עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מקרן Wellcome (091549 ל- S.G ו- 109093/Z/15/A ל- S.M.), מענק הליבה של Wellcome Trust Centre for Cell Biology (092076) ומלגת מחקר בכירה לא קלינית של המועצה למחקר רפואי (MR/R008205/1 ל- S.G.), הארגון האירופי לביולוגיה מולקולרית תחת מלגת פוסט-דוקטורט ארוכת טווח (ALTF 1070-2017 ל- R.A.C), וקרן המחקר העצמאית דנמרק (T.H.J).

A. Langford ו- W. Worboys קשורים ל- UVO3, חברה מסחרית. לא היה להם כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובפרשנותם, או בהחלטה להגיש את העבודה לפרסום.

לשיטת χCRAC, בשילוב עם ההתקנים החדשים לקישור צולב וקצירת תאים, יש פוטנציאל גדול מכיוון שהיא ישימה למגוון רחב של אורגניזמים לדוגמה ולכן צריכה להיות בעלת עניין כללי בתחום הרנ"א. ישנם תחומים רבים בהם ניתן להשתמש ב-χCRAC. לדוגמה, השיטה יכולה לשמש למדידת ההרכבה ההיררכית של חלבונים לקומפלקסים מקרומולקולריים גדולים, כגון spliceosome ו- ribosome, אשר לעתים קרובות כרוך באינטראקציות דינמיות בין חלבונים ומולקולות RNA. כיום אנו גם משתמשים בו באופן שגרתי כדי לנטר אינטראקציות בין גורמי דעיכת רנ"א לבין הסובסטרטים שלהם כאשר תאים נתונים לסוגים שונים של עקה. זה מאפשר לנו לקבוע באיזה שלב של התגובה האדפטיבית הגורמים האלה הם הפעילים ביותר, לאילו מצעים הם נקשרים, ועד כמה דינמיים אינטראקציות אלה. נתונים כאלה אמורים לאפשר לחוקרים לקבוע את תרומתו היחסית של כל גורם להסתגלות לשינויים סביבתיים.
χCRAC משתמש בתגי טיהור זיקה כפולה (HTF או HTP) כדי לטהר את החלבון בתנאים מחמירים ביותר ודנטורציה. זה מבטיח שהרנ"א המקודש מועשר מאוד עבור רנ"א שהיו מקושרים באופן קוולנטי לחלבון המעניין. עם זאת, להסתמכות על תגי זיקה יש חסרונות. לדוגמה, התג עלול להפריע לתפקוד החלבון, מה שעלול לתת קריאה מעוותת של האינטראקטום קושר הרנ"א שלו. בנוסף, עבור חלק מאורגניזמי המודל לא תמיד ניתן להשתמש בתגיות מכיוון שהכלים הגנטיים לשילוב מקטעי דנ"א בגנום או להתמרת פלסמידים של ביטוי עדיין אינם זמינים. עם זאת, קל לשנות חלקים מסוימים של פרוטוקול χCRAC כדי להתאים אותו לפרוטוקולים מבוססי קליפ המסתמכים על נוגדנים לטיהור RBP. ואכן, מחקר זה הראה כי ניתן לשלב טיהורים מבוססי iCLIP עם crosslinker שלנו. אנו נמצאים כעת בתהליך של פיתוח פרוטוקולי CLIP לחקר הקשר הזמני של חלבונים קושרי RNA אנושיים עם תעתיקי RNA מתהווים.
בעת ביצוע χCRAC על חלבון חדש, החשיפה לקרינת UV חייבת להיות אופטימלית על מנת לגרום לקישור צולב מקסימלי. זה חשוב מכיוון שחשיפות UV גבוהות יכולות להפחית את התאוששות ה- RNA במהלך שלב הטיהור. תאים המבטאים RBP רקומביננטי נחשפו למנות UV שונות, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 ו-1 J/cm 2. לאחר מכן נלכדו ה-RNPs והרנ"א פוצל ותויג ברדיו. לאחר מכן, ה-RNPs נפתרו על ידי SDS-PAGE ונלקחה אוטורדיוגרמה על מנת להסיק איזו חשיפה נתנה את האות החזק ביותר (כלומר ההצלבה המקסימלית).
לאחר אופטימיזציה של תנאי הניסוי, מומלץ לבצע מספר ניסויי בקרה בעת ביצוע χCRAC. ראשית, ניתן להשתמש בדגימה מוקרנת UV ולא מתויגת כדי לפקח על קשירת הרקע לחרוזי הטיהור. שנית, כאשר מיישמים χCRAC במהלך ניסוי משמרת, סדרת זמן שנייה שבה התאים מוסטים חזרה לתווך המקורי מאפשרת לחקור אם סינון התאים עצמו גורם לשינויים ברמות הרנ"א או באינטראקציות חלבון-רנ"א.
כפי שהוזכר במבוא, מאמרים רבים שפורסמו לאחרונה מציעים מספר אופטימיזציות לפרוטוקול CLIP. זה כולל את השימוש במתאמים המסומנים באופן פלואורסצנטי לזיהוי קומפלקס חלבון-רנ"א באמצעות סריקת אינפרא אדום10, כמו גם אופטימיזציות לטיהור חומצות גרעין שונות ושלבי בחירת גודל המוצגים כמגדילים את המורכבות של הספריות המתקבלות 12,45. אנו מיישמים כעת חלק מהשיפורים הללו כדי לחדד עוד יותר את פרוטוקול χCRAC. הפרוטוקול המוצג כאן כבר מכיל מספר שיפורים לפרוטוקולי CRAC ו-χCRAC המקוריים המגדילים את מורכבות הנתונים. לדוגמה, בעבר, לאחר פתרון קומפלקסים צולבים של חלבון-רנ"א רדיואקטיבי על ג'לים SDS-PAGE, הם הועברו לקרום ניטרוצלולוז והרנ"א הצולב, בודד מהכתם. עם זאת, העברת ה-RNP ומיצוי ה-RNA שלאחר מכן יכולה להיות מאוד לא יעילה, במיוחד כאשר מדובר ב-RBP גדולים כגון תת-יחידות RNA פולימראז. זה יכול לגרום לירידה משמעותית בהתאוששות של RNA צולב. בפרוטוקול הנוכחי, הרנ"א הצולב-מקושר מופק ישירות מפרוסות ג'ל SDS-PAGE כפי שמודגם באיור 1. זה הגביר את ההתאוששות של RNA צולב. בנוסף, לאחר הגברה PCR של cDNAs המוצר נפתר במקור על 3%, טמפרטורת התכה נמוכה ג'ל agarose, ולאחר מכן 175-300 bp מוצרי PCR הופקו מן הג'ל. עם זאת, ג'לים אלה יכולים להיות עמוסים בקלות, וכתוצאה מכך הפרדה גרועה מאוד של ה- DNA. החלפת ג'ל אגרוז בג'ל TBE טרומי הביאה להפרדת גודל עקבית יותר ולהתאוששות טובה יותר של מוצרי PCR.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

רנ"א מסתמכים לעתים קרובות על RBPs כדי להפעיל את תפקידם, מה שהוביל להתעניינות רבה בהבנת הדינמיקה בין מולקולות אלה. RBPs רבים זוהו במגוון רחב של אורגניזמים. עם זאת, זה תמיד היה ידוע לשמצה קשה לחקור אינטראקציות RBP-RNA in vivo. פריצת דרך משמעותית בחקר אינטראקציות כאלה הגיעה עם הופעתו של CLIP1. שיטה זו משתמשת בקרינה אולטרה סגולה (UV, 254 ננומטר) כדי לגרום לקשרים קוולנטיים בין RBPs לבין RNA הקשורים ישירות שלהם (כלומר, קישור צולב למרחק אפס). לאחר מכן, RBP של עניין הוא immunopurified בתנאים מחמירים כדי להבטיח כי רק RNAs crosslinked קוולנטית חלבונים מזוהים. רנ"א קשור מתעכל חלקית עם RNases ולאחר מכן מומר לספריות cDNA לצורך ריצוף. חומרת הטיהור הגבוהה חשובה מכיוון שהיא מגדילה מאוד את הספציפיות של התאוששות חלבון ו- RNA, אשר משופרת עוד יותר באמצעות טיהור SDS-PAGE של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין צולב (RNP). CLIP ושיטות קשורות מספקות גם תובנה ברזולוציית הנוקלאוטידים לאתר קשירת החלבון, מכיוון שבמהלך הכנת ספריית הריצוף, חומצות אמינו המקושרות לרנ"א לעיתים קרובות מסיימות את השעתוק ההפוך או גורמות לאנזים להציג מוטציות באתר זה 1,2,3.
מאז הצגתו, פרוטוקול CLIP המקורי הפיק מגוון מדהים של מתודולוגיות נגזרות. פריצת דרך חשובה במיוחד הגיעה עם פיתוח HITS-CLIP (או CLIP-seq), הממזג רצף בתפוקה גבוהה עם גישת CLIP3. זה אומץ מאז על ידי כל המתודולוגיות מבוססות CLIP. iCLIP הציגה שיפורים בטכניקות חיתוך וקשירת מתאמים בתיווך RNase המאפשרים מיפוי מדויק יותר של אתרי הקישור של RBP4. PAR-CLIP שילב תיוג 4thio-uridine/uracil עם cross-linking ב-365 ננומטר, מה שמאפשר למפות אתרי קישור צולב על ידי ניתוח תחליפי T-C5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP ו-uvCLAP הציגו תנאי דנטורינג ושלבי טיהור זיקה כפולה המפחיתים עוד יותר את קשירת הרקע לשרף הזיקה ומגדילים עוד יותר את הספציפיות של לכידת חלבונים 2,6,7,8,9. בנוסף, CRAC, uvCLAP ו-dCLIP הציגו תיוג RBP של עניין עם תג זיקה, ובכך התגברו על הצורך לייצר נוגדנים ספציפיים.
מספר אופטימיזציות נעשו גם כדי לזרז את מתודולוגיית CLIP. פרוטוקול CLIP המקורי השתמש בתיוג רדיו של הרנ"א שנלכד על מנת להמחיש את קומפלקסי RBP-RNA לאחר SDS-PAGE. עם זאת, השימוש ברדיואקטיביות יכול להיות בעייתי עבור מעבדות שאינן ערוכות לעבודה כזו. irCLIP משלב מתאם מצומד פלואורופור המאפשר הדמיה באמצעות דימות אינפרא אדום10 ו-sCLIP משתמש בביוטינילציה של רנ"א שנלכד על מנת להמחיש אותם באמצעות HRP11 מצומד סטרפטווידין. יתר על כן, eCLIP מוותר לחלוטין על תיוג RNA; במקום זאת, החלבון נכרת אך ורק על סמך גודלו הידוע12. טיהור מבוסס סטרפטווידין שימש גם להאצת תהליך הכנת הספרייה ב- FAST-iCLIP, שם מתאם 3' ביוטינילציה קשור לרנ"א ומשמש כדי לאפשר טיהור לאחר שעתוק לאחור ומעגליזציה13. שיפורים נוספים בפרוטוקול iCLIP גם הגדילו מאוד את המורכבות של הספריות4.
לבסוף, CLIP שונה כדי לאפשר לכידה של RBPs מתת-תאים שונים 14,15, כדי להמחיש RNA משועתק חדש באמצעות השראה פועמת של ריבונוקלאוזידים פוטואקטיביים 5,16,17, כדי ללכוד RNA מתילציה18,19,20, כדי לבחון אינטראקציות RNA-RNA 21,22, ולמפות 3' קצוות 23,24.
למרות התרומות הגדולות של טכניקות מבוססות קליפ בסיוע להבנתנו את האינטראקציות בין RBPs ורנ"א, היא הוגבלה על ידי חוסר היעילות של קישור צולב UV. למרות שתאי תרבית הגדלים בשכבה חד-שכבתית הם בדרך כלל קלים יחסית להצלבה, זה מאתגר יותר באופן משמעותי ברקמות או בתאים בתמיסה. רקמות יכולות לדרוש סבבים מרובים של חשיפה לקרינת UV על מנת לחדור לשכבות התאים הנדרשות, בעוד שתאים מיקרוביאליים גדלים לעתים קרובות במדיומים עשירים המכילים תרכובות ארומטיות סופגות UV25. ואכן, זמני הקרנת UV של עד 30 דקות שימשו ליצירת קישור צולב מספיק בין RBPs לבין RNA קשור שלהם עבור דגימות כאלה26,27,28. חשיפה ממושכת זו לקרינת UV גורמת לתגובות לחץ בתוך התא, כגון נזק לדנ"א המושרה על ידי UV, אשר יכול לזהם את הנתונים הסופיים ביישומים מסוימים.
רוב מחקרי CLIP התמקדו ביצירת "תצלומי בזק" בודדים של אינטראקציות חלבון-רנ"א ספציפיות בתא. עם זאת, אינטראקציות חלבון-רנ"א הן דינמיות מטבען, במיוחד כאשר תאים נתונים לשינויים בסביבתם. זה יכול לכלול ירידה פתאומית בזמינות של חומרים מזינים חיוניים או שינויים מהירים בטמפרטורה. לכן, כדי להבין באמת את תפקידו של RBP במהלך מתח, עדיף לבצע ניתוחים שנפתרו בזמן מכיוון שהם יכולים ללכוד את הספקטרום המלא של מטרות RBP במהלך הלחץ ולקבוע באיזה שלב של תגובת הלחץ RBP שנבחר פעיל. בפרט, מחקרים בשמרים הראו כי הדקות הראשונות של הסתגלות הן קריטיות לחלוטין להישרדות וזמן מחצית החיים של RNA בחיידקים יכול לנוע בין דקות לשניות 29,30,31,32,33. לכן, ניתוחים כאלה שנפתרו בזמן צריכים להתבצע באופן אידיאלי ברזולוציה זמנית גבוהה. עם זאת, זמני ההצלבה הארוכים הופכים את המחקר של תגובות אדפטיביות בשלב מוקדם למאתגר במיוחד.
כדי להתגבר על בעיות אלה, פיתחנו לאחרונה שיטה משופרת המסוגלת להצליב ולקצור תאים בטווחי זמן של דקה. שיטת χCRAC שלנו מאפשרת מדידה כמותית של שינויים דינמיים באינטראקציות RBP-RNA ברזולוציה שלא נראתה בעבר. קריטי לשיטה זו היה פיתוח של מכשיר קרינת UVחדשני 32 אשר מפחית את זמן הקישור הצולב, הנדרש בשמרים ובחיידקים בתמיסה בערך פי 10, ולמעשה מקפיא אינטראקציות RBP-RNA באופן מיידי. בנוסף, על מנת לקצור במהירות את התאים לאחר קרינת UV, פיתחנו מכשיר סינון ואקום שיכול לקצור שמרים הגדלים באופן אקספוננציאלי בתרבית של 0.5 ליטר בסביבות 30 s32. חידושים טכנולוגיים אלה מאפשרים ללמוד את הדינמיקה של RBP-RNA ברזולוציה דקה. בנוסף, הצגנו מספר אופטימיזציות לפרוטוקול CRACהמקורי 2 על מנת להגביר את המעשיות שלו.
באמצעות χCRAC, חקרנו לאחרונה את המטרה של RBP גרעיני שמרים, Nab3, בתגובה למחסור בגלוקוז. ב Saccharomyces cerevisiae, Nab3 יכול ליצור קומפלקס עם Nrd1, RBP, ואת RNA helicase Sen1 כדי ליצור קומפלקס NNS. NNS נקשר ל-RNA פולימראז ולתעתיק המתהווה יכול לגרום לסיום שעתוק34. קומפלקס זה מעורב בעיקר בהסרת תעתיקי RNA מוצפנים שאינם מקודדים, אך הוכח גם כמווסת ביטוי של גנים מקודדי חלבונים. המחקר הראה מיקוד דיפרנציאלי של Nab3 לתמלילים ללא קידוד וקידוד לאחר דקה בלבד של לחץ32. הראינו כי סיום שעתוק משותף על ידי Nab3 גורם לביטוי חולף מאוד, דמוי דופק, של גנים רטרוטרנספוזון, אשר היה קשה לזהות באמצעות גישות מסורתיות מבוססות CLIP. בנוסף, זמני הקרנת UV הקצרים בקרוס-לינקר UV שלנו גם הגדילו באופן משמעותי את ההתאוששות של RNA קצר מועד שאינו מקודד32. χCRAC יהיה ככל הנראה כלי מכריע בהבהרת לא רק האופן שבו RBPs מעצבים את התגובה ללחץ בטווחי זמן מיידיים, אלא גם את תפקידיהם המשתנים במהלך כל מחזור החיים של תגובה. כתב יד זה מספק סקירה מפורטת של כל השלבים בפרוטוקול χCRAC. לשם המחשה, השיטה שימשה לחקר חלבון השמרים Nrd1, המעורב בסיומת שעתוק ודעיכת RNA35,36, ואת מטרת ה-RNA שלו בתגובה למחסור בגלוקוז על פני מספר רב של נקודות זמן. לבסוף, אנו גם מראים כי יחידת הקרנת UV שלנו יכולה להצליב במהירות RBPs ל- RNA בתאי HeLa, מה שמאפשר גם לבצע ניתוחים ברזולוציה גבוהה בזמן בתאים דבקים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

האינטראקציה בין חלבונים קושרי RNA (RBPs) לבין מצעי הרנ"א שלהם מפגינה נזילות ומורכבות. במהלך חייו, רנ"א יחיד יכול להיות קשור על ידי RBPs רבים ושונים אשר יווסתו את ייצורו, יציבותו, פעילותו והתפרקותו. לכן, נעשה הרבה כדי להבין את הדינמיקה הקיימת בין שני סוגי מולקולות אלה. פריצת דרך חשובה במיוחד הגיעה עם הופעתו של 'c ross-linking and immunoprecipitation' (CLIP). טכניקה זו אפשרה חקירה קפדנית של אילו רנ"א קשורים ל-RBP מסוים. בקיצור, החלבון המעניין מקושר UV למצעי הרנ"א שלו in vivo, מטוהרים בתנאים מחמירים ביותר, ואז הרנ"א המוצלבים באופן קוולנטי לחלבון מומרים לספריות cDNA ומרוצפים. מאז תפיסתו, טכניקות נגזרות רבות פותחו על מנת להפוך את CLIP מקובל לתחומי לימוד מסוימים. עם זאת, קישור צולב באמצעות אור אולטרה סגול ידוע לשמצה לא יעיל. התוצאה היא זמני חשיפה ארוכים יותר שהופכים את המחקר הזמני של אינטראקציות RBP-RNA לבלתי אפשרי. כדי להתגבר על בעיה זו, תכננו ובנינו לאחרונה מכשירי הקרנת UV וקצירת תאים משופרים בהרבה. באמצעות כלים חדשים אלה, פיתחנו פרוטוקול לניתוח בזמן של אינטראקציות RBP-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה: Kinetic CRoss-linking ו-Analysis of cDNAs (χCRAC). לאחרונה השתמשנו בטכניקה זו כדי לחקור את התפקיד של שמרים RBPs בהסתגלות לעקה תזונתית. כתב יד זה מספק סקירה מפורטת של שיטת χCRAC ומציג תוצאות אחרונות שהתקבלו עם Nrd1 RBP.

כדי להדגים את יעילותה של שיטת χCRAC, בוצע ניסוי בזמן עם זני שמרים המבטאים חלבון Nrd1 המתויג על ידי HTP. ייצוג סכמטי מפורט המתאר כיצד השיטה פועלת מוצג באיור 1. כמו Nab3, Nrd1 מעורב בדעיכת RNA גרעיני של מגוון תעתיקי RNA37. עבודה קודמת ממעבדת קורדן הצביעה על כך שקישור Nrd1 למטרות הרנ"א שלו משתנה באופן משמעותי כאשר תאים נתונים לרעב גלוקוז28,38. לפיכך, תאים שגדלו באופן אקספוננציאלי בתווך המכיל גלוקוז (SD-TRP) הועברו לאותו תווך ללא גלוקוז (S-TRP) לאורך מסלול זמן כדי לעקוב אחר שינויים דינמיים באינטראקציות Nrd1-RNA. הדגימות נלקחו והוצלבו בתא Vari-X-linker (איור 3A) לפני המשמרת ולאחר מכן לאחר 1, 2, 4, 8, 14 ו-20 דקות. המדיום המשמש לצמיחת תאים היה חסר במכוון בטריפטופן כדי להפחית את ספיגת UV על ידי חומצת אמינו ארומטית זו. שימו לב שעדיף להשתמש במדיום סינתטי שעובר סינון מעוקר מכיוון שאוטוקלאבינג של המדיום יכול להוביל לקירמול של הסוכרים. פעולה זו מפחיתה את יעילות הקישור הצולב.
איור 4A מראה אוטורדיוגרף מייצג מניסוי χCRAC. שים לב שבדוגמה זו, הדגימות לא אוגדו יחד. במקום זאת, כל אחד מהם הופעל בנפרד על הג'ל. זה מומלץ לבדיקות ניסיוניות ראשוניות כדי להראות כי החלבון מצטלב ביעילות עם RNA בכל נקודות הזמן שנבדקו. אות חזק במיוחד נצפה במשקל המולקולרי הצפוי של ה-RBP, המייצג את החלבון הקשור לרנ"א קצר מאוד, רדיואקטיבי שאינו ניתן לריצוף. לכן, בודד אות המריחה מעל רצועה זו, שהוא החלבון המוצלב למקטעי רנ"א ארוכים יותר. השבר נחתך ממש מעל רצועת החלבונים בתוספת כ-30 kDa. איור 4B מראה אוטורדיוגרמה לאחר כריתה, כאשר החלבון מקושר לרנ"א קצר שנותר בג'ל והאות שנמרח בעבר נכרת כעת.
לאחר שעתוק לאחור, יש להגביר את ספריית cDNA באמצעות PCR. עם זאת, יש להימנע מהגברה מוגזמת של הספרייה מכיוון שזה יכול להציג הטיה לכיוון רצפים המוגברים באופן מועדף על ידי הפולימראז וליצור חפצי PCR. ספריות מוגברות יתר מכילות גם מספר רב של רצפים כפולים שמבזבזים קריאות על הרצף. על מנת לחשב את המספר האידיאלי של מחזורי PCR להגברה של הספרייה הסופית, Aliquot של cDNA הוגבר באמצעות qPCR באמצעות אוליגונוקלאוטידים P5 ו- BC. המחזור הראשון שבו הגיעה הספרייה לשיא הפלואורסצנטיות נבחר כספירת מחזורי PCR. איור 4C נותן דוגמה של qPCR מספריית cDNA טיפוסית, שהניבה ספירת מחזור שיא של 16. ערך זה שימש לאחר מכן עבור χCRAC PCR הסופי. על מנת לעבד את הנתונים הרצפים, השתמשנו בתוכנה שפותחה בעבר במעבדה שלנו (pyCRAC) ובצנרת המתאימה לניתוח נתוני CRAC קינטיים (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). כלי תוכנת קוד פתוח אלה מאפשרים דה-ריבוב וחיתוך של הנתונים, הסרת כפילויות PCR, זיהוי שיאים מובהקים סטטיסטית, קריאות אשכולות לרצפים רציפים וזיהוי מוטיבים מחייבים39. פרטים נוספים על אופן הפעולה של כלים אלה נמצאים בדפי האינטרנט שלהם.
התחלנו גם לפתח פרוטוקול χCRAC עבור תאי יונקים. רוב קווי התאים של יונקים גדלים כחד-שכבתיים, והמגש בקרוסלינקר שלנו עם השקית החדירה UV אינו מתאים לניסויים בתאים דבקים. כדי להתגבר על הבעיה הזו, פיתחנו שלב שבו משתמשים יכולים להקרין קרינת על-סגול של 1-2 צלחות פטרי (קוטר של 150 מ"מ ועומק של 25 מ"מ) עם תאים דבקים (איור 3B). כבדיקה ראשונה, נמדדה יעילות הקרוס-לינקר עבור תאי יונקים באמצעות הצלבה ולכידה של GFP-RBM7 המתויג ביציבות באמצעות נוגדנים נגד GFP וטיהור מסורתי מבוסס CLIP. כפי שניתן לראות באיור 5A, הקרוס-לינקר הצליח לשחזר קומפלקסים של חלבון-רנ"א מתאי יונקים שגדלו כחד-שכבה באמצעות קרינת UV של 254 ננומטר ביעילות דומה למכשיר קרינת UV הנמצא בשימוש נרחב. עם זאת, כלי פלסטיק סטנדרטיים של תרביות תאים המשמשים בדרך כלל לניסויי קישור צולב UV הם בלתי חדירים ל- UV של 254 ננומטר. לכן, בקרוס-לינקר שלנו התאים יקבלו רק קרינה מהגדה העליונה של מנורות UV. כדי להתגבר על כך, פיתחנו צלחת קוורץ פטרי חדירה UV לצמיחת תאים וקישור צולב. השימוש בכלי תרבית הקוורץ הראה התאוששות חזקה של קומפלקסים חלבוניים-רנ"א עם 2 שניות בלבד של קרינת UV (איור 5B). בשילוב עם שיטות לכידת RBP עבור תאי יונקים כגון טכנולוגיות CLIP, זמני קישור צולבים קצרים אלה ניתנים להתאמה עם מסלולי זמן לשחזור פרופילים קושרי RNA מרחביים-זמניים של RBPs בתגובה לעקות גנוטוקסיות או דלדול מהיר של גורמי חלבון, או במקביל לסנכרון שעתוק או מחזור התא.
איור 6 מציג מספר דוגמאות של נתוני Nrd1 המעובדים על-ידי צינור χCRAC. איור זה הוכן באמצעות קבצי הבדגרף שנוצרו על ידי הצינור וחבילת Python GenomeBrowser (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), שעיצבנו כדי לפשט את יצירת תמונות דפדפן גנום באיכות פרסום של הנתונים. המלבנים האפורים מייצגים אזורים גנומיים שביטאו רנ"א לא מקודד, כגון תעתיק לא יציב מוצפן (CUTs), תעתיק יציב לא מאופיין (SUTs)40 ותעתיקים לא יציבים רגישים ל-Xrn1 (XUTs)41. הנתונים באיור 6 מראים ש-Nrd1 נקשר לרבים מתעתיקי הרנ"א הלא-מקודדים האלה, מה שעולה בקנה אחד עם הרעיון שחלבון זה מעורב בפירוק של סוג זה של תעתיקים42. איור 6A מראה אזור של ~15 קילו-בתים בכרומוזום IV. כאן חלה עלייה משמעותית בקשירה של Nrd1 לתעתיקים המקודדים את מובילי הגלוקוז בעלי הזיקה הגבוהה HXT6 ו- HXT7, שניהם מווסתים במהלך רעב גלוקוז. סביר להניח כי סיום שעתוק על ידי קומפלקס NNS עשוי להשפיע על קינטיקה אינדוקציה של גנים אלה במהלך רעב גלוקוז. איור 6B מראה דוגמה של קישור צולב Nrd1 לתמלול Imd3, אשר ידוע כי הוא מוסדר על-ידי Nab343. במקרה זה הנתונים הראו ירידה משמעותית בקשירה לרעב גלוקוז. עבודות קודמות הראו ירידה בקשירה של Nab3 לתמלול Tye7 במהלך הרעבת גלוקוז44. בהתאם לתצפית זו, נתוני χCRAC מצביעים על כך שהקישור של Nrd1 פחת במהלך הרעבת גלוקוז והקישור הצולבות של Nrd1 ל-Tye7 היה הנמוך ביותר לאחר 8 דקות של לחץ (איור 4C). עם זאת, נראה כי השפעה זו הייתה חולפת בלבד, מכיוון שלאחר 14 דקות של רעב גלוקוז, קשירת Nrd1 חזרה לרמות ההתחלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של פרוטוקול χCRAC. זנים מתויגים גודלו עד לצפיפות הרצויה. RBP מציין חלבון קושר RNA. לאחר מכן, נלקחה דגימת ייחוס והוצלבה עם אור UV 254 ננומטר. התאים הנותרים נקצרו על ידי סינון ולאחר מכן הועברו במהירות למדיום מעורר הלחץ. עבור ניסוי χCRAC המתואר כאן, דגימות נלקחו והצולבו 1, 2, 4, 8, 14 ו -20 דקות לאחר המשמרת (1). לאחר מכן ה-RBP של העניין טוהר באמצעות טיהור זיקה דו-שלבי מחמיר ביותר (2). לאחר מכן, הרנ"א הצולבות שנלכדו עוכל חלקית באמצעות RNases, סומנו ברדיו בקצה ה-5' ומתאמים נקשרו אליהם (3). מתאמי 5' הכילו רצפי ברקוד ייחודיים "בתוך קריאה", כך שניתן היה להפריד את הדגימות הבודדות באופן ביואינפורמטי לאחר ריצוף. קומפלקסי RBP-RNA הוצאו, אוגמו והואצו יחד (4), נפתרו על ידי SDS-PAGE והודמיינו באמצעות אוטורדיוגרפיה (5). לאחר מכן, פרוסת ג'ל בודדת המכילה את האות הרדיואקטיבי ממש מעל הרצועה הראשית, מאוירת עם קופסה אדומה מקווקו בתמונת האוטורדיוגרפיה, נחתכה מהג'ל (5). פרוסות הג'ל טופלו בפרוטאז K והרנ"א חולץ לאחר מכן (6), הומר ל- cDNA והוגבר באמצעות PCR (7). צעד ה-PCR הכניס ברקודים נוספים (בלוק צהוב שהוצג על ידי אוליגו P7) כך שניתן היה להכפיל ספריות רבות לנתיב אחד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> איור 2: קישור צולב וסינון ואקום. (A) הקרוס-לינקר. מתלה התא מוזג לתוך משפך הממוקם בפינה הימנית העליונה של המכונה (ראו גם איור 3A לתקריב) ומוחזק בשקית שקופה UV הממוקמת במגש האמצעי. שקית זו מוקפת בשני תריסים שנשארים סגורים עד שהמשתמש מורה למכונה להתחיל את שלב ההקרנה. התאים מוקרנים באור UV מהמגשים שמעל ומתחת. המכונה מגיעה עם מנורות UV 254 ו 365 ננומטר, כאשר האחרונה ישימה לניסויי PAR-CLIP. המכשיר מופעל באמצעות לוח מסך מגע הממוקם בפינה השמאלית העליונה המאפשר לשלוט במינון UV או בזמן החשיפה. (B) לאחר קישור צולב, התאים מנוקזים מהצד השמאלי של המכונה. מתלי התאים מוחזרים באמצעות ואקום ומנוקזים לבקבוק זכוכית, שם ניתן לשפוך אותם לאחר מכן למכשיר סינון ואקום לקציר. (C) מכשירי סינון ואקום. אלה נפתחים ונסגרים באמצעות קליפ ומוכנס מסנן ביניהם. ארבעה מכשירי סינון שימשו במקביל לסדרות זמן קצרות מאוד כדי לא לאבד זמן כתוצאה משינוי פילטרים. (D) לאחר הסינון, נוקז חומר התקשורת לצלוחיות לסילוק לאחר מכן. מתחת להתקני סינון הוואקום הותקנו שסתומים כדי לשמור על הוואקום במערכת בעת הסרת המסנן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> איור 3: קישור צולב בין תאים מרחפים לעומת תאים דבקים. (A) הקרוס-לינקר עם תא Vari-X-linker לתאי תרחיף. תרבית התאים נשפכת לתוך כניסת הדגימה (משפך) הממוקם בפינה השמאלית העליונה של המגש. (B) מגש שיכול להכיל צלחות פטרי מפלסטיק או קוורץ לצורך קישור צולב בין תאים דבקים או נפחים קטנים של תאי תרחיף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> איור 4: הכנת הספרייה. (A) דוגמה לאוטורדיוגרמה מניסוי Nrd1-HTP χCRAC. האות החזק והמרוכז מייצג את החלבון המוצלב לרנ"א קצר מאוד, ואילו הכתם לעיל מייצג את החלבון המקושר לרנ"א באורך מספיק לריצוף. (B) הכתם נכרת כפי שמוצג באוטורדיוגרמה שנלקחה לאחר כריתת ג'ל. (C) qPCR מייצג מספריית cDNA χCRAC. בדוגמה זו, הגברה מקסימלית של cDNA הושגה ב -16 מחזורים. לפיכך, 16 מחזורים שימשו להגברה הסופית. סרגל השגיאה מייצג את סטיית התקן של שלושה עותקים משוכפלים טכניים של qPCR. (D) דוגמה של זרחן מספריית cDNA על ג'ל TBE של 6%. (E) ניתוח אורך ואיכות cDNA מאלקטרופורזה נימית מבוססת שבב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> איור 5: ניסוי iCLIP לבדיקת High RNase לבדיקת קרוסלינקינג בתאי יונקים. מוצגים אוטורדיוגרמות מניסויי GFP-RBM7 iCLIP אשר בדקו את יעילות התאוששות RNP על פני אנרגיות צולבות שונות. משקעים חיסוניים בוצעו באמצעות נוגדנים נגד GFP המוצמדים לחרוזים מגנטיים על תאים צולבים אשר ביטאו ביציבות GFP-RBM7. Immunoprecipitates הודגרו עם ריכוזים גבוהים של RNase I על מנת לחתוך RNA הקשורים לאורכים קצרים ואחידים. RNPs הודגמו על ידי תיוג 32P ו- SDS-PAGE ונדדו כפס מוגדר, קרוב לנדידה של חלבון שאינו מקושר. כימות מציין את התוצאות של ניתוחים דנסיטומטריים של אות RBM7-RNA רדיואקטיבי מנורמל לאות הכתם המערבי נגד GFP. (A) מסלול זמן קרוס-לינקינג של קרוס-לינקר UVP הנפוץ לעומת קרוס-לינקר שלנו (Vari-X-linker; VxL). (B) מסלול זמן של קרוס-לינקר שלנו על כלי תרבות קוורץ (משמאל) ופלסטיק (מימין). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> איור 6: תרשימי דפדפן גנום לדוגמה המראים את כוחו של χCRAC להראות קשירה זמנית דיפרנציאלית של Nrd1 למטרותיו. כל תיבה מציגה תרשימים עבור אזורים גנומיים בודדים. החצים מציינים על איזה גדיל מקודדים הגנים (חץ מצביע שמאלה = מינוס גדיל; חץ מצביע ימינה = גדיל פלוס). נקודות הזמן (דקות) מסומנות על ידי t0, t1, t2 וכו 'על צירי y של כל חלקת משנה. ספרות רומיות המציינות את הכרומוזומים ואת הקואורדינטות מוצגות. (A) עם חסך גלוקוז, Nrd1 קושר שני מובילי גלוקוז בעלי זיקה גבוהה, HXT6 ו-HXT7, אשר שניהם מווסתים במצב זה. (B) Nrd1 נצפה נקשר ל-Imd3, יעד שכבר אומת של Nab344, עם עוצמה מופחתת בעקבות רעב גלוקוז. (C) קשירת Nrd1 של Tye7 מציגה אופי דינמי וחולף, ופוחתת לאחר רעב גלוקוז למינימום לאחר 8 דקות של מתח. עם זאת, הקשירה חוזרת לאחר מכן לרמות הבסיס לאחר 14 דקות. הקריאות נורמלו ל"קריאות למיליון" (סל"ד; ציר y). תיבות אפורות מציינות אזורים המקודדים רנ"א שאינו מקודד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

הצלבה קינטית וניתוח של cDNA היא שיטה המאפשרת לחקור את הדינמיקה של אינטראקציות חלבון-RNA בתאים חיים ברזולוציה טמפורלית גבוהה. כאן מתואר בפירוט הפרוטוקול, כולל גידול תאי שמרים, הצלבת UV, קציר, טיהור חלבונים ושלבי הכנת ספריית הריצוף של הדור הבא.

ניטור דינמיקת אינטראקציה חלבון-רנ"א ב-Vivo ברזולוציה טמפורלית גבוהה באמצעות χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

ברזולוציה גבוהה ניתוח החלקיקים יחיד מאת אלקטרונים Cryo-microscopy תמונות באמצעות SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

שימוש בהעברת אנרגיה פלורסצנטיות תהודה חוץ גופית ללמוד את הדינמיקה של חלבון מתחמי בקנה מידה הזמן אלפיות השנייה

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

בחינת הדינמיקה של הדבקה תאית והפצת תאים אפיתל על Fibronectin במהלך לחץ חמצוני

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

קוונפיקציה של אינטראקציה חלבון ברשת דינמיקה באמצעות ריבוב ושות-Immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

ספקטרוסקופיית פלואורסצנטיות כפולה לחקר אינטראקציה בין חלבון לחלבון ודינמיקת חלבונים בתאים חיים

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

ניטור הצטברות חלבונים קינטיקה ב Vivo באמצעות ספירת הכללה אוטומטית ב Elegans Caenorhabditis

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...