Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse des Wellcome Trust (091549 an S.G und 109093/Z/15/A an S.M.), des Wellcome Trust Centre for Cell Biology Core Grant (092076) und des Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 an S.G.), der European Molecular Biology Organization im Rahmen eines langfristigen Postdoc-Stipendiums (ALTF 1070-2017 an R.A.C.), und dem Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

A. Langford und W. Worboys sind mit UVO3, einem Handelsunternehmen, verbunden. Sie spielten keine Rolle beim Studiendesign, bei der Datenerhebung und -interpretation oder bei der Entscheidung, die Arbeit zur Veröffentlichung einzureichen.

Die χCRAC-Methode hat in Kombination mit den neuen Vernetzungs- und Zellerntegeräten ein großes Potenzial, da sie auf ein breites Spektrum von Modellorganismen anwendbar ist und daher für das RNA-Feld von allgemeinem Interesse sein sollte. Es gibt viele Bereiche, in denen χCRAC eingesetzt werden kann. Mit der Methode ließe sich beispielsweise die hierarchische Anordnung von Proteinen zu großen makromolekularen Komplexen wie dem Spleißosom und dem Ribosom messen, bei der es häufig zu dynamischen Wechselwirkungen zwischen Proteinen und RNA-Molekülen kommt. Wir verwenden es jetzt auch routinemäßig, um Wechselwirkungen zwischen RNA-Zerfallsfaktoren und ihren Substraten zu überwachen, wenn Zellen verschiedenen Arten von Stress ausgesetzt sind. Auf diese Weise können wir bestimmen, in welchem Stadium der adaptiven Reaktion diese Faktoren am aktivsten sind, an welche Substrate sie binden und wie dynamisch diese Wechselwirkungen sind. Solche Daten sollen es den Forschern ermöglichen, den relativen Beitrag jedes Faktors zur Anpassung an Umweltveränderungen zu bestimmen.
χCRAC verwendet duale Affinitätsreinigungs-Tags (HTF oder HTP), um das Protein unter hochstringenten und denaturierenden Bedingungen zu reinigen. Dadurch wird sichergestellt, dass die kogereinigte RNA stark für RNAs angereichert ist, die kovalent mit dem interessierenden Protein vernetzt waren. Die Verwendung von Affinitätstags hat jedoch Nachteile. Zum Beispiel könnte der Tag die Funktion des Proteins stören, was zu einem verzerrten Auslesen seines RNA-bindenden Interaktoms führen könnte. Darüber hinaus ist es für einige Modellorganismen möglicherweise nicht immer möglich, Tags zu verwenden, da die genetischen Werkzeuge zur Integration von DNA-Fragmenten in das Genom oder zur Transformation von Expressionsplasmiden noch nicht verfügbar sind. Es ist jedoch einfach, einige Teile des χCRAC-Protokolls zu ändern, um es mit CLIP-basierten Protokollen kompatibel zu machen, die auf Antikörper zur Aufreinigung des RBP angewiesen sind. Tatsächlich hat diese Studie gezeigt, dass es möglich ist, iCLIP-basierte Reinigungen mit unserem Vernetzer zu kombinieren. Wir sind gerade dabei, CLIP-Protokolle zu entwickeln, um die zeitliche Assoziation von humanen RNA-bindenden Proteinen mit entstehenden RNA-Transkripten zu untersuchen.
Bei der Durchführung von χCRAC an einem neuen Protein muss die UV-Belichtung optimiert werden, um eine maximale Vernetzung zu induzieren. Dies ist wichtig, da hohe UV-Strahlen die Rückgewinnung von RNA während des Aufreinigungsschritts verringern können. Zellen, die das rekombinante RBP exprimierten, wurden verschiedenen UV-Dosen ausgesetzt: 100 mJ/cm2, 250 mJ/cm2, 500 mJ/cm2 und 1 J/cm2. Anschließend wurden die RNPs eingefangen und die RNAs fragmentiert und radioaktiv markiert. Anschließend wurden die RNPs mittels SDS-PAGE aufgelöst und ein Autoradiogramm erstellt, um daraus abzuleiten, welche Belichtung das intensivste Signal lieferte (d.h. die maximale Vernetzung).
Sobald die Versuchsbedingungen optimiert sind, werden bei der Durchführung von χCRAC mehrere Kontrollexperimente empfohlen. Zunächst kann eine UV-bestrahlte, nicht markierte Probe verwendet werden, um die Hintergrundbindung an die Reinigungsperlen zu überwachen. Zweitens ermöglicht eine zweite Zeitreihe, in der die Zellen in das ursprüngliche Medium zurückverschoben werden, bei der Anwendung von χCRAC während eines Shift-Experiments untersucht, ob die Filtration der Zellen selbst Veränderungen des RNA-Niveaus oder Protein-RNA-Interaktionen induziert.
Wie in der Einleitung erwähnt, schlagen zahlreiche kürzlich veröffentlichte Arbeiten eine Reihe von Optimierungen des CLIP-Protokolls vor. Dies schließt die Verwendung von fluoreszenzmarkierten Adaptern zur Detektion des Protein-RNA-Komplexes durch Infrarot-Abtastung10 sowie Optimierungen an verschiedenen Nukleinsäurereinigungs- und Größenauswahlschritten ein, die die Komplexität der resultierenden Bibliotheken 12,45 erhöhen. Wir implementieren derzeit einige dieser Verbesserungen, um das χCRAC-Protokoll weiter zu verfeinern. Das hier vorgestellte Protokoll enthält bereits eine Reihe von Verbesserungen gegenüber den ursprünglichen CRAC- und χCRAC-Protokollen, die die Komplexität der Daten erhöhen. Zuvor wurden beispielsweise die vernetzten, radioaktiven Protein-RNA-Komplexe auf SDS-PAGE-Gelen nach der Auflösung auf eine Nitrozellulosemembran übertragen und die vernetzte RNA aus dem Blot isoliert. Der Transfer des RNP und die anschließende RNA-Extraktion können jedoch sehr ineffizient sein, insbesondere wenn es sich um große RBPs wie RNA-Polymerase-Untereinheiten handelt. Dies kann zu einer deutlichen Verringerung der Rückgewinnung der vernetzten RNA führen. Im aktuellen Protokoll wird die vernetzte RNA direkt aus SDS-PAGE-Gelschnitten extrahiert, wie in Abbildung 1 dargestellt. Dies erhöhte die Rückgewinnung von vernetzten RNAs. Zusätzlich wurde das Produkt nach PCR-Amplifikation der cDNAs ursprünglich auf 3%-Agarosegele mit niedriger Schmelztemperatur aufgelöst und anschließend 175–300 bp PCR-Produkte aus dem Gel extrahiert. Diese Gele können jedoch leicht überladen werden, was zu einer sehr schlechten Trennung der DNA führt. Der Ersatz von Agarosegelen durch vorgefertigte FSME-Gele führte zu einer gleichmäßigeren Größentrennung und einer besseren Rückgewinnung von PCR-Produkten.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNAs sind oft auf RBPs angewiesen, um ihre Funktion auszuüben, was zu einem großen Interesse am Verständnis der Dynamik zwischen diesen Molekülen geführt hat. Viele RBPs wurden in einer Vielzahl von Organismen identifiziert. Es war jedoch schon immer bekanntermaßen schwierig, RBP-RNA-Interaktionen in vivo zu untersuchen. Ein großer Durchbruch bei der Untersuchung solcher Wechselwirkungen kam mit dem Aufkommen von CLIP1. Diese Methode nutzt ultraviolette (UV, 254 nm) Bestrahlung, um kovalente Bindungen zwischen RBPs und ihren direkt gebundenen RNAs zu induzieren (d. h. Quervernetzung ohne Abstand). Anschließend wird das zu untersuchende RBP unter strengen Bedingungen immungereinigt, um sicherzustellen, dass nur RNAs identifiziert werden, die kovalent mit den Proteinen vernetzt sind. Gebundene RNAs werden dann teilweise mit RNasen verdaut und anschließend zur Sequenzierung in cDNA-Bibliotheken umgewandelt. Die hohe Aufreinigungsstringenz ist wichtig, da sie die Spezifität der Protein- und RNA-Rückgewinnung erheblich erhöht, was auch durch die SDS-PAGE-Aufreinigung des vernetzten Ribonukleoprotein-Komplexes (RNP) weiter verbessert wird. CLIP und verwandte Methoden liefern auch Einblicke in die Nukleotidauflösung der Proteinbindungsstelle, da während der Herstellung der Sequenzierungsbibliothek Aminosäuren, die mit der RNA vernetzt sind, häufig die reverse Transkriptase beenden oder das Enzym veranlassen, Mutationen an dieser Stelle einzuführen 1,2,3.
Seit seiner Einführung hat das ursprüngliche CLIP-Protokoll eine bemerkenswerte Vielfalt an abgeleiteten Methoden hervorgebracht. Ein besonders wichtiger Durchbruch war die Entwicklung von HITS-CLIP (oder CLIP-seq), das die Hochdurchsatzsequenzierung mit dem CLIP-Ansatz3 verbindet. Dies wurde seither von allen CLIP-basierten Methoden übernommen. iCLIP führte Verbesserungen in den RNase-vermittelten Trimm- und Adaptorligationstechniken ein, die eine genauere Kartierung der RBP-Bindungsstellen ermöglichen4. PAR-CLIP kombinierte die 4thio-uridin/Uracil-Markierung mit der Vernetzung bei 365 nm und ermöglichte so die Kartierung von Vernetzungsstellen durch die Analyse von T-C-Substitutionen5. CRAC, Urea-iCLIP, dCLIP und uvCLAP führten Denaturierungsbedingungen und duale Affinitätsreinigungsschritte ein, die die Hintergrundbindung an das Affinitätsharz weiter reduzieren und die Spezifität des Proteineinfangs weiter erhöhen 2,6,7,8,9. Darüber hinaus führten CRAC, uvCLAP und dCLIP die Markierung des interessierenden RBP mit einem Affinitäts-Tag ein, wodurch die Notwendigkeit der Generierung spezifischer Antikörper überwunden wurde.
Es wurden auch mehrere Optimierungen vorgenommen, um die CLIP-Methodik zu beschleunigen. Das ursprüngliche CLIP-Protokoll nutzte die radioaktive Markierung der gefangenen RNAs, um die RBP-RNA-Komplexe nach SDS-PAGE sichtbar zu machen. Der Einsatz von Radioaktivität kann jedoch für Laboratorien, die nicht für solche Arbeiten eingerichtet sind, problematisch sein. irCLIP enthält einen Fluorophor-gekoppelten Adapter, der die Visualisierung durch Infrarot-Bildgebung10 erleichtert, und sCLIP nutzt die Biotinylierung von eingefangenen RNAs, um sie durch Streptavidin-konjugiertes HRP11 zu visualisieren. Darüber hinaus verzichtet eCLIP komplett auf die RNA-Markierung; Stattdessen wird das Protein allein aufgrund seiner bekannten Größe12 herausgeschnitten. Die Streptavidin-basierte Aufreinigung wurde auch verwendet, um den Prozess der Bibliotheksvorbereitung in FAST-iCLIP zu beschleunigen, bei dem ein biotinylierter 3'-Adapter auf die RNAs ligiert und verwendet wird, um die Aufreinigung nach reverser Transkription und Zirkularisierung zu ermöglichen13. Zusätzliche Erweiterungen des iCLIP-Protokolls erhöhten auch die Komplexität der Bibliothekenerheblich 4.
Schließlich wurde CLIP modifiziert, um das Einfangen von RBPs aus verschiedenen zellulären Subkompartimenten zu ermöglichen 14,15, um neu transkribierte RNAs durch gepulste Induktion der photoaktivierbaren Ribonukleoside 5,16,17 sichtbar zu machen, um methylierte RNAseinzufangen 18,19,20, um RNA-RNA-Interaktionen 21,22 zu untersuchen und um 3'-Enden zu kartieren 23,24.
Trotz des großen Beitrags von CLIP-basierten Techniken zum Verständnis der Wechselwirkungen zwischen RBPs und RNAs wurde dies durch die Ineffizienz der UV-Vernetzung eingeschränkt. Während in einer Monoschicht gezüchtete Kulturzellen in der Regel relativ einfach zu vernetzen sind, ist dies in Geweben oder Zellen in Lösung deutlich schwieriger. Gewebe kann mehrere Runden UV-Bestrahlung erfordern, um in die erforderlichen Zellschichten einzudringen, während mikrobielle Zellen oft in reichhaltigen Medien gezüchtet werden, die aromatische, UV-absorbierende Verbindungen enthalten25. Tatsächlich wurden UV-Bestrahlungszeiten von bis zu 30 Minuten verwendet, um eine ausreichende Vernetzung zwischen RBPs und ihren gebundenen RNAs für solche Proben zu erzeugen26,27,28. Diese ausgedehnte UV-Exposition induziert Stressreaktionen innerhalb der Zelle, wie z. B. UV-induzierte DNA-Schäden, die in einigen Anwendungen die endgültigen Daten kontaminieren können.
Die Mehrzahl der CLIP-Studien konzentrierte sich auf die Erstellung einzelner "Momentaufnahmen" spezifischer Protein-RNA-Interaktionen in einer Zelle. Protein-RNA-Interaktionen sind jedoch von Natur aus dynamisch, insbesondere wenn Zellen Veränderungen in ihrer Umgebung unterliegen. Dies kann eine plötzliche Verringerung der Verfügbarkeit von essentiellen Nährstoffen oder schnelle Temperaturänderungen umfassen. Um die Rolle eines RBP während Stress wirklich zu verstehen, ist es daher am besten, zeitaufgelöste Analysen durchzuführen, da sie das gesamte Spektrum der RBP-Ziele während des Stresses erfassen und bestimmen können, in welchem Stadium der Stressantwort das gewählte RBP aktiv ist. Insbesondere Studien an Hefen zeigten, dass die ersten Minuten der Anpassung absolut überlebenswichtig sind und die RNA-Halbwertszeiten in Bakterien von Minuten bis Sekunden variieren können 29,30,31,32,33. Daher sollten solche zeitaufgelösten Analysen idealerweise mit hoher zeitlicher Auflösung durchgeführt werden. Die langen Vernetzungszeiten machen es jedoch besonders schwierig, adaptive Reaktionen im Frühstadium zu untersuchen.
Um diese Probleme zu lösen, haben wir kürzlich eine verbesserte Methode entwickelt, die in der Lage ist, Zellen auf winzigen Zeitskalen zu vernetzen und zu ernten. Unsere χCRAC-Methode ermöglicht die quantitative Messung dynamischer Änderungen in RBP-RNA-Wechselwirkungen mit bisher unerreichter Auflösung. Entscheidend für dieses Verfahren war die Entwicklung einer neuartigen UV-Bestrahlungsvorrichtung32 , die die erforderliche Vernetzungszeit in Hefen und Bakterien in Lösung um das 10-fache reduziert, wodurch RBP-RNA-Wechselwirkungen sofort effektiv eingefroren werden. Um die Zellen nach UV-Bestrahlung schnell zu ernten, haben wir außerdem ein Vakuumfiltrationsgerät entwickelt, das exponentiell wachsende Hefe in einer 0,5-Liter-Kultur in etwa 30 s32 ernten kann. Diese technologischen Innovationen ermöglichen die Untersuchung der RBP-RNA-Dynamik mit einer Auflösung im Minutenbereich. Darüber hinaus haben wir auch mehrere Optimierungen am ursprünglichen CRAC-Protokoll2 vorgenommen, um seine Praktikabilität zu erhöhen.
Mit χCRAC haben wir kürzlich das Targetom eines Hefekern-RBP, Nab3, als Reaktion auf Glukoseentzug untersucht. In Saccharomyces cerevisiae kann Nab3 einen Komplex mit Nrd1, einem RBP und der RNA-Helikase Sen1 bilden, um den NNS-Komplex zu bilden. Die Bindung von NNS an die RNA-Polymerase und das entstehende Transkript kann eine transkriptionelle Terminierung auslösen34. Dieser Komplex ist hauptsächlich an der Entfernung kryptischer, nicht-kodierender RNA-Transkripte beteiligt, reguliert aber auch die Expression proteinkodierender Gene. Die Studie zeigte ein differentielles Targeting von Nab3 auf nicht-kodierende und kodierende Transkripte nach nur einer Minute Stress32. Wir konnten zeigen, dass die co-transkriptionelle Terminierung durch Nab3 zu einer sehr transienten, pulsartigen Expression von Retrotransposon-Genen führt, die mit herkömmlichen CLIP-basierten Ansätzen nur schwer zu detektieren gewesen wäre. Darüber hinaus erhöhten die kurzen UV-Bestrahlungszeiten in unserem UV-Vernetzer auch die Rückgewinnung kurzlebiger nicht-kodierender RNAssignifikant 32. χCRAC wird wahrscheinlich ein entscheidendes Instrument sein, um nicht nur zu verdeutlichen, wie RBPs die Reaktion auf Stress auf unmittelbaren Zeitskalen gestalten, sondern auch ihre sich ändernden Rollen während des gesamten Lebenszyklus einer Reaktion. Dieses Manuskript bietet einen detaillierten Überblick über alle Schritte des χCRAC-Protokolls. Zur Veranschaulichung wurde die Methode verwendet, um das Hefeprotein Nrd1, das an der transkriptionellen Terminierung und dem RNA-Zerfall beteiligt ist35,36, und sein RNA-Targetom als Reaktion auf Glukoseentzug über eine Vielzahl von Zeitpunkten hinweg zu untersuchen. Schließlich zeigen wir auch, dass unsere UV-Bestrahlungseinheit RBPs schnell mit RNA in HeLa-Zellen vernetzen kann, wodurch es möglich ist, auch hochauflösende zeitaufgelöste Analysen in adhärenten Zellen durchzuführen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

Die Interaktion zwischen RNA-bindenden Proteinen (RBPs) und ihren RNA-Substraten weist Fluidität und Komplexität auf. Innerhalb ihrer Lebensdauer kann eine einzelne RNA von vielen verschiedenen RBPs gebunden werden, die ihre Produktion, Stabilität, Aktivität und ihren Abbau regulieren. Daher wurde viel getan, um die Dynamik zu verstehen, die zwischen diesen beiden Arten von Molekülen besteht. Ein besonders wichtiger Durchbruch kam mit dem Aufkommen der "c ross-linking and immunoprecipitation" (CLIP). Diese Technik ermöglichte eine stringente Untersuchung, welche RNAs an ein bestimmtes RBP gebunden sind. Kurz gesagt, das zu untersuchende Protein wird in vivo mit seinen RNA-Substraten UV-vernetzt, unter sehr strengen Bedingungen gereinigt und dann werden die kovalent mit dem Protein vernetzten RNAs in cDNA-Bibliotheken umgewandelt und sequenziert. Seit seiner Konzeption wurden viele abgeleitete Techniken entwickelt, um CLIP für bestimmte Studienbereiche zugänglich zu machen. Die Vernetzung mit ultraviolettem Licht ist jedoch notorisch ineffizient. Dies führt zu verlängerten Expositionszeiten, die eine zeitliche Untersuchung von RBP-RNA-Interaktionen unmöglich machen. Um dieses Problem zu lösen, haben wir kürzlich stark verbesserte UV-Bestrahlungs- und Zellerntegeräte entwickelt und gebaut. Mit diesen neuen Werkzeugen haben wir ein Protokoll für zeitaufgelöste Analysen von RBP-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung entwickelt: Kinetic CRoss-linking und Analysis of cDNAs (χCRAC). Wir haben diese Technik kürzlich verwendet, um die Rolle von Hefe-RBPs bei der Anpassung an Nährstoffstress zu untersuchen. Dieses Manuskript gibt einen detaillierten Überblick über die χCRAC-Methode und präsentiert die jüngsten Ergebnisse, die mit dem Nrd1 RBP erzielt wurden.

Um die Wirksamkeit der χCRAC-Methode zu demonstrieren, wurde ein Zeitverlaufsexperiment mit Hefestämmen durchgeführt, die ein HTP-markiertes Nrd1-Protein exprimieren. Eine detaillierte schematische Darstellung, die die Funktionsweise des Verfahrens beschreibt, ist in Abbildung 1 dargestellt. Wie Nab3 ist auch Nrd1 am Zerfall der nukleären RNA einer Vielzahl von RNA-Transkripten beteiligt37. Frühere Arbeiten aus dem Corden-Labor deuteten darauf hin, dass sich die Bindung von Nrd1 an seine RNA-Ziele signifikant ändert, wenn Zellen einem Glukosemangel ausgesetzt sind28,38. Daher wurden Zellen, die exponentiell in glukosehaltigem Medium (SD-TRP) wuchsen, über einen bestimmten Zeitverlauf in dasselbe Medium ohne Glukose (S-TRP) verschoben, um dynamische Veränderungen in den Nrd1-RNA-Interaktionen zu beobachten. Die Proben wurden in der Vari-X-Linkerkammer (Abbildung 3A) vor der Schicht und dann nach 1, 2, 4, 8, 14 und 20 min entnommen und vernetzt. Das für das Zellwachstum verwendete Medium enthielt absichtlich einen Mangel an Tryptophan, um die UV-Absorption durch diese aromatische Aminosäure zu reduzieren. Beachten Sie, dass es am besten ist, synthetisches Medium zu verwenden, das filtersterilisiert ist, da das Autoklavieren des Mediums zu einer Karamellisierung des Zuckers führen kann. Dies verringert dann die Vernetzungseffizienz.
Abbildung 4A zeigt eine repräsentative Autoröntgenaufnahme aus einem χCRAC-Experiment. Beachten Sie, dass in diesem Beispiel die Stichproben nicht zusammengefasst wurden. Stattdessen wurde jeder einzeln auf dem Gel ausgeführt. Dies wird für erste experimentelle Tests empfohlen, um zu zeigen, dass das Protein zu allen getesteten Zeitpunkten effektiv mit RNA vernetzt. Ein besonders intensives Signal wurde beim erwarteten Molekulargewicht des RBP beobachtet, das das Protein repräsentiert, das an sehr kurze, radioaktiv markierte RNAs gebunden ist, die nicht für eine Sequenzierung geeignet sind. Dazu wurde das Schmiersignal oberhalb dieser Bande, das mit längeren RNA-Fragmenten vernetzt ist, isoliert. Das Fragment wurde knapp oberhalb der Proteinbande plus etwa 30 kDa geschnitten. Abbildung 4B zeigt ein Autoradiogramm nach der Exzision, bei dem das Protein mit kurzen RNAs vernetzt ist, die im Gel verbleiben, und das zuvor abstrichige Signal nun herausgeschnitten wird.
Nach der reversen Transkription muss die cDNA-Bibliothek mittels PCR amplifiziert werden. Eine Überamplifikation der Bibliothek muss jedoch vermieden werden, da dies zu einer Verzerrung gegenüber Sequenzen führen kann, die bevorzugt von der Polymerase amplifiziert werden, und PCR-Artefakte erzeugen kann. Überverstärkte Bibliotheken enthalten auch eine große Anzahl doppelter Sequenzen, die Lesevorgänge auf dem Sequenzer verschwenden. Um die ideale Anzahl von PCR-Zyklen für die Amplifikation der finalen Bibliothek zu berechnen, wurde ein aliquoter Teil der cDNA mittels qPCR mit den P5- und BC-Oligonukleotiden amplifiziert. Der erste Zyklus, bei dem die Bibliothek den Höhepunkt der Fluoreszenz erreichte, wurde als PCR-Zykluszählung gewählt. Abbildung 4C zeigt ein Beispiel für eine qPCR aus einer typischen cDNA-Bibliothek, die eine maximale Zykluszahl von 16 ergab. Dieser Wert wurde dann für die abschließende χCRAC-PCR verwendet. Um die sequenzierten Daten zu verarbeiten, verwendeten wir eine zuvor in unserem Labor entwickelte Software (pyCRAC) und die entsprechende Pipeline zur Analyse der kinetischen CRAC-Daten (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Diese Open-Source-Softwarewerkzeuge ermöglichen das Demultiplexen und Trimmen der Daten, das Entfernen von PCR-Duplikaten, die Identifizierung statistisch signifikanter Peaks, das Einlesen von Clustern in zusammenhängende Sequenzen und die Identifizierung von Bindungsmotiven39. Weitere Informationen zur Funktionsweise dieser Tools finden Sie auf den jeweiligen Webseiten.
Wir haben auch mit der Entwicklung eines χCRAC-Protokolls für Säugetierzellen begonnen. Die Mehrzahl der Säugetierzelllinien wird als Monoschicht gezüchtet und die Schale in unserem Vernetzer mit dem UV-durchlässigen Beutel ist für Experimente mit adhärenten Zellen nicht geeignet. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine Stufe entwickelt, bei der Benutzer 1–2 Petrischalen (150 mm Durchmesser und 25 mm Tiefe) mit adhärenten Zellen UV-bestrahlen können (Abbildung 3B). In einem ersten Test wurde die Effizienz des Vernetzers für Säugetierzellen durch Vernetzung und Einfangen von stabil markiertem GFP-RBM7 unter Verwendung von Anti-GFP-Antikörpern und einer traditionellen CLIP-basierten Aufreinigung gemessen. Wie in Abbildung 5A gezeigt, war der Vernetzer in der Lage, Protein-RNA-Komplexe aus Säugetierzellen, die als Monoschicht gezüchtet wurden, unter Verwendung von 254 nm UV-Bestrahlung mit Wirkungsgraden zu gewinnen, die mit einem weit verbreiteten UV-Bestrahlungsgerät vergleichbar sind. Standard-Zellkulturkunststoffe, die normalerweise für UV-Vernetzungsexperimente verwendet werden, sind jedoch bis 254 nm UV undurchdringlich. Daher würden die Zellen in unserem Vernetzer nur von der oberen Bank der UV-Lampen bestrahlt. Um dies zu überwinden, haben wir eine UV-durchlässige Quarz-Petrischale für Zellwachstum und Vernetzung entwickelt. Die Verwendung der Quarzkulturen zeigte eine robuste Rückgewinnung von Protein-RNA-Komplexen mit nur 2 s UV-Bestrahlung (Abbildung 5B). In Kombination mit RBP-Capture-Methoden für Säugetierzellen wie der CLIP-Technologie sind diese kurzen Vernetzungszeiten mit Zeitverläufen möglich, um raumzeitliche RNA-Bindungsprofile von RBPs als Reaktion auf genotoxischen Stress oder schnelle Verarmung von Proteinfaktoren oder parallel zur Transkriptions- oder Zellzyklussynchronisation zu erhalten.
Abbildung 6 zeigt mehrere Beispiele für die Nrd1-Daten, die von der χCRAC-Pipeline verarbeitet werden. Diese Abbildung wurde unter Verwendung der von der Pipeline generierten Bedgraph-Dateien und des Python-GenomeBrowser-Pakets (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/) erstellt, das wir entworfen haben, um die Erstellung von Genombrowserbildern der Daten in Publikationsqualität zu vereinfachen. Die grauen Rechtecke stellen genomische Regionen dar, die nicht-kodierende RNAs exprimieren, wie z. B. das kryptische instabile Transkript (CUTs), stabile uncharakterisierte Transkripte (SUTs)40 und Xrn1-sensitive instabile Transkripte (XUTs)41. Die Daten in Abbildung 6 zeigen, dass Nrd1 an viele dieser nicht-kodierenden RNA-Transkripte bindet, was mit der Idee übereinstimmt, dass dieses Protein am Abbau dieser Klasse von Transkripten beteiligt ist42. Abbildung 6A zeigt eine ~15 kb große Region auf Chromosom IV. Hier kam es zu einem signifikanten Anstieg der Bindung von Nrd1 an Transkripte, die für die hochaffinen Glukosetransporter HXT6 und HXT7 kodieren, die beide während des Glukosemangels hochreguliert werden. Es ist wahrscheinlich, dass die Beendigung der Transkription durch den NNS-Komplex die Induktionskinetik dieser Gene während des Glukosemangels beeinflussen kann. Abbildung 6B zeigt ein Beispiel für die Quervernetzung von Nrd1 zum Imd3-Transkript, von dem bekannt ist, dass es durch Nab3reguliert wird 43. In diesem Fall zeigten die Daten eine signifikante Verringerung der Bindung bei Glukosemangel. Frühere Arbeiten zeigten eine verminderte Bindung von Nab3 an das Tye7-Transkript während des Glukosemangels44. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung deuten die χCRAC-Daten darauf hin, dass die Bindung von Nrd1 während des Glukosemangels abnahm und die Quervernetzung von Nrd1 zu Tye7 nach 8 Minuten Stress am niedrigsten war (Abbildung 4C). Es scheint jedoch, dass dieser Effekt nur vorübergehend war, denn nach 14 Minuten Glukosemangel ging die Nrd1-Bindung wieder auf das Ausgangsniveau zurück.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des χCRAC-Protokolls. Getaggte Sorten wurden bis zur gewünschten Dichte angebaut. RBP steht für ein RNA-bindendes Protein. Anschließend wurde eine Referenzprobe entnommen und mit 254 nm UV-Licht vernetzt. Die verbleibenden Zellen wurden durch Filtration geerntet und dann schnell in das stressauslösende Medium überführt. Für das hier beschriebene χCRAC-Experiment wurden 1, 2, 4, 8, 14 und 20 min nach der Verschiebung Proben entnommen und vernetzt (1). Das zu untersuchende RBP wurde dann mit einer hochstringenten zweistufigen Affinitätsreinigung gereinigt (2). Als nächstes wurden die eingefangenen vernetzten RNAs teilweise mit RNasen verdaut, am 5'-Ende radioaktiv markiert und mit Adaptern ligiert (3). Die 5'-Adapter enthielten eindeutige "In-Read"-Barcode-Sequenzen, so dass die einzelnen Proben nach der Sequenzierung bioinformatisch getrennt werden konnten. Die RBP-RNA-Komplexe wurden dann eluiert, gepoolt und zusammen ausgefällt (4), mittels SDS-PAGE aufgelöst und mittels Autoradiographie sichtbar gemacht (5). Anschließend wurde ein einzelner Gelschnitt mit dem radioaktiven Signal direkt über dem Hauptband, der im Autoradiographiebild mit einem gestrichelten roten Kästchen dargestellt ist, aus dem Gel herausgeschnitten (5). Die Gelschnitte wurden mit der Protease K behandelt und die RNA anschließend extrahiert (6), in cDNAs umgewandelt und mittels PCR amplifiziert (7). Im PCR-Schritt wurden zusätzliche Barcodes (gelber Block, der durch das P7-Oligo eingeführt wurde) eingeführt, so dass viele Bibliotheken in einer einzigen Spur gemultiplext werden konnten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Abbildung 2: Vernetzung und Vakuumfiltration. (A) Der Vernetzer. Die Zellsuspension wird in einen Trichter gegossen, der sich oben rechts in der Maschine befindet (siehe auch Abbildung 3A für eine Nahaufnahme) und in einem UV-transparenten Beutel gehalten, der sich in der mittleren Schale befindet. Dieser Beutel wird von zwei Verschlüssen flankiert, die geschlossen bleiben, bis der Benutzer die Maschine anweist, den Bestrahlungsschritt zu starten. Die Zellen werden sowohl oben als auch unten von den Trays mit UV-Licht bestrahlt. Das Gerät wird mit 254- und 365-nm-UV-Lampen geliefert, wobei letztere für PAR-CLIP-Experimente geeignet sind. Die Maschine wird über ein Touchscreen-Panel oben rechts bedient, mit dem die UV-Dosierung oder die Belichtungszeit gesteuert werden können. (B) Nach der Vernetzung werden die Zellen von der linken Seite der Maschine entleert. Die Zellsuspensionen werden durch Vakuum zurückgewonnen und in einen Glaskolben entleert, wo sie anschließend zur Ernte in eine Vakuumfiltrationsvorrichtung gegossen werden können. (C) Vakuum-Filtrationsgeräte. Diese werden über einen Clip geöffnet und geschlossen und ein Filter dazwischen gesteckt. Vier Filtrationsgeräte wurden parallel für sehr kurze Zeitreihen eingesetzt, um keine Zeit durch Filterwechsel zu verlieren. (D) Nach der Filtration wurde der Medienüberstand zur anschließenden Entsorgung in Kolben entleert. Unterhalb der Vakuumfiltrationsgeräte wurden Ventile installiert, um das Vakuum im System aufrechtzuerhalten, wenn der Filter entfernt wird. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Abbildung 3: Vernetzung von suspendierten vs. adhärenten Zellen. (A) Der Vernetzer mit der Vari-X-Linkerkammer für Suspensionszellen. Die Zellkultur wird in den Probeneinlass (Trichter) gegossen, der sich oben rechts im Tray befindet. (B) Tablett, das Petrischalen aus Kunststoff oder Quarz aufnehmen kann, um adhärente Zellen oder kleine Volumina von Suspensionszellen zu vernetzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Abbildung 4: Vorbereitung der Bibliothek. (A) Beispiel eines Autoradiogramms aus einem Nrd1-HTP χCRAC-Experiment. Das starke, konzentrierte Signal repräsentiert das Protein, das zu sehr kurzen RNAs vernetzt ist, während der obige Abstrich das Protein darstellt, das mit RNAs vernetzt ist, die für die Sequenzierung ausreichend lang sind. (B) Der Abstrich wurde wie in einem Autoradiogramm nach der Gelexzision gezeigt. (C) Eine repräsentative qPCR aus einer χCRAC cDNA-Bibliothek. In diesem Beispiel wurde die maximale Amplifikation der cDNA nach 16 Zyklen erreicht. Somit wurden 16 Zyklen für die finale Verstärkung verwendet. Der Fehlerbalken stellt die Standardabweichung von drei technischen qPCR-Replikaten dar. (D) Beispiel für ein Phosphorbild aus einer cDNA-Bibliothek auf einem 6%igen FSME-Gel. (E) cDNA-Längen- und Qualitätsanalyse aus einer chipbasierten Kapillarelektrophorese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Abbildung 5: Hoch-RNase-Test-iCLIP-Experiment zum Testen der Vernetzung in Säugetierzellen. Gezeigt werden Autoradiogramme aus GFP-RBM7 iCLIP-Experimenten, die die Effizienz der RNP-Rückgewinnung über verschiedene Vernetzungsenergien hinweg testeten. Immunpräzipitationen wurden mit Anti-GFP-Antikörpern durchgeführt, die an magnetische Beads auf vernetzten Zellen gekoppelt waren, die GFP-RBM7 stabil exprimierten. Immunpräzipitate wurden mit hohen Konzentrationen von RNase I inkubiert, um assoziierte RNAs auf kurze, gleichmäßige Längen zu trimmen. RNPs wurden durch 32P-Markierung und SDS-PAGE sichtbar gemacht und wandern als definierte Bande, nahe der Migration des unvernetzten Proteins. Die Quantifizierung zeigt die Ergebnisse densitometrischer Analysen von radioaktiv markierten RBM7-RNA-Signalen, die auf das Anti-GFP-Western-Blot-Signal normalisiert wurden. (A) Vernetzungszeitverlauf des üblicherweise verwendeten UVP-Vernetzers im Vergleich zu unserem Vernetzer (Vari-X-Vernetzer; (B) Vernetzungszeitverlauf unseres Vernetzers auf Quarz- (links) und Kunststoffkulturwaren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Abbildung 6: Beispielhafte Genom-Browser-Diagramme, die die Leistungsfähigkeit von χCRAC zeigen, die differentielle, zeitliche Bindung von Nrd1 an seine Ziele zu zeigen. Jedes Feld zeigt Diagramme für einzelne Genomregionen. Die Pfeile zeigen an, auf welchem Strang die Gene kodiert sind (linker Zeigepfeil = Minusstrang; rechter Zeigepfeil = Plus-Strang). Die Zeitpunkte (min) werden durch t0, t1, t2 usw. auf den y-Achsen jedes Teildiagramms angegeben. Römische Ziffern, die die Chromosomen und die Koordinaten angeben, werden angezeigt. (A) Bei Glukoseentzug bindet Nrd1 zwei hochaffine Glukosetransporter, HXT6 und HXT7, die beide in diesem Zustand hochreguliert sind. (B) Es wurde beobachtet, dass Nrd1 an Imd3, ein bereits validiertes Ziel von Nab344, bindet, wobei die Intensität nach Glukosemangel abnimmt. (C) Die Nrd1-Bindung von Tye7 weist eine dynamische und transiente Natur auf, die nach Glukosemangel nach 8 min Stress auf ein Minimum abnimmt. Nach 14 min kehrt die Bindung jedoch wieder auf das Basalniveau zurück. Die Lesevorgänge wurden auf "Lesevorgänge pro Million" (RPM; y-Achse) normalisiert. Graue Kästchen kennzeichnen Regionen, die nicht-kodierende RNAs kodieren. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Die kinetische Vernetzung und Analyse von cDNA ist eine Methode, die es ermöglicht, die Dynamik von Protein-RNA-Interaktionen in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Hier wird das Protokoll detailliert beschrieben, einschließlich des Wachstums von Hefezellen, der UV-Vernetzung, der Ernte, der Proteinreinigung und der Vorbereitungsschritte der Next-Generation-Sequencing-Bibliothek.

Überwachung der Protein-RNA-Interaktionsdynamik in vivo mit hoher zeitlicher Auflösung unter Verwendung von χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

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