te versnellen. Het oorspronkelijke CLIP-protocol maakte gebruik van radiolabeling van de gevangen RNA's om de RBP-RNA-complexen na SDS-PAGE te visualiseren. Het gebruik van radioactiviteit kan echter problematisch zijn voor laboratoria die niet voor dergelijk werk zijn opgezet. irCLIP bevat een fluorofoor-gekoppelde adapter die visualisatie vergemakkelijkt door middel van infraroodbeeldvorming10 en sCLIP maakt gebruik van biotinylering van gevangen RNA's om ze te visualiseren via streptavidine-geconjugeerde HRP11. Bovendien ziet eCLIP volledig af van RNA-etikettering; in plaats daarvan wordt het eiwit weggesneden op basis van de bekende grootte12. Op Streptavidin gebaseerde zuivering is ook gebruikt om het proces van bibliotheekvoorbereiding in FAST-iCLIP te versnellen, waarbij een gebiotinyleerde 3'-adapter op de RNA's wordt geligeerd en wordt gebruikt om zuivering mogelijk te maken na reverse transcriptie en circularisatie13. Extra verbeteringen aan het iCLIP-protocol hebben ook de complexiteit van de bibliotheken aanzienlijk verhoogd4.
Ten slotte is CLIP aangepast om het vastleggen van RBP's uit verschillende cellulaire subcompartimenten 14,15 mogelijk te maken, om nieuw getranscribeerde RNA's te visualiseren met behulp van gepulseerde inductie van fotoactiveerbare ribonucleosiden 5,16,17, om gemethyleerde RNA's18,19,20 te vangen, om RNA-RNA-interacties 21,22 te onderzoeken en om 3'-uiteinden 23,24 in kaart te brengen .
Ondanks de grote bijdragen van CLIP-gebaseerde technieken bij het helpen begrijpen van de interacties tussen RBP's en RNA's, is het beperkt door de inefficiëntie van UV-crosslinking. Hoewel kweekcellen die in een monolaag worden gekweekt over het algemeen relatief gemakkelijk te verknopen zijn, is dit aanzienlijk uitdagender in weefsels of cellen in oplossing. Weefsels kunnen meerdere rondes van UV-blootstelling vereisen om door te dringen tot de vereiste cellagen, terwijl microbiële cellen vaak worden gekweekt in rijke media die aromatische, UV-absorberende verbindingen bevatten25. Uv-bestralingstijden tot 30 minuten zijn inderdaad gebruikt om voldoende cross-linking tussen RBP's en hun gebonden RNA's voor dergelijke monsters te genereren26,27,28. Deze uitgebreide UV-blootstelling induceert stressreacties in de cel, zoals UV-geïnduceerde DNA-schade, die de uiteindelijke gegevens in sommige toepassingen kan verontreinigen.
De meeste CLIP-studies hebben zich gericht op het genereren van enkele "snapshots" van specifieke eiwit-RNA-interacties in een cel. Eiwit-RNA-interacties zijn echter inherent dynamisch, vooral wanneer cellen onderhevig zijn aan veranderingen in hun omgeving. Dit kan een plotselinge vermindering van de beschikbaarheid van essentiële voedingsstoffen of snelle temperatuurveranderingen omvatten. Om de rol van een RBP tijdens stress echt te begrijpen, is het daarom het beste om tijd-opgeloste analyses uit te voeren, omdat ze het volledige spectrum van RBP-doelen tijdens stress kunnen vastleggen en kunnen bepalen in welk stadium van de stressrespons de gekozen RBP actief is. In het bijzonder toonden studies in gist aan dat de eerste paar minuten van aanpassing absoluut cruciaal zijn voor overleving en RNA-halfwaardetijden in bacteriën kunnen variëren van minuten tot seconden 29,30,31,32,33. Daarom moeten dergelijke tijd-opgeloste analyses idealiter worden uitgevoerd met een hoge temporele resolutie. De lange cross-linking tijden maken de studie van adaptieve reacties in een vroeg stadium echter bijzonder uitdagend.
Om deze problemen op te lossen, hebben we onlangs een verbeterde methode ontwikkeld die in staat is om cellen te koppelen en te oogsten op minutenlange tijdschalen. Onze χCRAC-methode maakt kwantitatieve meting van dynamische veranderingen in RBP-RNA-interacties met voorheen ongewilde resolutie mogelijk. Cruciaal voor deze methode was de ontwikkeling van een nieuw UV-bestralingsapparaat32 dat de vereiste cross-linking tijd in gist en bacteriën in oplossing ongeveer 10-voudig vermindert, waardoor RBP-RNA-interacties onmiddellijk effectief worden bevroren. Om de cellen na UV-bestraling snel te oogsten, hebben we bovendien een vacuümfiltratieapparaat ontwikkeld dat exponentieel groeiende gist kan oogsten in een 0,5 L-cultuur in ongeveer 30 s32. Deze technologische innovaties maken de studie van RBP-RNA-dynamica op minuutschaal mogelijk. Daarnaast hebben we ook verschillende optimalisaties geïntroduceerd in het oorspronkelijke CRAC-protocol2 om de bruikbaarheid ervan te vergroten.
Met behulp van χCRAC bestudeerden we onlangs het targetoom van een gistkern-RBP, Nab3, als reactie op glucosedeprivatie. In Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 een complex vormen met Nrd1, een RBP, en het RNA-helicase Sen1 om het NNS-complex te vormen. NNS-binding aan het RNA-polymerase en het ontluikende transcript kan transcriptionele beëindiging veroorzaken34. Dit complex is meestal betrokken bij het verwijderen van cryptische niet-coderende RNA-transcripten, maar er is ook aangetoond dat het de expressie van eiwitcoderende genen reguleert. De studie toonde differentiële targeting van Nab3 naar niet-coderende en coderende transcripten na slechts een minuut stress32. We toonden aan dat co-transcriptionele beëindiging door Nab3 resulteert in een zeer voorbijgaande, pulsachtige expressie van retrotransposongenen, die moeilijk te detecteren zou zijn geweest met behulp van traditionele CLIP-gebaseerde benaderingen. Bovendien verhoogden de korte UV-bestralingstijden in onze UV-cross-linker ook het herstel van kortlevende niet-coderende RNA's32 aanzienlijk. χCRAC zal waarschijnlijk een cruciaal instrument zijn om niet alleen te verduidelijken hoe RBP's de reactie op stress op onmiddellijke tijdschalen vormgeven, maar ook hun veranderende rollen gedurende de hele levenscyclus van een respons. Dit manuscript geeft een gedetailleerd overzicht van alle stappen in het χCRAC protocol. Ter illustratie werd de methode gebruikt om het gist Nrd1-eiwit te bestuderen, dat betrokken is bij transcriptionele beëindiging en RNA-verval35,36, en het RNA-targetoom als reactie op glucosedeprivatie over een groot aantal tijdpunten. Ten slotte tonen we ook aan dat onze UV-bestralingseenheid RBP's snel kan koppelen aan RNA in HeLa-cellen, waardoor het mogelijk is om ook in adherente cellen tijd-opgeloste analyses met hoge resolutie uit te voeren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

De interactie tussen RNA-bindende eiwitten (RBP's) en hun RNA-substraten vertoont vloeibaarheid en complexiteit. Binnen zijn levensduur kan een enkel RNA worden gebonden door veel verschillende RBP's die de productie, stabiliteit, activiteit en afbraak zullen reguleren. Als zodanig is er veel gedaan om de dynamiek tussen deze twee soorten moleculen te begrijpen. Een bijzonder belangrijke doorbraak kwam met de opkomst van 'cross-l inking and immunoprecipitation' (CLIP). Deze techniek maakte streng onderzoek mogelijk naar welke RNA's gebonden zijn aan een bepaald RBP. Kortom, het eiwit van belang is UV-cross-linked met zijn RNA-substraten in vivo, gezuiverd onder zeer strenge omstandigheden, en vervolgens worden de RNA's die covalent aan het eiwit zijn gekoppeld, omgezet in cDNA-bibliotheken en gesequenced. Sinds de conceptie zijn er veel afgeleide technieken ontwikkeld om CLIP ontvankelijk te maken voor bepaalde vakgebieden. Cross-linking met behulp van ultraviolet licht is echter notoir inefficiënt. Dit resulteert in langere blootstellingstijden die de temporele studie van RBP-RNA-interacties onmogelijk maken. Om dit probleem op te lossen, hebben we onlangs sterk verbeterde UV-bestralings- en celoogstapparaten ontworpen en gebouwd. Met behulp van deze nieuwe tools ontwikkelden we een protocol voor tijd-opgeloste analyses van RBP-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie: Kinetic CRoss-linking en Analysis of cDNAs (χCRAC). We hebben deze techniek onlangs gebruikt om de rol van gist-RBP's bij de aanpassing aan voedingsstress te bestuderen. Dit manuscript geeft een gedetailleerd overzicht van de χCRAC-methode en presenteert recente resultaten verkregen met de Nrd1 RBP.

Om de werkzaamheid van de χCRAC-methode aan te tonen, werd een tijdsloopexperiment uitgevoerd met giststammen die een HTP-gelabeld Nrd1-eiwit tot expressie brengen. Een gedetailleerde schematische weergave die beschrijft hoe de methode werkt, wordt gegeven in figuur 1. Net als Nab3 is Nrd1 betrokken bij nucleair RNA-verval van een verscheidenheid aan RNA-transcripten37. Eerder werk van het Corden-lab suggereerde dat Nrd1-binding aan zijn RNA-doelen aanzienlijk verandert wanneer cellen worden blootgesteld aan glucose-uithongering28,38. Als zodanig werden cellen die exponentieel groeiden in medium dat glucose (SD-TRP) bevat, gedurende een tijdsverloop naar hetzelfde medium zonder glucose (S-TRP) verschoven om dynamische veranderingen in Nrd1-RNA-interacties te volgen. Monsters werden genomen en verknoopt in de Vari-X-linkerkamer (figuur 3A) vóór de dienst en vervolgens na 1, 2, 4, 8, 14 en 20 minuten. Het medium dat werd gebruikt voor celgroei had opzettelijk een tekort aan tryptofaan om de UV-absorptie door dit aromatische aminozuur te verminderen. Merk op dat het het beste is om synthetisch medium te gebruiken dat gefilterd is, omdat autoclaveren van het medium kan leiden tot karamelisatie van de suikers. Dit vermindert vervolgens de cross-linking efficiëntie.
Figuur 4A toont een representatieve autoradiograaf van een χCRAC-experiment. In dit voorbeeld zijn de monsters niet samengevoegd. In plaats daarvan werd elk afzonderlijk op de gel uitgevoerd. Dit wordt aanbevolen voor initiële experimentele tests om aan te tonen dat het eiwit effectief cross-linkt naar RNA op alle geteste tijdstippen. Een bijzonder intens signaal werd waargenomen bij het verwachte molecuulgewicht van de RBP, dat het eiwit vertegenwoordigt dat gebonden is aan zeer korte, radioactief gelabelde RNA's die niet vatbaar zijn voor sequencing. Daarom werd het uitstrijksignaal boven deze band, het eiwit dat is verknoopt met langere RNA-fragmenten, geïsoleerd. Het fragment werd gesneden van net boven de eiwitband plus ongeveer 30 kDa. Figuur 4B toont een autoradiogram na excisie, waarbij het eiwit verknoopt is met korte RNA's die in de gel zijn achtergebleven en het voorheen uitstrijksignaal nu is weggesneden.
Na reverse transcriptie moet de cDNA-bibliotheek worden versterkt met behulp van PCR. Overamplificatie van de bibliotheek moet echter worden vermeden, omdat dit vertekening kan introduceren ten opzichte van sequenties die bij voorkeur door het polymerase worden versterkt en PCR-artefacten genereren. Overversterkte bibliotheken bevatten ook een groot aantal dubbele sequenties die afval leest op de sequencer. Om het ideale aantal PCR-cycli voor amplificatie van de uiteindelijke bibliotheek te berekenen, werd een aliquot van het cDNA versterkt door qPCR met behulp van de P5- en BC-oligonucleotiden. De eerste cyclus waarbij de bibliotheek piekfluorescentie bereikte, werd gekozen als de PCR-cyclustelling. Figuur 4C geeft een voorbeeld van een qPCR uit een typische cDNA-bibliotheek, die een piekcyclustelling van 16 opleverde. Deze waarde werd vervolgens gebruikt voor de uiteindelijke χCRAC PCR. Om de gesequentieerde gegevens te verwerken, gebruikten we software die eerder in ons lab was ontwikkeld (pyCRAC) en de bijbehorende pijplijn voor analyse van de kinetische CRAC-gegevens (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Deze open source softwaretools maken het mogelijk om de gegevens te demultiplexen en bij te snijden, PCR-duplicaten te verwijderen, statistisch significante pieken te identificeren, clusterinlezingen in aaneengesloten sequenties en bindingsmotieven te identificeren39. Meer informatie over hoe deze tools werken, is te vinden op hun respectieve webpagina's.
We zijn ook begonnen met het ontwikkelen van een χCRAC-protocol voor zoogdiercellen. De meeste cellijnen van zoogdieren worden gekweekt als een monolaag en het bakje in onze crosslinker met de UV-doorlatende zak is niet geschikt voor experimenten met aanhangende cellen. Om dit probleem op te lossen, hebben we een fase ontwikkeld waarin gebruikers 1-2 petrischalen (150 mm diameter en 25 mm diep) kunnen UV-bestralen met aanhangende cellen (figuur 3B). Als eerste test werd de efficiëntie van de cross-linker voor zoogdiercellen gemeten door cross-linking en capture van stabiel gelabelde GFP-RBM7 met behulp van anti-GFP-antilichamen en een traditionele CLIP-gebaseerde zuivering. Zoals te zien is in figuur 5A, was de cross-linker in staat om eiwit-RNA-complexen te herstellen uit zoogdiercellen die als een monolaag werden gekweekt met behulp van 254 nm UV-bestraling met efficiënties die vergelijkbaar zijn met een veelgebruikt UV-bestralingsapparaat. Standaard celkweek plasticware die normaal gesproken wordt gebruikt voor UV-crosslinkingexperimenten is echter ondoordringbaar tot 254 nm UV. Daarom zouden de cellen in onze cross-linker alleen bestraling ontvangen van de bovenste bank van UV-lampen. Om dit te ondervangen, ontwikkelden we een UV-doorlatende kwarts petrischaal voor celgroei en cross-linking. Het gebruik van de kwartscultuurware toonde een robuust herstel van eiwit-RNA-complexen met slechts 2 s UV-bestraling (figuur 5B). In combinatie met RBP-opnamemethoden voor zoogdiercellen zoals CLIP-technologieën, zijn deze korte crosslinkingtijden vatbaar voor tijdscursussen om spatiotemporale RNA-bindingsprofielen van RBP's te herstellen als reactie op genotoxische spanningen of snelle uitputting van eiwitfactoren, of parallel met transcriptionele of celcyclussynchronisatie.
Figuur 6 toont verschillende voorbeelden van de Nrd1-gegevens die door de χCRAC-pijplijn worden verwerkt. Dit cijfer is opgesteld met behulp van de bedgraph-bestanden die zijn gegenereerd door de pijplijn en het python GenomeBrowser-pakket (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), dat we hebben ontworpen om het maken van genoombrowserafbeeldingen van publicatiekwaliteit van de gegevens te vereenvoudigen. De grijze rechthoeken vertegenwoordigen genomische gebieden die niet-coderende RNA's tot expressie brachten, zoals de cryptische onstabiele transcriptie (CUTs), stabiele niet-gekarakteriseerde transcripten (SUTs)40 en Xrn1-gevoelige onstabiele transcripten (XUTs)41. De gegevens in figuur 6 laten zien dat Nrd1 bindt aan veel van deze niet-coderende RNA-transcripten, in overeenstemming met het idee dat dit eiwit betrokken is bij de afbraak van deze klasse transcripten42. Figuur 6A toont een ~15 kb gebied op chromosoom IV. Hier was er een significante toename in de binding van Nrd1 aan transcripties die coderen voor de glucosetransporters HXT6 en HXT7 met hoge affiniteit, die beide worden geupreguleerd tijdens glucose-uithongering. Het is waarschijnlijk dat transcriptiebeëindiging door het NNS-complex de inductiekinetiek van deze genen tijdens glucose-uithongering kan beïnvloeden. Figuur 6B toont een voorbeeld van Nrd1 crosslinking naar het Imd3-transcript, waarvan bekend is dat het wordt gereguleerd door Nab343. In dit geval toonden de gegevens een significante vermindering van de binding aan glucose-uithongering. Eerder werk toonde een verminderde binding van Nab3 aan het Tye7-transcript tijdens glucose-uithongering44. In overeenstemming met deze waarneming suggereren de χCRAC-gegevens dat de binding van Nrd1 afnam tijdens glucose-uithongering en dat de kruiskoppeling van Nrd1 met Tye7 het laagst was na 8 minuten stress (figuur 4C). Het lijkt er echter op dat dit effect slechts van voorbijgaande aard was, want na 14 minuten glucose-uithongering ging de Nrd1-binding terug naar de beginniveaus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Figuur 1: Schematische weergave van het χCRAC-protocol. Gelabelde soorten werden gekweekt tot de gewenste dichtheid. RBP duidt op RNA-bindend eiwit. Daarna werd een referentiemonster genomen en verknoopt met 254 nm UV-licht. De resterende cellen werden geoogst door filtratie en vervolgens snel verschoven naar het stress-inducerende medium. Voor het hier beschreven χCRAC-experiment werden monsters genomen en 1, 2, 4, 8, 14 en 20 minuten na de dienst aan elkaar gekoppeld (1). Het RBP van belang werd vervolgens gezuiverd met behulp van een zeer strenge tweestaps affiniteitszuivering (2). Vervolgens werden de gevangen cross-linked RNA's gedeeltelijk verteerd met RNases, radioactief gelabeld aan het 5'-uiteinde en adapters werden erop geligeerd (3). De 5'-adapters bevatten unieke "in-read" barcodesequenties, zodat de afzonderlijke monsters bioinformatisch konden worden gescheiden na sequencing. De RBP-RNA-complexen werden vervolgens geëlueerd, samengevoegd en samen neergeslagen (4), opgelost door SDS-PAGE en gevisualiseerd door autoradiografie (5). Vervolgens werd een enkele gelplak met het radioactieve signaal net boven de hoofdband, geïllustreerd met een onderbroken rood vak in het autoradiografiebeeld, uit de gel gesneden (5). De plakjes gel werden behandeld met protease K en het RNA werd vervolgens geëxtraheerd (6), omgezet in cDNA's en versterkt via PCR (7). De PCR-stap introduceerde extra barcodes (geel blok geïntroduceerd door P7 oligo) zodat veel bibliotheken in één rijstrook konden worden gemultiplext. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figuur 2: Cross-linking en vacuümfiltratie. (A) De cross-linker. De celsuspensie wordt in een trechter rechtsboven in de machine gegoten (zie ook figuur 3A voor een close-up) en in een UV-transparante zak in de middelste lade gehouden. Deze zak wordt geflankeerd door twee luiken die gesloten blijven totdat de gebruiker de machine instrueert om de bestralingsstap te starten. De cellen worden bestraald met UV-licht uit de trays zowel boven als onder. De machine wordt geleverd met 254 en 365 nm UV-lampen, waarbij de laatste toepasbaar is voor PAR-CLIP experimenten. De machine wordt bediend via een touchscreen-paneel rechtsboven, waarmee men de UV-dosering of blootstellingstijd kan regelen. (B) Na crosslinking worden de cellen aan de linkerkant van de machine afgevoerd. Celsuspensies worden teruggewonnen door middel van vacuüm en afgetapt in een glazen kolf waar ze vervolgens in een vacuümfiltratie-apparaat kunnen worden gegoten voor het oogsten. (C) Vacuümfiltratie-inrichtingen. Deze worden via een clip geopend en gesloten en er wordt een filter tussen geplaatst. Vier filtratie-apparaten werden parallel gebruikt voor zeer korte tijdreeksen om geen tijd te verliezen als gevolg van het vervangen van filters. D) Na filtratie werd het mediasupernatant in kolven afgetapt om vervolgens te worden verwijderd. Onder de vacuümfiltratie-apparaten werden kleppen geïnstalleerd om het vacuüm in het systeem te behouden wanneer het filter wordt verwijderd. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figuur 3: Cross-linking van gesuspendeerde versus aanhangende cellen. (A) De cross-linker met de Vari-X-linker kamer voor suspensiecellen. De celcultuur wordt in de monsterinlaat (trechter) in de rechterbovenhoek van de lade gegoten. (B) Lade die plastic of kwarts petrischalen kan bevatten voor het verbinden van hechtende cellen of kleine volumes suspensiecellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figuur 4: Bibliotheekvoorbereiding. (A) Voorbeeld van een autoradiogram van een Nrd1-HTP χCRAC experiment. Het sterke, geconcentreerde signaal vertegenwoordigt het eiwit dat is verknoopt met zeer korte RNA's, terwijl het uitstrijkje hierboven het eiwit vertegenwoordigt dat is verknoopt met RNA's van voldoende lengte voor sequencing. (B) Het uitstrijkje werd weggesneden zoals blijkt uit een autoradiogram dat werd gemaakt na gelexcisie. (C) Een representatieve qPCR uit een χCRAC cDNA-bibliotheek. In dit voorbeeld werd de maximale amplificatie van het cDNA bereikt bij 16 cycli. Zo werden 16 cycli gebruikt voor de uiteindelijke versterking. De foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie van drie technische qPCR-replicaties. (D) Voorbeeld van een fosforbeeld uit een cDNA-bibliotheek op een 6% TBE-gel. (E) cDNA-lengte- en kwaliteitsanalyse van een op chips gebaseerde capillaire elektroforese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figuur 5: High RNase test iCLIP experiment om crosslinking in zoogdiercellen te testen. Getoond zijn autoradiogrammen van GFP-RBM7 iCLIP-experimenten die de efficiëntie van RNP-herstel over verschillende cross-linking energieën testten. Immunoprecipitaties werden uitgevoerd met behulp van anti-GFP-antilichamen gekoppeld aan magnetische kralen op verknoopte cellen die stabiel GFP-RBM7 tot expressie brachten. Immunoprecipitaten werden geïncubeerd met hoge concentraties RNase I om geassocieerde RNA's in te korte, uniforme lengtes. RNP's werden gevisualiseerd door 32P-labeling en SDS-PAGE en migreren als een gedefinieerde band, dicht bij de migratie van het niet-verknoopte eiwit. Kwantificering geeft de resultaten aan van densitometrische analyses van radioactief gelabeld RBM7-RNA-signaal genormaliseerd naar het anti-GFP western blot-signaal. (A) Cross-linking tijdsverloop van de veelgebruikte UVP cross-linker versus onze cross-linker (Vari-X-linker; VxL). (B) Cross-linking time-course van onze cross-linker op kwarts (links) en plastic (rechts) cultureware. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figuur 6: Voorbeeld van genoombrowserplots die de kracht van χCRAC laten zien om differentiële, temporele binding van Nrd1 aan zijn doelen weer te geven. Elk vak toont plots voor individuele genomische regio's. De pijlen geven aan op welke streng de genen zijn gecodeerd (links wijzende pijl = min streng; rechts wijzende pijl = plus streng). De tijdspunten (min) worden aangegeven door t0, t1, t2, etc op de y-assen van elke subplot. Romeinse cijfers die de chromosomen en de coördinaten aangeven, worden weergegeven. (A) Bij glucosedeprivatie bindt Nrd1 twee glucosetransporters met hoge affiniteit, HXT6 en HXT7, die beide in deze toestand upregulated zijn. (B) Nrd1 wordt waargenomen om te binden aan Imd3, een reeds gevalideerd doelwit van Nab344, met een afnemende intensiteit na glucose-uithongering. (C) Nrd1-binding van Tye7 vertoont een dynamisch en voorbijgaand karakter, afnemend na glucose-uithongering tot een minimum na 8 minuten stress. De binding keert echter na 14 minuten terug naar basale niveaus. Reads werden genormaliseerd naar "reads per million" (RPM; y-as). Grijze vakken geven gebieden aan die coderen voor niet-coderende RNA's. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Kinetische cross-linking en analyse van cDNA is een methode die onderzoek mogelijk maakt naar de dynamiek van eiwit-RNA interacties in levende cellen met een hoge temporele resolutie. Hier wordt het protocol in detail beschreven, inclusief de groei van gistcellen, UV-crosslinking, oogsten, eiwitzuivering en voorbereidingsstappen voor de volgende generatie sequencingbibliotheek.

Monitoring van eiwit-RNA interactiedynamica in vivo bij hoge temporele resolutie met behulp van χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Hoge resolutie single particle analyse van elektroncryo-microscopie beelden met behulp van SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Met behulp van In Vitro fluorescentie Resonance Energy Transfer te bestuderen van de dynamiek van eiwitcomplexen op de tijdschaal van een milliseconde

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo calcium beeldvorming in C. elegans lichaam muur spieren

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteoom bestrijkende kwantificering van Labeling homogeniteit op het niveau van één molecuul

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Onderzoek van de dynamiek van cellulaire hechting en verspreiding van epitheliale cellen op fibronectine tijdens oxidatieve stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kwantificering van eiwit interactie netwerk dynamiek met Multiplexed co-immunoprecipitatie

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy om eiwit-eiwitinteractie en eiwitdynamica in levende cellen te bestuderen

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring eiwitaggregatiekinetiek in vivo met behulp van geautomatiseerde inclusietelling bij Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...