Эта работа была поддержана грантами Wellcome Trust (091549 для S.G и 109093/Z/15/A для S.M.), основным грантом Wellcome Trust Centre for Cell Biology (092076) и Советом по медицинским исследованиям для неклинических старших научных сотрудников (MR / R008205 / 1 для S.G.), Европейской организации молекулярной биологии в рамках долгосрочной постдокторской стипендии (ALTF 1070-2017 для R.A.C.), и Независимый исследовательский фонд Дании (T.H.J.).

А. Лэнгфорд и У. Уорбойс связаны с коммерческой компанией UVO3. Они не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и интерпретации данных или принятии решения о представлении работы для публикации.

Метод χCRAC в сочетании с новыми устройствами для сшивания и сбора клеток имеет большой потенциал, поскольку он применим к широкому кругу модельных организмов и, следовательно, должен представлять общий интерес для области РНК. Есть много областей, в которых χCRAC может быть использован. Например, метод может быть использован для измерения иерархической сборки белков в большие макромолекулярные комплексы, такие как сплайсосома и рибосома, которая часто включает динамические взаимодействия между белками и молекулами РНК. В настоящее время мы также регулярно используем его для мониторинга взаимодействия между факторами распада РНК и их субстратами, когда клетки подвергаются различным видам стрессов. Это позволяет определить, на какой стадии адаптивного ответа эти факторы наиболее активны, с какими субстратами они связываются и насколько динамичны эти взаимодействия. Такие данные должны позволить исследователям определить относительный вклад каждого фактора в адаптацию к изменениям окружающей среды.
χCRAC использует метки очистки с двойным сродством (HTF или HTP) для очистки белка в очень строгих и денатурирующих условиях. Это гарантирует, что коочищенная РНК высоко обогащена для РНК, которые были ковалентно сшиты с интересующим белком. Однако использование тегов сходства имеет недостатки. Например, метка может мешать функции белка, что может дать искаженное считывание его РНК-связывающего интерактома. Кроме того, для некоторых модельных организмов не всегда возможно использовать метки, потому что генетические инструменты для интеграции фрагментов ДНК в геном или для преобразования экспрессионных плазмид еще не доступны. Тем не менее, легко изменить некоторые части протокола χCRAC, чтобы сделать его совместимым с протоколами на основе CLIP, которые полагаются на антитела для очистки RBP. Действительно, это исследование показало, что можно комбинировать очистки на основе iCLIP с нашим сшивающим агентом. В настоящее время мы находимся в процессе разработки протоколов CLIP для изучения временной ассоциации РНК-связывающих белков человека с зарождающимися транскриптами РНК.
При выполнении χCRAC на новом белке необходимо оптимизировать воздействие ультрафиолета, чтобы вызвать максимальное сшивание. Это важно, потому что высокое воздействие ультрафиолета может уменьшить восстановление РНК на этапе очистки. Клетки, экспрессирующие рекомбинантный RBP, подвергались воздействию различных доз ультрафиолета: 100 мДж/см2, 250 мДж/см2, 500 мДж/см2 и 1 Дж/см2. Затем РНП были захвачены, а РНК были фрагментированы и радиоактивно мечены. После этого RNP были разрешены с помощью SDS-PAGE, и была сделана авторадиограмма, чтобы определить, какое воздействие дало наиболее интенсивный сигнал (т.е. максимальное сшивание).
После оптимизации условий эксперимента рекомендуется провести несколько контрольных экспериментов при выполнении χCRAC. Во-первых, облученный ультрафиолетом, немаркированный образец можно использовать для контроля фонового связывания с очищающими шариками. Во-вторых, при применении χCRAC во время эксперимента со сдвигом второй временной ряд, в котором клетки смещаются обратно в исходную среду, позволяет исследовать, вызывает ли сама фильтрация клеток изменения уровней РНК или взаимодействия белок-РНК.
Как упоминалось во введении, многочисленные недавно опубликованные статьи предлагают ряд оптимизаций протокола CLIP. Это включает в себя использование флуоресцентно меченных адаптеров для детектирования комплекса белок-РНК с помощью инфракрасного сканирования10, а также оптимизацию различных этапов очистки нуклеиновых кислот и выбора размера, которые, как показано, увеличивают сложность результирующих библиотек12,45. В настоящее время мы внедряем некоторые из этих улучшений для дальнейшего совершенствования протокола χCRAC. Представленный здесь протокол уже содержит ряд улучшений по сравнению с первоначальными протоколами CRAC и χCRAC, которые увеличивают сложность данных. Например, ранее после разрешения сшитых радиоактивных белково-РНК-комплексов на гелях SDS-PAGE их переносили на нитроцеллюлозную мембрану и выделяли сшитую РНК из блоттинга. Однако перенос РНП и последующая экстракция РНК могут быть очень неэффективными, особенно при работе с большими RBP, такими как субъединицы РНК-полимеразы. Это может привести к значительному снижению восстановления сшитой РНК. В текущем протоколе сшитая РНК извлекается непосредственно из срезов геля SDS-PAGE, как показано на рисунке 1. Это увеличило восстановление сшитых РНК. Кроме того, после ПЦР-амплификации кДНК продукт первоначально растворяли на 3%, низкотемпературных агарозных гелях, а затем из геля извлекали продукты ПЦР с содержанием 175–300.н. Однако эти гели могут быть легко перегружены, что приводит к очень плохому разделению ДНК. Замена агарозных гелей на сборные гели КЭ привела к более равномерному разделению по размерам и лучшему извлечению продуктов ПЦР.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

РНК часто полагаются на RBP для выполнения своей функции, что привело к большому интересу к пониманию динамики между этими молекулами. Многие RBP были идентифицированы в самых разных организмах. Тем не менее, всегда было трудно изучать взаимодействия RBP-РНК in vivo. Крупный прорыв в изучении таких взаимодействий произошел с появлением CLIP1. Этот метод использует ультрафиолетовое (УФ, 254 нм) облучение для индуцирования ковалентных связей между RBP и их непосредственно связанными РНК (т.е. сшивание на нулевом расстоянии). Впоследствии, интересующий RBP иммуноочищают в строгих условиях, чтобы гарантировать, что идентифицируются только РНК, ковалентно сшитые с белками. Затем связанные РНК частично расщепляются с помощью РНКаз и впоследствии превращаются в библиотеки кДНК для секвенирования. Высокая строгость очистки важна, поскольку она значительно увеличивает специфичность восстановления белка и РНК, которая также дополнительно усиливается за счет очистки SDS-PAGE сшитого комплекса рибонуклеопротеина (RNP). CLIP и связанные с ним методы также обеспечивают понимание нуклеотидного разрешения сайта связывания белка, поскольку во время подготовки библиотеки секвенирования аминокислоты, которые сшиты с РНК, часто прекращают обратную транскриптазу или заставляют фермент вводить мутации в этом сайте 1,2,3.
С момента своего появления оригинальный протокол CLIP породил замечательное разнообразие производных методологий. Особенно важным прорывом стала разработка HITS-CLIP (или CLIP-seq), который объединяет высокопроизводительное секвенирование с подходомCLIP 3. С тех пор это было принято во всех методологиях, основанных на CLIP. В iCLIP были усовершенствованы методы тримминга, опосредованного РНКазой, и лигирования адапторов, которые облегчают более точное картирование сайтов связывания RBP4. PAR-CLIP объединил маркировку 4тио-уридина/урацила с кросслинкингом на длине волны 365 нм, что позволило картировать сайты кросс-линкинга путем анализа T-Cзамен 5. CRAC, мочевина-iCLIP, dCLIP и uvCLAP ввели условия денатурации и этапы очистки с двойным сродством, которые еще больше снижают фоновое связывание с аффинной смолой и еще больше повышают специфичность захвата белка 2,6,7,8,9. Кроме того, CRAC, uvCLAP и dCLIP ввели маркировку интересующего RBP аффинной меткой, тем самым преодолев необходимость генерации специфических антител.
Кроме того, был внесен ряд оптимизаций для ускорения внедрения методологии CLIP. Оригинальный протокол CLIP использовал радиоактивное мечение захваченных РНК для визуализации комплексов RBP-РНК после SDS-PAGE. Однако использование радиоактивности может быть проблематичным для лабораторий, не созданных для такой работы. irCLIP включает в себя адаптер с флуорофорной связью, который облегчает визуализацию с помощью инфракрасной визуализации10 , а sCLIP использует биотинилирование захваченных РНК для их визуализации с помощью стрептавидин-конъюгированного HRP11. Кроме того, eCLIP полностью отказывается от маркировки РНК; вместо этого белок иссекается исключительно на основе его известного размера12. Очистка на основе стрептавидина также использовалась для ускорения процесса подготовки библиотеки в FAST-iCLIP, где биотинилированный 3'-адаптер лигируется с РНК и используется для обеспечения очистки после обратной транскрипции и циркуляции13. Дополнительные усовершенствования протокола iCLIP также значительно увеличили сложность библиотек4.
Наконец, CLIP был модифицирован для обеспечения захвата RBP из различных клеточных субкомпартментов 14,15, для визуализации вновь транскрибируемых РНК с использованием импульсной индукции фотоактивируемых рибонуклеозидов 5,16,17, для захвата метилированных РНК18,19,20, для изучения РНК-РНК-взаимодействий 21,22 и для картирования 3' концов 23,24.
Несмотря на большой вклад методов, основанных на CLIP, в помощь нашему пониманию взаимодействий между RBP и РНК, он был ограничен неэффективностью УФ-сшивания. Хотя культуральные клетки, выращенные в монослое, как правило, относительно легко сшиваются, это значительно сложнее в тканях или клетках в растворе. Тканям может потребоваться несколько раундов воздействия ультрафиолета для проникновения в требуемые клеточные слои, в то время как микробные клетки часто выращиваются в богатых средах, содержащих ароматические, поглощающие ультрафиолетовое излучение соединения25. Действительно, время ультрафиолетового облучения до 30 минут использовалось для создания достаточного сшивания между RBP и связанными с ними РНК для таких образцов26,27,28. Это расширенное воздействие ультрафиолета вызывает стрессовые реакции внутри клетки, такие как УФ-индуцированное повреждение ДНК, которое может загрязнить конечные данные в некоторых приложениях.
Большинство исследований CLIP были сосредоточены на создании единичных «снимков» специфических взаимодействий белка и РНК в клетке. Однако белок-РНК-взаимодействия по своей природе динамичны, особенно когда клетки подвержены изменениям в окружающей среде. Это может включать внезапное снижение доступности необходимых питательных веществ или быстрые изменения температуры. Таким образом, чтобы по-настоящему понять роль RBP во время стресса, лучше всего провести анализ с временным разрешением, потому что он может охватить весь спектр целей RBP во время стресса и определить, на какой стадии реакции на стресс активен выбранный RBP. В частности, исследования на дрожжах показали, что первые несколько минут адаптации абсолютно необходимы для выживания, а период полураспада РНК у бактерий может варьироваться от минут до секунд 29,30,31,32,33. Поэтому такие анализы с временным разрешением в идеале должны выполняться с высоким временным разрешением. Однако длительное время сшивания делает изучение адаптивных реакций на ранних стадиях особенно сложным.
Чтобы преодолеть эти проблемы, мы недавно разработали улучшенный метод, который способен сшивать и собирать клетки в течение нескольких минут. Наш метод χCRAC позволяет количественно измерять динамические изменения во взаимодействиях RBP-РНК при ранее ненаблюдаемом разрешении. Решающее значение для этого метода имела разработка нового устройства32 УФ-облучения, которое сокращает требуемое время сшивания у дрожжей и бактерий в растворе примерно в 10 раз, эффективно замораживая взаимодействия RBP-РНК мгновенно. Кроме того, чтобы быстро собирать клетки после УФ-облучения, мы разработали устройство вакуумной фильтрации, которое может собирать экспоненциально растущие дрожжи в культуре объемом 0,5 л примерно за 30 с32. Эти технологические инновации позволяют изучать динамику RBP-РНК с поминутным разрешением. Кроме того, мы также внесли несколько оптимизаций в исходный протокол CRAC2 , чтобы повысить его практичность.
Используя χCRAC, мы недавно изучили мишень дрожжевого ядерного RBP, Nab3, в ответ на депривацию глюкозы. В Saccharomyces cerevisiae Nab3 может образовывать комплекс с Nrd1, RBP и геликазой РНК Sen1 с образованием комплекса NNS. Связывание NNS с РНК-полимеразой и зарождающимся транскриптом может вызвать терминацию транскрипции34. Этот комплекс в основном участвует в удалении загадочных некодирующих транскриптов РНК, но также было показано, что он регулирует экспрессию генов, кодирующих белок. Исследование показало дифференциальное нацеливание Nab3 на некодирующие и кодирующие транскрипты после всего лишь минуты стресса32. Мы продемонстрировали, что котранскрипционное прекращение Nab3 приводит к очень преходящей, импульсной экспрессии генов ретротранспозона, которую было бы трудно обнаружить с помощью традиционных подходов, основанных на CLIP. Кроме того, короткое время УФ-облучения в нашем УФ-сшивающем агенте также значительно увеличило восстановление короткоживущих некодирующих РНК32. χCRAC, вероятно, станет важнейшим инструментом для выяснения не только того, как ОДП формируют реакцию на стресс в непосредственных временных рамках, но и их меняющихся ролей в течение всего жизненного цикла ответных мер. В этой рукописи представлен подробный обзор всех этапов протокола χCRAC. В иллюстративных целях метод был использован для изучения белка дрожжей Nrd1, который участвует в терминации транскрипции и распаде РНК35,36, и его РНК-мишени в ответ на депривацию глюкозы во множестве временных точек. Наконец, мы также демонстрируем, что наш блок УФ-облучения может быстро сшивать RBP с РНК в клетках HeLa, что позволяет также выполнять анализы с высоким разрешением по времени в адгезивных клетках.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

Взаимодействие между РНК-связывающими белками (RBP) и их РНК-субстратами проявляет текучесть и сложность. В течение своей жизни одна РНК может быть связана множеством различных RBP, которые будут регулировать ее производство, стабильность, активность и деградацию. Таким образом, многое было сделано для понимания динамики, существующей между этими двумя типами молекул. Особенно важным прорывом стало появление «cross-l inking and immunoprecipitation» (CLIP). Этот метод позволил тщательно исследовать, какие РНК связаны с конкретным RBP. Короче говоря, интересующий белок представляет собой УФ-сшитый с его субстратами РНК in vivo, очищенный в очень строгих условиях, а затем ковалентно сшитые с белком РНК превращаются в библиотеки кДНК и секвенируются. С момента его создания было разработано множество производных методов, чтобы сделать CLIP пригодным для определенных областей обучения. Однако сшивание с использованием ультрафиолетового света, как известно, неэффективно. Это приводит к увеличению времени воздействия, что делает невозможным временное исследование взаимодействий RBP-РНК. Чтобы решить эту проблему, мы недавно разработали и построили значительно улучшенные устройства для ультрафиолетового облучения и сбора клеток. Используя эти новые инструменты, мы разработали протокол для анализа взаимодействий RBP-РНК с временным разрешением в живых клетках с высоким временным разрешением: кинетическое связывание CRoss и анализ A c-ДНК(χCRAC). Недавно мы использовали этот метод для изучения роли дрожжей RBP в адаптации к стрессу питательных веществ. В этой рукописи представлен подробный обзор метода χCRAC и последние результаты, полученные с помощью Nrd1 RBP.

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Кинетическое сшивание и анализ кДНК – метод, позволяющий исследовать динамику белок-РНК-взаимодействий в живых клетках с высоким временным разрешением. Здесь подробно описан протокол, включая рост дрожжевых клеток, УФ-сшивание, сбор урожая, очистку белка и этапы подготовки библиотеки секвенирования следующего поколения.

Мониторинг динамики взаимодействия белок-РНК in vivo при высоком временном разрешении с использованием χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Анализ одиночных частиц с высокой разрешающей способностью при электронно-микроскопической микроскопии Изображения с использованием SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Использование в Vitro флуоресценции резонанс передачи энергии для изучения динамики белковых комплексов в масштабе времени миллисекунду

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Количественная оценка протеома общесистемной маркировки однородность на уровне одной молекулы

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Изучение динамики клеточной адгезии и распространения эпителиальных клеток на фибронектин во время окислительного стресса

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Количественная оценка динамики взаимодействия белков с использованием мультиплексного со-иммунопрециации

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Двухцветная флуоресцентная кросс-корреляционная спектроскопия для изучения белково-белкового взаимодействия и динамики белка в живых клетках

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Мониторинг кинетики агрегации белка In Vivo с использованием автоматизированного подсчета включений в Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...

Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope

Рутинный сбор наборов крио-ЭМ данных высокого разрешения с использованием просвечивающего электронного микроскопа 200 кВ

Cryo-electron microscopy (cryo-EM) has been established as a routine method for protein structure determination during the past decade, taking an ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Нейтронная спектроскопия высокого разрешения для исследования пикосекундно-наносекундной динамики белков и гидратационной воды

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...