इस काम को वेलकम ट्रस्ट (एसजी को 091549 और 109093/जेड/15/ए से एसएम), वेलकम ट्रस्ट सेंटर फॉर सेल बायोलॉजी कोर ग्रांट (092076) और मेडिकल रिसर्च काउंसिल नॉन-क्लिनिकल सीनियर रिसर्च फैलोशिप (एमआर/आर008205/1 से एसजी), यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान संगठन से दीर्घकालिक पोस्टडॉक्टरल फैलोशिप (एएलटीएफ 1070-2017 से आर.ए.सी.) के तहत अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था। और स्वतंत्र अनुसंधान कोष डेनमार्क (टी.एच.जे.)।

लैंगफोर्ड और डब्ल्यू वोरबॉय एक वाणिज्यिक कंपनी यूवीओ 3 से संबद्ध हैं। अध्ययन डिजाइन, डेटा संग्रह और व्याख्या, या प्रकाशन के लिए काम प्रस्तुत करने के निर्णय में उनकी कोई भूमिका नहीं थी।

नए क्रॉस-लिंकिंग और सेल हार्वेस्टिंग उपकरणों के साथ संयुक्त 3सीआरसी विधि में बड़ी क्षमता है क्योंकि यह मॉडल जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला पर लागू होती है और इसलिए आरएनए क्षेत्र के लिए सामान्य रुचि होनी चाहिए। ऐसे कई क्षेत्र हैं जिनमें 3CC का उपयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विधि का उपयोग प्रोटीन की पदानुक्रमित असेंबली को बड़े मैक्रोमोलेक्यूलर कॉम्प्लेक्स में मापने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि स्प्लिसोसोम और राइबोसोम, जिसमें अक्सर प्रोटीन और आरएनए अणुओं के बीच गतिशील बातचीत शामिल होती है। अब हम नियमित रूप से आरएनए क्षय कारकों और उनके सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत की निगरानी के लिए इसका उपयोग करते हैं जब कोशिकाएं विभिन्न प्रकार के तनावों के अधीन होती हैं। यह हमें यह निर्धारित करने में सक्षम बनाता है कि अनुकूली प्रतिक्रिया के किस चरण में ये कारक सबसे सक्रिय हैं, वे किस सब्सट्रेट से बंधते हैं, और ये इंटरैक्शन कितने गतिशील हैं। इस तरह के डेटा को शोधकर्ताओं को पर्यावरणीय परिवर्तनों के अनुकूलन में प्रत्येक कारक के सापेक्ष योगदान को निर्धारित करने में सक्षम बनाना चाहिए।
अत्यधिक कठोर और विकृत परिस्थितियों में प्रोटीन को शुद्ध करने के लिए 3सीआरसी दोहरे आत्मीयता शुद्धिकरण टैग (एचटीएफ या एचटीपी) का उपयोग करता है। यह सुनिश्चित करता है कि कोप्यूरिफाइड आरएनए आरएनए के लिए अत्यधिक समृद्ध है जो सहसंयोजक रूप से रुचि के प्रोटीन से जुड़े थे। हालांकि, आत्मीयता टैग पर भरोसा करने के नुकसान हैं। उदाहरण के लिए, टैग प्रोटीन फ़ंक्शन में हस्तक्षेप कर सकता है, जो इसके आरएनए-बाइंडिंग इंटरएक्टोम का विकृत रीडआउट दे सकता है। इसके अतिरिक्त, कुछ मॉडल जीवों के लिए टैग का उपयोग करना हमेशा संभव नहीं हो सकता है क्योंकि जीनोम में डीएनए टुकड़ों को एकीकृत करने या अभिव्यक्ति प्लास्मिड को बदलने के लिए आनुवंशिक उपकरण अभी तक उपलब्ध नहीं हैं। हालांकि, आरबीपी के शुद्धिकरण के लिए एंटीबॉडी पर भरोसा करने वाले क्लिप-आधारित प्रोटोकॉल के साथ संगत बनाने के लिए 3सीआरसी प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को बदलना आसान है। दरअसल, इस अध्ययन से पता चला है कि हमारे क्रॉसलिंकर के साथ आईसीएलआईपी-आधारित शुद्धिकरण को जोड़ना संभव है। अब हम नवजात आरएनए प्रतिलेख के साथ मानव आरएनए-बाध्यकारी प्रोटीन के अस्थायी संबंध का अध्ययन करने के लिए क्लिप प्रोटोकॉल विकसित करने की प्रक्रिया में हैं।
एक नए प्रोटीन पर 3सीआरसी का प्रदर्शन करते समय, अधिकतम क्रॉस-लिंकिंग को प्रेरित करने के लिए यूवी एक्सपोजर को अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि उच्च यूवी एक्सपोजर शुद्धिकरण चरण के दौरान आरएनए की वसूली को कम कर सकते हैं। पुनः संयोजक आरबीपी को व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को विभिन्न यूवी खुराक, 100 एमजे / सेमी2, 250 एमजे / सेमी2, 500 एमजे / सेमी2, और 1 जे / सेमी2 के संपर्क में लाया गया था। आरएनपी पर कब्जा कर लिया गया और आरएनए को खंडित और रेडियोलेबल किया गया। बाद में, आरएनपी को एसडीएस-पेज द्वारा हल किया गया था और यह पता लगाने के लिए एक ऑटोरेडियोग्राम लिया गया था कि कौन सा एक्सपोजर सबसे तीव्र संकेत देता है (यानी अधिकतम क्रॉस-लिंकिंग)।
एक बार प्रयोगात्मक स्थितियों को अनुकूलित करने के बाद, कई नियंत्रण प्रयोगों की सिफारिश की जाती है। सबसे पहले, शुद्धि करण मोतियों के लिए पृष्ठभूमि बंधन की निगरानी के लिए एक यूवी विकिरणित, अनटैग्ड नमूने का उपयोग किया जा सकता है। दूसरा, एक शिफ्ट प्रयोग के दौरान 3सीआरसी लागू करते समय, दूसरी बार की श्रृंखला जहां कोशिकाओं को मूल माध्यम में वापस स्थानांतरित किया जाता है, जांच को सक्षम बनाता है कि क्या कोशिकाओं का निस्पंदन स्वयं आरएनए स्तर या प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन में परिवर्तन लाता है।
जैसा कि परिचय में उल्लेख किया गया है, हाल ही में प्रकाशित कई पेपर क्लिप प्रोटोकॉल के लिए कई अनुकूलन का सुझाव देते हैं। इसमें इन्फ्रारेड स्कैनिंग10 के माध्यम से प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स का पता लगाने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल एडाप्टर का उपयोग शामिल है और साथ ही परिणामस्वरूप पुस्तकालयोंकी जटिलता को बढ़ाने के लिए दिखाए गए विभिन्न न्यूक्लिक एसिड शुद्धिकरण और आकार चयन चरणों के अनुकूलन शामिल हैं। हम वर्तमान में इनमें से कुछ सुधारों को लागू कर रहे हैं ताकि 3सीआरसी प्रोटोकॉल को और परिष्कृत किया जा सके। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में पहले से ही मूल सीआरएसी और एसीआरसी प्रोटोकॉल में कई सुधार शामिल हैं जो डेटा की जटिलता को बढ़ाते हैं। उदाहरण के लिए, पहले, एसडीएस-पेज जैल पर क्रॉस-लिंक्ड, रेडियोधर्मी प्रोटीन-आरएनए कॉम्प्लेक्स को हल करने के बाद, उन्हें नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित कर दिया गया था और क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को धब्बा से अलग किया गया था। हालांकि, आरएनपी और बाद में आरएनए निष्कर्षण का हस्तांतरण बहुत अक्षम हो सकता है, खासकर जब आरएनए पोलीमरेज़ सबयूनिट्स जैसे बड़े आरबीपी से निपटते हैं। इसके परिणामस्वरूप क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली में महत्वपूर्ण कमी हो सकती है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को सीधे एसडीएस-पेज जेल स्लाइस से निकाला जाता है जैसा कि चित्र 1 में दिखाया गया है। इससे क्रॉस-लिंक्ड आरएनए की वसूली में वृद्धि हुई। इसके अतिरिक्त, सीडीएनए के पीसीआर प्रवर्धन के बाद उत्पाद को मूल रूप से 3%, कम पिघलने वाले तापमान अगारोस जैल पर हल किया गया था, और फिर जेल से 175-300 बीपी पीसीआर उत्पादों को निकाला गया था। हालांकि, इन जैल को आसानी से ओवरलोड किया जा सकता है, जिसके परिणामस्वरूप डीएनए का बहुत खराब पृथक्करण होता है। प्रीकास्ट टीबीई जैल के साथ अगारोस जैल को बदलने के परिणामस्वरूप अधिक सुसंगत आकार पृथक्करण और पीसीआर उत्पादों की बेहतर वसूली हुई।

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

आरएनए-बाइंडिंग प्रोटीन (आरबीपी) और उनके आरएनए सब्सट्रेट्स के बीच बातचीत तरलता और जटिलता प्रदर्शित करती है। अपने जीवनकाल के भीतर, एक एकल आरएनए को कई अलग-अलग आरबीपी से बांधा जा सकता है जो इसके उत्पादन, स्थिरता, गतिविधि और गिरावट को नियंत्रित करेगा। इस प्रकार, इन दो प्रकार के अणुओं के बीच मौजूद गतिशीलता को समझने के लिए बहुत कुछ किया गया है। एक विशेष रूप से महत्वपूर्ण सफलता 'सी रॉस-एलइंकिंग और आईएममुनोपीरेसिपिटेशन' (सीएलआईपी) के उद्भव के साथ आई। इस तकनीक ने कठोर जांच की अनुमति दी जिसमें आरएनए एक विशेष आरबीपी से बंधे हैं। संक्षेप में, रुचि का प्रोटीन यूवी को विवो में अपने आरएनए सब्सट्रेट्स से क्रॉस-लिंक किया जाता है, अत्यधिक कठोर परिस्थितियों में शुद्ध किया जाता है, और फिर प्रोटीन से सहसंयोजक रूप से क्रॉस-लिंक्ड आरएनए को सीडीएनए पुस्तकालयों में परिवर्तित किया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है। इसकी अवधारणा के बाद से, सीएलआईपी को अध्ययन के विशेष क्षेत्रों के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए कई व्युत्पन्न तकनीकों को विकसित किया गया है। हालांकि, पराबैंगनी प्रकाश का उपयोग करके क्रॉस-लिंकिंग कुख्यात रूप से अक्षम है। इसके परिणामस्वरूप विस्तारित एक्सपोजर समय होता है जो आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन के अस्थायी अध्ययन को असंभव बनाता है। इस मुद्दे को दूर करने के लिए, हमने हाल ही में बहुत बेहतर यूवी विकिरण और सेल कटाई उपकरणों को डिजाइन और बनाया है। इन नए उपकरणों का उपयोग करते हुए, हमने उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर जीवित कोशिकाओं में आरबीपी-आरएनए इंटरैक्शन के समय-समाधान विश्लेषण के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया: काइनेटिक सीआरऑस-लिंकिंग और सीडीएनए का एकनैलिसिस (3सीआरसी)। हमने हाल ही में पोषक तत्व तनाव अनुकूलन में खमीर आरबीपी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक का उपयोग किया। यह पांडुलिपि 34सी विधि का विस्तृत अवलोकन प्रदान करती है और एनआरडी 1 आरबीपी के साथ प्राप्त हाल के परिणामों को प्रस्तुत करती है।

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Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

काइनेटिक क्रॉस-लिंकिंग और सीडीएनए का विश्लेषण एक ऐसी विधि है जो उच्च अस्थायी संकल्प पर जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन की गतिशीलता की जांच की अनुमति देती है। यहां प्रोटोकॉल को विस्तार से वर्णित किया गया है, जिसमें खमीर कोशिकाओं की वृद्धि, यूवी क्रॉस-लिंकिंग, कटाई, प्रोटीन शुद्धिकरण और अगली पीढ़ी के अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी चरण शामिल हैं।

उच्च अस्थायी रिज़ॉल्यूशन पर विवो में प्रोटीन-आरएनए इंटरैक्शन डायनामिक्स की निगरानी

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

उच्च-रिज़ॉल्यूशन एकल कण विश्लेषण, इलेक्ट्रॉन क्रायो-माइक्रोस्कोपी इमेजिंग स्पैयर का उपयोग करना

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

एक मिलीसेकंड समय स्केल पर प्रोटीन परिसरों की गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए विट्रो प्रतिदीप्ति अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण में उपयोग करना

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

सी elegans शरीर की दीवार की मांसपेशियों में Vivo कैल्शियम इमेजिंग में

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

प्रोसिटोम एकल अणु स्तर पर लेबलिंग एकरूपता का व्यापक परिमाणन

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

ऑक्सीडेटिव तनाव के दौरान फाइब्रोनेक्टिन पर सेलुलर आडंशन की गतिशीलता और एपिथेलियल कोशिकाओं के प्रसार की जांच करना

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

मल्टीप्लेक्स्ड सह-प्रतिरक्षा का उपयोग कर प्रोटीन इंटरेक्शन नेटवर्क गतिशीलता का परिमाणीकरण

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

लाइव कोशिकाओं में प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन और प्रोटीन गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए ड्यूल-कलर फ्लोरेसेंस क्रॉस-सहसंबंध स्पेक्ट्रोस्कोपी

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

निगरानी प्रोटीन एकत्रीकरण कैनेटीक्स विवो में स्वचालित शामिल Caenorhabditis elegans में गिनती का उपयोग कर

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

200 केवी ट्रांसमिशन इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके उच्च-रिज़ॉल्यूशन क्रायो-ईएम डेटासेट का नियमित संग्रह

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

प्रोटीन और हाइड्रेशन पानी के पिकोसेकंड-नैनोसेकंड डायनामिक्स का अध्ययन करने के लिए उच्च-रिज़ॉल्यूशन न्यूट्रॉन स्पेक्ट्रोस्कोपी

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...