Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Wellcome Trust (091549 til S.G og 109093/Z/15/A til S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) og Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 til S.G.), European Molecular Biology Organization under et langsiktig postdoktorstipend (ALTF 1070-2017 til R.A.C.), og Danmarks uavhengige forskningsfond (T.H.J).

A. Langford og W. Worboys er tilknyttet UVO3, et kommersielt selskap. De hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og tolkning, eller beslutningen om å sende inn arbeidet for publisering.

χCRAC-metoden, kombinert med de nye kryssbindings- og cellehøstingsenhetene, har stort potensial fordi den er anvendelig for et bredt spekter av modellorganismer og derfor bør være av generell interesse for RNA-feltet. Det er mange områder der χCRAC kan utnyttes. For eksempel kan metoden brukes til å måle den hierarkiske samlingen av proteiner i store makromolekylære komplekser, som spleiseosomet og ribosomet, som ofte involverer dynamiske interaksjoner mellom proteiner og RNA-molekyler. Vi bruker det også rutinemessig til å overvåke interaksjoner mellom RNA-henfallsfaktorer og deres substrater når celler blir utsatt for ulike slags påkjenninger. Dette gjør oss i stand til å bestemme på hvilket stadium av den adaptive responsen disse faktorene er mest aktive, hvilke substrater de binder seg til, og hvor dynamiske disse interaksjonene er. Slike data skal gjøre det mulig for forskere å bestemme det relative bidraget fra hver faktor i tilpasning til miljøendringer.
χCRAC bruker dual affinity purification tags (HTF eller HTP) for å rense proteinet under svært strenge og denaturerende forhold. Dette sikrer at det korensede RNA er svært beriket for RNA som var kovalent kryssbundet til proteinet av interesse. Å stole på affinitetsmerker har imidlertid ulemper. For eksempel kan koden forstyrre proteinfunksjonen, noe som kan gi en forvrengt avlesning av dets RNA-bindende interaktom. I tillegg kan det for noen modellorganismer ikke alltid være mulig å bruke koder fordi de genetiske verktøyene for å integrere DNA-fragmenter i genomet eller for å transformere ekspresjonsplasmider ennå ikke er tilgjengelige. Det er imidlertid enkelt å endre noen deler av χCRAC-protokollen for å gjøre den kompatibel med CLIP-baserte protokoller som er avhengige av antistoffer for rensing av RBP. Denne studien viste faktisk at det er mulig å kombinere iCLIP-baserte rensinger med vår crosslinker. Vi er nå i ferd med å utvikle CLIP-protokoller for å studere den tidsmessige assosiasjonen av humane RNA-bindende proteiner med begynnende RNA-transkripter.
Når χCRAC utføres på et nytt protein, må UV-eksponeringen optimaliseres for å indusere maksimal tverrbinding. Dette er viktig fordi høy UV-eksponering kan redusere utvinningen av RNA under rensetrinnet. Celler som uttrykker rekombinant RBP ble utsatt for forskjellige UV-doser, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 og 1 J/cm 2. RNP-ene ble deretter fanget og RNAene ble fragmentert og radiomerket. Etterpå ble RNPene løst av SDS-PAGE og et autoradiogram ble tatt for å utlede hvilken eksponering som ga det mest intense signalet (dvs. maksimal tverrbinding).
Når de eksperimentelle forholdene er optimalisert, anbefales flere kontrolleksperimenter når du utfører χCRAC. For det første kan en UV-bestrålt, umerket prøve brukes til å overvåke bakgrunnsbindingen til rensekulene. For det andre, når man bruker χCRAC under et skifteksperiment, vil en andre tidsserie hvor cellene forskyves tilbake til det opprinnelige mediet muliggjøre undersøkelse av om filtreringen av cellene i seg selv induserer endringer i RNA-nivåer eller protein-RNA-interaksjoner.
Som nevnt i introduksjonen, foreslår mange nylig publiserte artikler en rekke optimaliseringer av CLIP-protokollen. Dette inkluderer bruk av fluorescerende merkede adaptere for å oppdage protein-RNA-komplekset gjennom infrarød skanning10, samt optimaliseringer til forskjellige nukleinsyrerensing og størrelsesvalgstrinn vist å øke kompleksiteten til de resulterende bibliotekene 12,45. Vi implementerer for tiden noen av disse forbedringene for å forbedre χCRAC-protokollen ytterligere. Protokollen som presenteres her inneholder allerede en rekke forbedringer av de opprinnelige CRAC- og χCRAC-protokollene som øker kompleksiteten til dataene. For eksempel, tidligere, etter å ha løst de tverrbundne, radioaktive protein-RNA-kompleksene på SDS-PAGE-geler, ble de overført til en nitrocellulosemembran og det tverrbundne RNA ble isolert fra flekken. Imidlertid kan overføringen av RNP og påfølgende RNA-ekstraksjon være svært ineffektiv, spesielt når det gjelder store RBP-er som RNA-polymerase-underenheter. Dette kan resultere i en betydelig reduksjon i utvinningen av det tverrbundne RNA. I den nåværende protokollen ekstraheres det tverrbundne RNA direkte fra SDS-PAGE gelskiver som illustrert i figur 1. Dette økte utvinningen av tverrbundne RNAer. I tillegg, etter PCR-amplifisering av cDNAene, ble produktet opprinnelig løst på 3%, agarosegeler med lav smeltetemperatur, og deretter ble 175-300 bp PCR-produkter ekstrahert fra gelen. Imidlertid kan disse gelene lett overbelastes, noe som resulterer i svært dårlig separasjon av DNA. Bytte av agarosegeler med prefabrikkerte TBE-geler resulterte i mer konsistent størrelsesseparasjon og bedre gjenvinning av PCR-produkter.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA er ofte avhengige av RBP for å utøve sin funksjon, noe som har ført til stor interesse for å forstå dynamikken mellom disse molekylene. Mange RBP har blitt identifisert i et bredt spekter av organismer. Imidlertid har det alltid vært notorisk vanskelig å studere RBP-RNA-interaksjoner in vivo. Et stort gjennombrudd i å studere slike interaksjoner kom med fremveksten av CLIP1. Denne metoden benytter ultrafiolett (UV, 254 nm) bestråling for å indusere kovalente bindinger mellom RBP og deres direkte bundne RNA (dvs. nulldistanse tverrbinding). Deretter blir RBP av interesse immunorenset under strenge forhold for å sikre at bare RNA kovalent kryssbundet til proteinene identifiseres. Bundne RNA blir deretter delvis fordøyd med RNaser og deretter omdannet til cDNA-biblioteker for sekvensering. Den høye rensingsstrengheten er viktig, da den øker spesifisiteten til protein- og RNA-utvinning, som også forbedres ytterligere gjennom SDS-PAGE-rensing av det tverrbundne ribonukleoprotein (RNP) -komplekset. CLIP og relaterte metoder gir også innsikt i nukleotidoppløsning i proteinbindingsstedet, fordi aminosyrer som krysser båndet til RNA ofte avslutter revers transkriptase under forberedelsen av sekvenseringsbiblioteket eller forårsaker at enzymet introduserer mutasjoner på dette stedet 1,2,3.
Siden introduksjonen har den opprinnelige CLIP-protokollen produsert et bemerkelsesverdig utvalg av avledede metoder. Et spesielt viktig gjennombrudd kom med utviklingen av HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som fusjonerer høykapasitetssekvensering med CLIP-tilnærmingen3. Dette har siden blitt tatt i bruk av alle CLIP-baserte metoder. iCLIP introduserte forbedringer i RNase-medierte trimmings- og adapterligeringsteknikker som muliggjør mer nøyaktig kartlegging av RBP-bindingsstedene4. PAR-CLIP kombinerte 4thio-uridin/uracil-merking med kryssbinding ved 365 nm, noe som gjør det mulig å kartlegge kryssbindingssteder ved å analysere T-C-substitusjoner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP og uvCLAP introduserte denatureringsbetingelser og doble affinitetsrensetrinn som ytterligere reduserer bakgrunnsbindingen til affinitetsharpiksen og ytterligere øker spesifisiteten til proteinfangst 2,6,7,8,9. I tillegg introduserte CRAC, uvCLAP og dCLIP merking av RBP av interesse med en affinitetskode, og overvant dermed behovet for å generere spesifikke antistoffer.
Det er også gjort flere optimaliseringer for å fremskynde CLIP-metodikken. Den opprinnelige CLIP-protokollen benyttet radiomerking av de fangede RNAene for å visualisere RBP-RNA-kompleksene etter SDS-PAGE. Bruk av radioaktivitet kan imidlertid være problematisk for laboratorier som ikke er satt opp for slikt arbeid. irCLIP inkorporerer en fluoroforkoblet adapter som muliggjør visualisering gjennom infrarød avbildning10 og sCLIP benytter biotinylering av fangede RNA for å visualisere dem gjennom streptapavidin-konjugert HRP11. Videre gir eCLIP fullstendig avkall på RNA-merking; I stedet blir proteinet skåret ut basert utelukkende på sin kjente størrelse12. Streptavidinbasert rensing har også blitt brukt til å fremskynde prosessen med bibliotekforberedelse i FAST-iCLIP, hvor en biotinylert 3'-adapter ligeres på RNA-ene og brukes til å muliggjøre rensing etter revers transkripsjon og sirkularisering13. Ytterligere forbedringer i iCLIP-protokollen økte også kompleksiteten til bibliotekene4.
Endelig har CLIP blitt modifisert for å muliggjøre fangst av RBP fra forskjellige cellulære underrom 14,15, for å visualisere nylig transkriberte RNA ved hjelp av pulserende induksjon av fotoaktiverbare ribonukleosider 5,16,17, for å fange metylerte RNA18,19,20, for å undersøke RNA-RNA-interaksjoner 21,22, og for å kartlegge 3' ender 23,24.
Til tross for de store bidragene fra CLIP-baserte teknikker for å hjelpe vår forståelse av samspillet mellom RBP og RNA, har det blitt begrenset av ineffektiviteten til UV-tverrbinding. Selv om kulturceller dyrket i et monolag generelt er relativt enkle å kryssbinde, er dette betydelig mer utfordrende i vev eller celler i løsning. Vev kan kreve flere runder med UV-eksponering for å trenge inn i de nødvendige cellelagene, mens mikrobielle celler ofte dyrkes i rike medier som inneholder aromatiske, UV-absorberende forbindelser25. Faktisk har UV-bestrålingstider på opptil 30 minutter blitt brukt til å generere tilstrekkelig tverrbinding mellom RBP og deres bundne RNA for slike prøver26,27,28. Denne utvidede UV-eksponeringen induserer stressresponser i cellen, slik UV-indusert DNA-skade, som kan forurense de endelige dataene i enkelte applikasjoner.
Flertallet av CLIP-studier har fokusert på å generere enkle "øyeblikksbilder" av spesifikke protein-RNA-interaksjoner i en celle. Imidlertid er protein-RNA-interaksjoner iboende dynamiske, spesielt når celler er utsatt for endringer i miljøet. Dette kan inkludere en plutselig reduksjon i tilgjengeligheten av essensielle næringsstoffer eller raske temperaturendringer. Som sådan, for å virkelig forstå rollen til en RBP under stress, er det best å utføre tidsoppløste analyser fordi de kan fange hele spekteret av RBP-mål under stress og bestemme på hvilket stadium av stressresponsen den valgte RBP er aktiv. Spesielt viste studier i gjær at de første minuttene av tilpasningen er helt avgjørende for overlevelse og RNA-halveringstider i bakterier kan variere fra minutter til sekunder 29,30,31,32,33. Slike tidsoppløste analyser bør derfor ideelt sett utføres med høy tidsoppløsning. De lange kryssbindingstidene gjør imidlertid studiet av adaptive responser i tidlig stadium spesielt utfordrende.
For å overvinne disse problemene har vi nylig utviklet en forbedret metode som er i stand til å kryssbinde og høste celler på minuttlange tidsskalaer. Vår χCRAC-metode tillater kvantitativ måling av dynamiske endringer i RBP-RNA-interaksjoner ved tidligere uvitnet oppløsning. Avgjørende for denne metoden var utviklingen av en ny UV-bestrålingsenhet32 som reduserer den nødvendige tverrbindingstiden i gjær og bakterier i oppløsning rundt 10 ganger, og effektivt fryser RBP-RNA-interaksjoner øyeblikkelig. I tillegg, for å raskt høste cellene etter UV-bestråling, utviklet vi en vakuumfiltreringsenhet som kan høste eksponentielt voksende gjær i en 0,5 L kultur på rundt 30 s32. Disse teknologiske innovasjonene tillater studier av RBP-RNA-dynamikk ved minuttskalaoppløsning. I tillegg introduserte vi også flere optimaliseringer til den opprinnelige CRAC-protokollen2 for å øke dens praktiske egenskaper.
Ved hjelp av χCRAC studerte vi nylig målomet til en gjærkjernefysisk RBP, Nab3, som svar på glukosemangel. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 danne et kompleks med Nrd1, en RBP og RNA-helikasen Sen1 for å danne NNS-komplekset. NNS-binding til RNA-polymerasen og det gryende transkriptet kan utløse transkripsjonell avslutning34. Dette komplekset er for det meste involvert i å fjerne kryptiske ikke-kodende RNA-transkripter, men har også vist seg å regulere ekspresjon av proteinkodende gener. Studien viste differensiell målretting av Nab3 til ikke-koding og koding av transkripsjoner etter bare ett minutts stress32. Vi demonstrerte at co-transkripsjonell avslutning av Nab3 resulterer i et svært forbigående, pulslignende uttrykk av retrotransposongener, som ville vært vanskelig å oppdage ved bruk av tradisjonelle CLIP-baserte tilnærminger. I tillegg økte de korte UV-bestrålingstidene i vår UV-tverrbinder også betydelig utvinning av kortvarige ikke-kodende RNA32. χCRAC vil sannsynligvis være et avgjørende verktøy for å belyse ikke bare hvordan RBP-er former responsen på stress på umiddelbare tidsskalaer, men også deres endrede roller gjennom hele livssyklusen til en respons. Dette manuskriptet gir en detaljert oversikt over alle trinnene i χCRAC-protokollen. For illustrative formål ble metoden brukt til å studere gjær Nrd1-proteinet, som er involvert i transkripsjonell avslutning og RNA-henfall35,36, og dets RNA-målom som svar på glukosemangel over en rekke tidspunkter. Til slutt demonstrerer vi også at vår UV-bestrålingsenhet raskt kan krysskoble RBP til RNA i HeLa-celler, noe som gjør det mulig å også utføre høyoppløselige tidsoppløste analyser i adherente celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

Samspillet mellom RNA-bindende proteiner (RBP) og deres RNA-substrater utviser fluiditet og kompleksitet. I løpet av levetiden kan et enkelt RNA bindes av mange forskjellige RBP-er som vil regulere produksjon, stabilitet, aktivitet og nedbrytning. Som sådan har mye blitt gjort for å forstå dynamikken som eksisterer mellom disse to typer molekyler. Et spesielt viktig gjennombrudd kom med fremveksten av 'cross-l inking and immunoprecipitation' (CLIP). Denne teknikken tillot streng undersøkelse av hvilke RNA som er bundet av en bestemt RBP. Kort sagt, proteinet av interesse er UV kryssbundet til dets RNA-substrater in vivo, renset under svært strenge forhold, og deretter blir RNAene kovalent kryssbundet til proteinet omdannet til cDNA-biblioteker og sekvensert. Siden unnfangelsen har mange avledede teknikker blitt utviklet for å gjøre CLIP mottagelig for bestemte fagområder. Imidlertid er tverrbinding ved hjelp av ultrafiolett lys notorisk ineffektiv. Dette resulterer i utvidede eksponeringstider som gjør den tidsmessige studien av RBP-RNA-interaksjoner umulig. For å løse dette problemet har vi nylig designet og bygget mye forbedrede UV-bestrålings- og cellehøstingsenheter. Ved hjelp av disse nye verktøyene utviklet vi en protokoll for tidsoppløste analyser av RBP-RNA-interaksjoner i levende celler ved høy temporal oppløsning: Kinetisk CR-oss-kobling og A-nalyseav c-DNA(χCRAC). Vi har nylig brukt denne teknikken til å studere rollen som gjær-RBP i næringsstresstilpasning. Dette manuskriptet gir en detaljert oversikt over χCRAC-metoden og presenterer nyere resultater oppnådd med Nrd1 RBP.

For å demonstrere effekten av χCRAC-metoden ble det utført et tidskurseksperiment med gjærstammer som uttrykker et HTP-merket Nrd1-protein. En detaljert skjematisk fremstilling som beskriver hvordan metoden fungerer, er gitt i figur 1. I likhet med Nab3 er Nrd1 involvert i kjernefysisk RNA-forfall av en rekke RNA-transkripsjoner37. Tidligere arbeid fra Corden-laboratoriet antydet at Nrd1-binding til RNA-målene endres betydelig når celler blir utsatt for glukose sult28,38. Som sådan ble celler som vokste eksponentielt i medium som inneholdt glukose (SD-TRP) skiftet til samme medium uten glukose (S-TRP) over et tidsforløp for å overvåke dynamiske endringer i Nrd1-RNA-interaksjoner. Det ble tatt prøver og kryssbundet i Vari-X-linkerkammeret (figur 3A) før skiftet og deretter etter 1, 2, 4, 8, 14 og 20 min. Mediet som ble brukt til cellevekst var bevisst mangelfull i tryptofan for å redusere UV-absorpsjon av denne aromatiske aminosyren. Merk at det er best å bruke syntetisk medium som er filtersterilisert som fordi autoklavering av mediet kan føre til karamellisering av sukker. Dette reduserer deretter tverrbindingseffektiviteten.
Figur 4A viser en representativ autoradiograf fra et χCRAC-eksperiment. Merk at i dette eksemplet ble ikke prøvene slått sammen. I stedet ble hver kjørt individuelt på gelen. Dette anbefales for innledende eksperimentelle tester for å vise at proteinet kryssbinder effektivt til RNA på alle de testede tidspunktene. Et spesielt intenst signal ble observert ved den forventede molekylvekten til RBP, som representerer proteinet bundet til svært korte, radiomerkede RNA som ikke er egnet for sekvensering. Derfor ble smøresignalet over dette båndet, som er proteinet kryssbundet til lengre RNA-fragmenter, isolert. Fragmentet ble kuttet fra like over proteinbåndet pluss rundt 30 kDa. Figur 4B viser et autoradiogram etter eksisjon, med proteinet kryssbundet til korte RNA igjen i gelen og det tidligere smøresignalet nå skåret ut.
Etter revers transkripsjon må cDNA-biblioteket amplifiseres med PCR. Imidlertid må overforsterkning av biblioteket unngås, da dette kan introdusere skjevhet mot sekvenser fortrinnsvis forsterket av polymerasen og generere PCR-artefakter. Overforsterkede biblioteker inneholder også et stort antall dupliserte sekvenser som kaster bort lesing på sequenceren. For å beregne det ideelle antall PCR-sykluser for amplifisering av det endelige biblioteket, ble en alikot av cDNA amplifisert gjennom qPCR ved bruk av P5- og BC-oligonukleotidene. Den første syklusen der biblioteket nådde topp fluorescens ble valgt som PCR-syklustelling. Figur 4C gir et eksempel på en qPCR fra et typisk cDNA-bibliotek, som ga et toppsyklustall på 16. Denne verdien ble deretter brukt for den endelige χCRAC PCR. For å behandle de sekvenserte dataene brukte vi programvare som tidligere ble utviklet i laboratoriet vårt (pyCRAC) og den tilsvarende rørledningen for analyse av kinetiske CRAC-data (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Disse programvareverktøyene med åpen kildekode muliggjør demultipleksing og trimming av dataene, fjerning av PCR-duplikater, identifisering av statistisk signifikante topper, klyngelesing i sammenhengende sekvenser og identifisering av bindingsmotiver39. Ytterligere detaljer om hvordan disse verktøyene fungerer, finnes på deres respektive nettsider.
Vi begynte også å utvikle en χCRAC-protokoll for pattedyrceller. De fleste pattedyrcellelinjer dyrkes som et monolag, og brettet i vår tverrbinder med den UV-permeable posen er ikke egnet for eksperimenter med adherente celler. For å løse dette problemet utviklet vi et stadium der brukerne kan UV-bestråle 1–2 petriskåler (150 mm diameter og 25 mm i dybden) med adherente celler (figur 3B). Som en første test ble effektiviteten til kryssbinderen for pattedyrceller målt gjennom kryssbinding og fangst av stabilt merket GFP-RBM7 ved bruk av anti-GFP-antistoffer og en tradisjonell CLIP-basert rensing. Som vist i figur 5A, var kryssbinderen i stand til å gjenopprette protein-RNA-komplekser fra pattedyrceller dyrket som et monolag ved bruk av 254 nm UV-bestråling ved effektivitet som kan sammenlignes med en mye brukt UV-bestrålingsanordning. Imidlertid er standard cellekulturplastikk som normalt brukes til UV-kryssbindingseksperimenter, ugjennomtrengelig for 254 nm UV. Derfor vil cellene i vår tverrbinder bare motta bestråling fra den øvre bredden av UV-lamper. For å overvinne dette utviklet vi en UV-permeabel petriskål i kvarts for cellevekst og tverrbinding. Bruk av kvartskulturvarer viste robust gjenvinning av protein-RNA-komplekser med så få som 2 s UV-bestråling (figur 5B). Når de kombineres med RBP-fangstmetoder for pattedyrceller som CLIP-teknologier, er disse korte kryssbindingstidene mottagelige med tidskurs for å gjenopprette spatiotemporale RNA-bindende profiler av RBP som respons på genotoksiske påkjenninger eller raske uttømminger av proteinfaktorer, eller parallelt med transkripsjons- eller cellesyklussynkronisering.
Figur 6 viser flere eksempler på Nrd1-data behandlet av χCRAC-rørledningen. Denne figuren ble utarbeidet ved hjelp av bedgraph-filene generert av rørledningen og python GenomeBrowser-pakken (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), som vi designet for å forenkle å lage genomleserbilder av dataene i publikasjonskvalitet. De grå rektanglene representerer genomiske regioner som uttrykte ikke-kodende RNA, slik som kryptisk ustabil transkript (CUT), stabile ukarakteriserte transkripsjoner (SUTs)40 og Xrn1-sensitive ustabile transkripsjoner (XUTs)41. Dataene i figur 6 viser at Nrd1 binder seg til mange av disse ikke-kodende RNA-transkriptene, i samsvar med ideen om at dette proteinet er involvert i nedbrytning av denne klassen av transkripsjoner42. Figur 6A viser en ~ 15 kb region på kromosom IV. Her var det en signifikant økning i binding av Nrd1 til transkripsjoner som koder for glukosetransportørene HXT6 og HXT7 med høy affinitet, som begge oppreguleres under glukosesult. Det er sannsynlig at transkripsjonsterminering av NNS-komplekset kan påvirke induksjonskinetikken til disse genene under glukosesult. Figur 6B viser et eksempel på Nrd1-kryssbinding til Imd3-transkripsjonen, som er kjent for å være regulert av Nab343. I dette tilfellet viste dataene en signifikant reduksjon i binding ved glukosesult. Tidligere arbeid viste redusert binding av Nab3 til Tye7-transkripsjonen under glukose sult44. I samsvar med denne observasjonen antyder χCRAC-dataene at bindingen av Nrd1 ble redusert under glukosesult og Nrd1-kryssbindingen til Tye7 var på sitt laveste etter 8 minutters stress (figur 4C). Det ser imidlertid ut til at denne effekten bare var forbigående, for etter 14 min glukosesult gikk Nrd1-bindingen tilbake til startnivå.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Figur 1: Skjematisk fremstilling av χCRAC-protokollen. Merkede stammer ble dyrket til ønsket tetthet. RBP indikerer RNA-bindende protein. Deretter ble det tatt en referanseprøve og kryssbundet med 254 nm UV-lys. De gjenværende cellene ble høstet ved filtrering og deretter raskt skiftet til det stressinduserende mediet. I χCRAC-eksperimentet som er beskrevet her, ble det tatt prøver og kryssbundet 1, 2, 4, 8, 14 og 20 minutter etter skiftet (1). RBP av interesse ble deretter renset ved hjelp av en svært streng to-trinns affinitetsrensing (2). Deretter ble de fangede tverrbundne RNAene delvis fordøyd med RNaser, radiomerket i 5'-enden og adaptere ble ligert på dem (3). 5'-adapterne inneholdt unike "in-read" strekkodesekvenser slik at de enkelte prøvene kunne separeres bioinformatisk etter sekvensering. Deretter ble RBP-RNA-kompleksene eluert, slått sammen og utfelt (4), løst av SDS-PAGE og visualisert ved autoradiografi (5). Deretter ble en enkelt gelskive med det radioaktive signalet like over hovedbåndet, illustrert med stiplet rød boks i autoradiografibildet, kuttet ut av gelen (5). Gelskivene ble behandlet med protease K, deretter ble RNA ekstrahert (6), omdannet til cDNA og amplifisert ved PCR (7). PCR-trinnet introduserte flere strekkoder (gul blokk introdusert av P7 oligo) slik at mange biblioteker kunne multiplekses til en enkelt bane. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figur 2: Tverrbinding og vakuumfiltrering. (A) Krysslenkeren. Cellesuspensjonen helles i en trakt øverst til høyre på maskinen (se også figur 3A for et nærbilde) og holdes i en UV-gjennomsiktig pose i midtskuffen. Denne posen er flankert av to skodder som forblir lukket til brukeren instruerer maskinen om å starte bestrålingstrinnet. Cellene bestråles med UV-lys fra brettene både over og under. Maskinen leveres med 254 og 365 nm UV-lamper, hvor sistnevnte kan brukes til PAR-CLIP-eksperimenter. Maskinen betjenes via et berøringsskjermpanel øverst til høyre som gjør det mulig å kontrollere UV-dosering eller eksponeringstid. (B) Etter tverrbinding dreneres cellene fra venstre side av maskinen. Cellesuspensjoner gjenvinnes gjennom vakuum og dreneres til en glasskolbe hvor de deretter kan helles i en vakuumfiltreringsanordning for høsting. (C) Vakuumfiltreringsenheter. Disse åpnes og lukkes via et klipp og et filter settes inn mellom det. Fire filtreringsenheter ble brukt parallelt i svært korte tidsserier for ikke å miste tid som følge av bytte av filtre. (D) Etter filtrering ble mediesupernatanten drenert til kolber for senere destruksjon. Ventiler ble installert under vakuumfiltreringsenhetene for å opprettholde vakuumet i systemet når filteret fjernes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figur 3: Kryssbinding av suspenderte vs. adherente celler. (A) Tverrbinderen med Vari-X-linkerkammeret for suspensjonsceller. Cellekulturen helles i prøveinnløpet (trakten) øverst til høyre i skuffen. (B) Brett som kan inneholde petriskåler av plast eller kvarts for kryssbinding av adherente celler eller små volumer av suspensjonsceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figur 4: Forberedelse av bibliotek. (A) Eksempel på et autoradiogram fra et Nrd1-HTP χCRAC-eksperiment. Det sterke, konsentrerte signalet representerer proteinet kryssbundet til svært korte RNA, mens smøret ovenfor representerer proteinet kryssbundet til RNA med tilstrekkelig lengde for sekvensering. (B) Utstryket ble skåret ut som vist i et autoradiogram tatt etter geleksisjon. (C) En representativ qPCR fra et χCRAC cDNA-bibliotek. I dette eksemplet ble maksimal amplifisering av cDNA nådd ved 16 sykluser. Dermed ble 16 sykluser brukt til den endelige forsterkningen. Feillinjen representerer standardavviket til tre tekniske qPCR-replikater. (D) Eksempel på et fosforbilde fra et cDNA-bibliotek på en 6% TBE-gel. (E) cDNA-lengde og kvalitetsanalyse fra en chipbasert kapillær elektroforese. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figur 5: Høy RNase-test iCLIP-eksperiment for å teste kryssbinding i pattedyrceller. Vist er autoradiogrammer fra GFP-RBM7 iCLIP-eksperimenter som testet effektiviteten av RNP-utvinning på tvers av ulike kryssbindende energier. Immunutfelling ble utført ved bruk av anti-GFP-antistoffer koblet til magnetiske perler på tverrbundne celler som stabilt uttrykte GFP-RBM7. Immunutfellinger ble inkubert med høye konsentrasjoner av RNase I for å trimme assosierte RNA til korte, ensartede lengder. RNP ble visualisert ved 32P-merking og SDS-PAGE og migrerer som et definert bånd, nær migrasjonen av det ikke-kryssbundne proteinet. Kvantifisering indikerer resultatene av densitometriske analyser av radiomerket RBM7-RNA-signal normalisert til anti-GFP western blot-signalet. (A) Cross-linking time-course av den ofte brukte UVP cross-linker versus vår cross-linker (Vari-X-linker; VxL). (B) Tverrbindende tidsforløp av vår kryssbinder på kvarts (venstre) og plast (høyre) kulturvarer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figur 6: Eksempel på genom-nettleserplott som viser kraften til χCRAC for å vise differensiell, tidsmessig binding av Nrd1 til målene. Hver boks viser plott for individuelle genomiske regioner. Pilene angir hvilken streng genene er kodet på (venstre pekende pil = minus streng; høyre pekende pil = pluss streng). Tidspunktene (min) er angitt med t0, t1, t2 osv. på y-aksene til hver delplott. Romertall som indikerer kromosomene og koordinatene vises. (A) Ved glukosemangel binder Nrd1 to glukosetransportører med høy affinitet, HXT6 og HXT7, som begge er oppregulert i denne tilstanden. (B) Nrd1 observeres å binde seg til Imd3, et allerede validert mål på Nab344, med redusert intensitet etter glukosesult. (C) Nrd1-binding av Tye7 utviser en dynamisk og forbigående natur, og avtar etter glukosesult til et minimum etter 8 minutters stress. Bindingen går imidlertid deretter tilbake til basalnivå etter 14 min. Leser ble normalisert til "leser per million" (RPM; y-aksen). Grå bokser angir områder som koder for ikke-kodende RNAer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Kinetisk kryssbinding og analyse av cDNA er en metode som tillater undersøkelse av dynamikken i protein-RNA-interaksjoner i levende celler ved høy temporal oppløsning. Her er protokollen beskrevet i detalj, inkludert vekst av gjærceller, UV-kryssbinding, høsting, proteinrensing og neste generasjons sekvenseringsbibliotekforberedelsestrinn.

Overvåking av protein-RNA-interaksjonsdynamikk in vivo ved høy temporal oppløsning ved bruk av χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Høyoppløselig enkeltpartikkelanalyse fra elektronkryomikroskopi bilder ved hjelp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Bruke i Vitro fluorescens resonans energioverføring å studere dynamikken i Protein komplekser på et millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom hele kvantifisering av merking homogenitet på ett molekyl nivå

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersøke dynamikken i Cellular vedheft og spredning av epitelceller på Fibronektin under oksidativt stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifisering av protein samspill nettverk dynamikk ved hjelp av multiplekset co-Immunutfelling

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Tofarget fluorescens krysskorrelasjonsspektroskopi for å studere proteinproteininteraksjon og proteindynamikk i levende celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Overvåking Protein Aggregation Kinetics In Vivo ved hjelp av automatisert inkluderingstelling i Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...