Detta arbete stöddes av bidrag från Wellcome Trust (091549 till S.G och 109093/Z/15/A till S.M.), Wellcome Trust Centre for Cell Biology core grant (092076) och Medical Research Council Non-Clinical Senior Research Fellowship (MR/R008205/1 till S.G.), European Molecular Biology Organization under ett långsiktigt postdoktoralt stipendium (ALTF 1070-2017 till R.A.C), och Independent Research Fund Denmark (T.H.J).

A. Langford och W. Worboys är anslutna till UVO3, ett kommersiellt företag. De hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och tolkning, eller beslutet att skicka in arbetet för publicering.

χCRAC-metoden, i kombination med de nya tvärbindnings- och cellskördeanordningarna, har stor potential eftersom den är tillämplig på ett brett spektrum av modellorganismer och därför bör vara av allmänt intresse för RNA-fältet. Det finns många områden där χCRAC kan användas. Metoden skulle till exempel kunna användas för att mäta den hierarkiska sammansättningen av proteiner i stora makromolekylära komplex, såsom spliceosomen och ribosomen, vilket ofta involverar dynamiska interaktioner mellan proteiner och RNA-molekyler. Vi använder det nu också rutinmässigt för att övervaka interaktioner mellan RNA-sönderfallsfaktorer och deras substrat när celler utsätts för olika slags påfrestningar. Detta gör det möjligt för oss att bestämma i vilket skede av det adaptiva svaret dessa faktorer är mest aktiva, vilka substrat de binder till och hur dynamiska dessa interaktioner är. Sådana uppgifter bör göra det möjligt för forskare att avgöra varje faktors relativa bidrag till anpassningen till miljöförändringar.
χCRAC använder dubbla affinitetsreningstaggar (HTF eller HTP) för att rena proteinet under mycket stränga och denatureringsförhållanden. Detta säkerställer att det korenade RNA är mycket anrikat för RNA som kovalent korsbundet till proteinet av intresse. Att förlita sig på tillhörighetstaggar har dock nackdelar. Till exempel kan taggen störa proteinfunktionen, vilket kan ge en förvrängd avläsning av dess RNA-bindande interaktom. Dessutom kan det för vissa modellorganismer inte alltid vara möjligt att använda taggar eftersom de genetiska verktygen för att integrera DNA-fragment i genomet eller för att omvandla expressionsplasmider ännu inte är tillgängliga. Det är dock enkelt att ändra vissa delar av χCRAC-protokollet för att göra det kompatibelt med CLIP-baserade protokoll som förlitar sig på antikroppar för rening av RBP. Faktum är att denna studie visade att det är möjligt att kombinera iCLIP-baserade reningar med vår tvärbindare. Vi är nu i färd med att utveckla CLIP-protokoll för att studera den tidsmässiga associeringen av humana RNA-bindande proteiner med begynnande RNA-transkript.
Vid χCRAC på ett nytt protein måste UV-exponeringen optimeras för att inducera maximal tvärbindning. Detta är viktigt eftersom höga UV-exponeringar kan minska återhämtningen av RNA under reningssteget. Celler som uttrycker den rekombinanta RBP exponerades för olika UV-doser, 100 mJ/cm 2, 250 mJ/cm 2, 500 mJ/cm 2 och 1 J/cm 2. RNP fångades sedan och RNA fragmenterades och radiomärktes. Därefter löstes RNP: erna av SDS-PAGE och ett autoradiogram togs för att härleda vilken exponering som gav den mest intensiva signalen (dvs. maximal tvärbindning).
När experimentella förhållanden har optimerats rekommenderas flera kontrollexperiment när χCRAC utförs. Först kan ett UV-bestrålat, omärkt prov användas för att övervaka bakgrundsbindningen till reningspärlorna. För det andra, när χCRAC appliceras under ett skiftexperiment, möjliggör en andra tidsserie där cellerna flyttas tillbaka till det ursprungliga mediet undersökning av huruvida filtreringen av cellerna i sig inducerar förändringar i RNA-nivåer eller protein-RNA-interaktioner.
Som nämnts i inledningen föreslår många nyligen publicerade artiklar ett antal optimeringar av CLIP-protokollet. Detta inkluderar användning av fluorescerande märkta adaptrar för detektering av protein-RNA-komplexet genom infraröd skanning10 samt optimeringar av olika nukleinsyrarening och storleksvalsteg som visat sig öka komplexiteten hos de resulterande biblioteken 12,45. Vi implementerar för närvarande några av dessa förbättringar för att ytterligare förfina χCRAC-protokollet. Protokollet som presenteras här innehåller redan ett antal förbättringar av de ursprungliga CRAC- och χCRAC-protokollen som ökar komplexiteten hos data. Till exempel, tidigare, efter att ha löst de tvärbundna, radioaktiva protein-RNA-komplexen på SDS-PAGE-geler, överfördes de till ett nitrocellulosamembran och det tvärbundna RNA isolerades från fläcken. Överföringen av RNP och efterföljande RNA-extraktion kan emellertid vara mycket ineffektiv, särskilt när det handlar om stora RBP såsom RNA-polymerasunderenheter. Detta kan resultera i en signifikant minskning av återhämtningen av det tvärbundna RNA. I det nuvarande protokollet extraheras det tvärbundna RNA direkt från SDS-PAGE gelskivor som illustreras i figur 1. Detta ökade återhämtningen av tvärbundna RNA. Dessutom, efter PCR-amplifiering av cDNA: erna löstes produkten ursprungligen på 3%, agarosgeler med låg smälttemperatur och sedan extraherades 175–300 bp PCR-produkter från gelén. Dessa geler kan emellertid lätt överbelastas, vilket resulterar i mycket dålig separation av DNA. Att ersätta agarosgeler med prefabricerade TBE-geler resulterade i en jämnare storleksseparation och bättre återvinning av PCR-produkter.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA förlitar sig ofta på RBP för att utöva sin funktion, vilket har lett till stort intresse för att förstå dynamiken mellan dessa molekyler. Många RBP har identifierats i en mängd olika organismer. Det har dock alltid varit notoriskt svårt att studera RBP-RNA-interaktioner in vivo. Ett stort genombrott i att studera sådana interaktioner kom med uppkomsten av CLIP1. Denna metod använder ultraviolett (UV, 254 nm) bestrålning för att inducera kovalenta bindningar mellan RBP och deras direktbundna RNA (dvs nolldistanstvärbindning). Därefter immunrenas RBP under stränga förhållanden för att säkerställa att endast RNA kovalent tvärbundna till proteinerna identifieras. Bundna RNA smälts sedan delvis med RNaser och omvandlas därefter till cDNA-bibliotek för sekvensering. Den höga reningsstringensen är viktig eftersom den kraftigt ökar specificiteten av protein- och RNA-återhämtning, vilket också förbättras ytterligare genom SDS-PAGE-rening av det tvärbundna ribonukleoproteinkomplexet (RNP). CLIP och relaterade metoder ger också nukleotidupplösningsinsikt i proteinbindningsstället, eftersom aminosyror som tvärbundna till RNA under beredningen av sekvenseringsbiblioteket ofta avslutar det omvända transkriptaset eller får enzymet att införa mutationer på denna plats 1,2,3.
Sedan introduktionen har det ursprungliga CLIP-protokollet producerat en anmärkningsvärd mängd derivatmetoder. Ett särskilt viktigt genombrott kom med utvecklingen av HITS-CLIP (eller CLIP-seq), som kombinerar sekvensering med hög genomströmning med CLIP-metoden3. Detta har sedan dess antagits av alla CLIP-baserade metoder. iCLIP introducerade förbättringar i RNase-medierade trimnings- och adapterligeringstekniker som underlättar mer exakt kartläggning av RBP-bindningsställena4. PAR-CLIP kombinerade 4tio-uridin/uracilmärkning med tvärbindning vid 365 nm, vilket gjorde det möjligt att kartlägga tvärbindningsplatser genom att analysera T-C-substitutioner5. CRAC, urea-iCLIP, dCLIP och uvCLAP introducerade denatureringsförhållanden och reningssteg med dubbel affinitet som ytterligare minskar bakgrundsbindningen till affinitetshartset och ytterligare ökar specificiteten för proteininfångning 2,6,7,8,9. Dessutom introducerade CRAC, uvCLAP och dCLIP märkning av RBP av intresse med en affinitetstagg, vilket övervann behovet av att generera specifika antikroppar.
Flera optimeringar har också gjorts för att påskynda CLIP-metodiken. Det ursprungliga CLIP-protokollet använde radiomärkning av de fångade RNA: erna för att visualisera RBP-RNA-komplexen efter SDS-PAGE. Användningen av radioaktivitet kan dock vara problematisk för laboratorier som inte inrättats för sådant arbete. irCLIP innehåller en fluoroforkopplad adapter som underlättar visualisering genom infraröd avbildning10 och sCLIP använder biotinylering av fångade RNA för att visualisera dem genom streptavidin-konjugerad HRP11. Dessutom avstår eCLIP helt från RNA-märkning; Istället skärs proteinet enbart baserat på dess kända storlek12. Streptavidinbaserad rening har också använts för att påskynda processen för biblioteksberedning i FAST-iCLIP, där en biotinylerad 3'-adapter ligeras på RNA och används för att möjliggöra rening efter omvänd transkription och cirkularisering13. Ytterligare förbättringar av iCLIP-protokollet ökade också bibliotekens komplexitet kraftigt4.
Slutligen har CLIP modifierats för att möjliggöra infångning av RBP från olika cellulära underavdelningar 14,15, för att visualisera nyligen transkriberade RNA med pulsad induktion av fotoaktiverbara ribonukleosider 5,16,17, för att fånga metylerade RNA 18,19,20, för att undersöka RNA-RNA-interaktioner 21,22 och för att kartlägga 3'-ändar 23,24.
Trots de stora bidragen från CLIP-baserade tekniker för att hjälpa vår förståelse av interaktionerna mellan RBP och RNA, har det begränsats av ineffektiviteten hos UV-tvärbindning. Även om odlingsceller som odlas i ett monolager i allmänhet är relativt lätta att tvärbinda, är detta betydligt mer utmanande i vävnader eller celler i lösning. Vävnader kan kräva flera omgångar av UV-exponering för att tränga in i de nödvändiga cellskikten, medan mikrobiella celler ofta odlas i rika medier som innehåller aromatiska, UV-absorberande föreningar25. Faktum är att UV-bestrålningstider på upp till 30 minuter har använts för att generera tillräcklig tvärbindning mellan RBP och deras bundna RNA för sådana prover26,27,28. Denna utökade UV-exponering inducerar stressreaktioner i cellen, såsom UV-inducerad DNA-skada, som kan förorena slutdata i vissa applikationer.
Majoriteten av CLIP-studierna har fokuserat på att generera enstaka "ögonblicksbilder" av specifika protein-RNA-interaktioner i en cell. Protein-RNA-interaktioner är emellertid i sig dynamiska, särskilt när celler utsätts för förändringar i sin miljö. Detta kan inkludera en plötslig minskning av tillgången på viktiga näringsämnen eller snabba temperaturförändringar. Som sådan, för att verkligen förstå rollen som en RBP under stress, är det bäst att utföra tidsupplösta analyser eftersom de kan fånga hela spektrumet av RBP-mål under stress och bestämma i vilket skede av stressresponsen den valda RBP är aktiv. I synnerhet visade studier i jäst att de första minuterna av anpassning är helt avgörande för överlevnad och RNA-halveringstider i bakterier kan variera från minuter till sekunder 29,30,31,32,33. Därför bör sådana tidsupplösta analyser helst utföras med hög tidsupplösning. De långa tvärbindningstiderna gör dock studien av tidiga adaptiva svar särskilt utmanande.
För att övervinna dessa problem utvecklade vi nyligen en förbättrad metod som kan tvärbinda och skörda celler på minutlånga tidsskalor. Vår χCRAC-metod möjliggör kvantitativ mätning av dynamiska förändringar i RBP-RNA-interaktioner vid tidigare obevittnad upplösning. Avgörande för denna metod var utvecklingen av en ny UV-bestrålningsanordning32 som minskar den erforderliga tvärbindningstiden i jäst och bakterier i lösning runt 10-faldig, vilket effektivt fryser RBP-RNA-interaktioner omedelbart. Dessutom, för att snabbt skörda cellerna efter UV-bestrålning, utvecklade vi en vakuumfiltreringsanordning som kan skörda exponentiellt växande jäst i en 0,5 L kultur i cirka 30 s32. Dessa tekniska innovationer möjliggör studier av RBP-RNA-dynamik vid minutskala upplösning. Dessutom introducerade vi flera optimeringar av det ursprungliga CRAC-protokollet2 för att öka dess praktiska egenskaper.
Med hjälp av χCRAC studerade vi nyligen targetome av en jästkärnteknisk RBP, Nab3, som svar på glukosbrist. I Saccharomyces cerevisiae kan Nab3 bilda ett komplex med Nrd1, en RBP och RNA-helikasen Sen1 för att bilda NNS-komplexet. NNS-bindning till RNA-polymeraset och det begynnande transkriptet kan utlösa transkriptionsavslutning34. Detta komplex är mestadels involverat i att ta bort kryptiska icke-kodande RNA-transkript men har också visat sig reglera uttryck av proteinkodande gener. Studien visade differentiell inriktning av Nab3 till icke-kodande och kodande transkript efter bara en minut av stress32. Vi visade att samtranskriptionell terminering av Nab3 resulterar i ett mycket övergående, pulsliknande uttryck av retrotransposongener, vilket skulle ha varit svårt att upptäcka med traditionella CLIP-baserade metoder. Dessutom ökade de korta UV-bestrålningstiderna i vår UV-tvärbindning också signifikant återhämtningen av kortlivade icke-kodande RNA32. χCRAC kommer sannolikt att vara ett viktigt verktyg för att belysa inte bara hur RBP formar svaret på stress på omedelbara tidsramar utan också deras förändrade roller under hela livscykeln för en respons. Detta manuskript ger en detaljerad översikt över alla steg i χCRAC-protokollet. För illustrativa ändamål användes metoden för att studera jäst Nrd1-proteinet, som är involverat i transkriptionell terminering och RNA-sönderfall35,36, och dess RNA-målome som svar på glukosbrist över en mängd tidpunkter. Slutligen visar vi också att vår UV-bestrålningsenhet snabbt kan tvärbinda RBP till RNA i HeLa-celler, vilket gör det möjligt att även utföra högupplösta tidsupplösta analyser i vidhäftande celler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

Samspelet mellan RNA-bindande proteiner (RBP) och deras RNA-substrat uppvisar fluiditet och komplexitet. Inom sin livslängd kan ett enda RNA bindas av många olika RBP som reglerar dess produktion, stabilitet, aktivitet och nedbrytning. Som sådan har mycket gjorts för att förstå dynamiken som finns mellan dessa två typer av molekyler. Ett särskilt viktigt genombrott kom med uppkomsten av "cross-l bläckning och immunoprecipitation" (CLIP). Denna teknik möjliggjorde strikt undersökning av vilka RNA som är bundna av en viss RBP. Kort sagt, proteinet av intresse är UV-tvärbundet till dess RNA-substrat in vivo, renat under mycket stränga förhållanden, och sedan omvandlas RNA: erna kovalent tvärbundna till proteinet till cDNA-bibliotek och sekvenseras. Sedan dess uppfattning har många derivattekniker utvecklats för att göra CLIP mottaglig för vissa studier. Tvärbindning med ultraviolett ljus är dock notoriskt ineffektivt. Detta resulterar i förlängda exponeringstider som gör den tidsmässiga studien av RBP-RNA-interaktioner omöjlig. För att lösa detta problem har vi nyligen designat och byggt mycket förbättrade UV-bestrålnings- och cellskördsenheter. Med hjälp av dessa nya verktyg utvecklade vi ett protokoll för tidsupplösta analyser av RBP-RNA-interaktioner i levande celler med hög tidsupplösning: Kinetic CRoss-linking och Analysis of cDNAs (χCRAC). Vi använde nyligen denna teknik för att studera rollen av jäst RBP i näringsstress anpassning. Detta manuskript ger en detaljerad översikt över χCRAC-metoden och presenterar de senaste resultaten som erhållits med Nrd1 RBP.

För att demonstrera effekten av χCRAC-metoden utfördes ett tidsförloppsexperiment med jäststammar som uttryckte ett HTP-märkt Nrd1-protein. En detaljerad schematisk representation som beskriver hur metoden fungerar finns i figur 1. Liksom Nab3 är Nrd1 involverad i nukleärt RNA-sönderfall av en mängd olika RNA-transkript37. Tidigare arbete från Corden-laboratoriet föreslog att Nrd1-bindning till dess RNA-mål förändras signifikant när celler utsätts för glukossvält28,38. Som sådan flyttades celler som växte exponentiellt i medium innehållande glukos (SD-TRP) till samma medium utan glukos (S-TRP) under en tidsförlopp för att övervaka dynamiska förändringar i Nrd1-RNA-interaktioner. Prover togs och tvärfästes i vari-X-länkkammaren (figur 3A) före skiftet och sedan efter 1, 2, 4, 8, 14 och 20 minuter. Mediet som användes för celltillväxt var medvetet bristfälligt i tryptofan för att minska UV-absorptionen av denna aromatiska aminosyra. Observera att det är bäst att använda syntetiskt medium som är filtersteriliserat eftersom autoklavering av mediet kan leda till karamellisering av sockerarterna. Detta minskar sedan tvärbindningseffektiviteten.
Figur 4A visar en representativ autoradiograf från ett χCRAC-experiment. Observera att i det här exemplet har exemplen inte slagits samman. Istället kördes var och en individuellt på gelén. Detta rekommenderas för inledande experimentella tester för att visa att proteinet tvärbinder effektivt till RNA vid alla testade tidpunkter. En särskilt intensiv signal observerades vid den förväntade molekylvikten för RBP, vilket representerar proteinet bundet till mycket korta, radioaktivt märkta RNA som inte är mottagliga för sekvensering. Därför isolerades smetsignalen ovanför detta band, vilket är proteinet tvärbundet till längre RNA-fragment. Fragmentet skars från strax ovanför proteinbandet plus cirka 30 kDa. Figur 4B visar ett autoradiogram efter excision, med proteinet tvärbundet till korta RNA kvar i gelén och den tidigare utstrykande signalen nu utskuren.
Efter omvänd transkription måste cDNA-biblioteket amplifieras med PCR. Överamplifiering av biblioteket måste dock undvikas eftersom detta kan introducera bias mot sekvenser som företrädesvis förstärks av polymeraset och generera PCR-artefakter. Överförstärkta bibliotek innehåller också ett stort antal dubbla sekvenser som slösar bort läsningar på sekvenseraren. För att beräkna det ideala antalet PCR-cykler för amplifiering av det slutliga biblioteket amplifierades en alikvot av cDNA genom qPCR med användning av P5- och BC-oligonukleotiderna. Den första cykeln där biblioteket nådde toppfluorescens valdes som PCR-cykelräkning. Figur 4C ger ett exempel på en qPCR från ett typiskt cDNA-bibliotek, vilket gav ett toppcykelantal på 16. Detta värde användes sedan för den slutliga χCRAC PCR. För att bearbeta sekvenserade data använde vi programvara som tidigare utvecklats i vårt labb (pyCRAC) och motsvarande pipeline för analys av kinetiska CRAC-data (Nues et al., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Dessa programvaruverktyg med öppen källkod möjliggör demultiplexering och trimning av data, borttagning av PCR-dubbletter, identifiering av statistiskt signifikanta toppar, klusterläsningar i sammanhängande sekvenser och identifiering av bindningsmotiv39. Mer information om hur dessa verktyg fungerar finns på deras respektive webbsidor.
Vi började också utveckla ett χCRAC-protokoll för däggdjursceller. Majoriteten av däggdjurens cellinjer odlas som ett monolager och brickan i vår tvärbindare med den UV-genomsläppliga påsen är inte lämplig för experiment med vidhäftande celler. För att övervinna detta problem utvecklade vi ett stadium där användare kan UV-bestråla 1–2 petriskålar (150 mm diameter och 25 mm djup) med vidhäftande celler (figur 3B). Som ett första test mättes tvärbindningseffektiviteten för däggdjursceller genom tvärbindning och infångning av stabilt märkt GFP-RBM7 med hjälp av anti-GFP-antikroppar och en traditionell CLIP-baserad rening. Som visas i figur 5A kunde tvärbindaren återvinna protein-RNA-komplex från däggdjursceller odlade som ett monolager med 254 nm UV-bestrålning vid effektivitet som är jämförbar med en allmänt använd UV-bestrålningsanordning. Standardcellodlingsplastvaror som normalt används för UV-tvärbindningsexperiment är emellertid ogenomträngliga för 254 nm UV. Därför skulle cellerna i vår tvärbindare endast få bestrålning från den övre stranden av UV-lampor. För att övervinna detta utvecklade vi en UV-permeabel kvartspetriskål för celltillväxt och tvärbindning. Användning av kvartsodlingskärl visade robust återvinning av protein-RNA-komplex med så få som 2 s UV-bestrålning (figur 5B). I kombination med RBP-infångningsmetoder för däggdjursceller, såsom CLIP-teknik, är dessa korta tvärbindningstider mottagliga med tidsförlopp för att återställa spatiotemporala RNA-bindande profiler av RBP som svar på genotoxiska påfrestningar eller snabba uttömningar av proteinfaktorer, eller parallellt med transkriptionell eller cellcykelsynkronisering.
Figur 6 visar flera exempel på Nrd1-data som bearbetas av χCRAC-pipelinen. Den här figuren har tagits fram med hjälp av bedgraph-filerna som genererades av pipelinen och python GenomeBrowser-paketet (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/), som vi utformade för att förenkla skapandet av genomwebbläsarbilder av data av publikationskvalitet. De grå rektanglarna representerar genomiska regioner som uttryckte icke-kodande RNA, såsom kryptiskt instabilt transkript (CUT), stabila okarakteriserade transkript (SUT)40 och Xrn1-känsliga instabila transkript (XUT)41. Data i figur 6 visar att Nrd1 binder till många av dessa icke-kodande RNA-transkript, vilket överensstämmer med tanken att detta protein är involverat i nedbrytning av denna klass av transkript42. Figur 6A visar en ~ 15 kb region på kromosom IV. Här sågs en signifikant ökning av bindningen av Nrd1 till transkript som kodar för glukostransportörerna HXT6 och HXT7 med hög affinitet, vilka båda är uppreglerade under glukossvält. Det är troligt att transkriptionsavslutning av NNS-komplexet kan påverka induktionskinetiken hos dessa gener under glukossvält. Figur 6B visar ett exempel på Nrd1-tvärbindning till Imd3-transkriptet, som är känt för att regleras av Nab343. I detta fall visade data en signifikant minskning av bindningen vid glukossvält. Tidigare arbete visade minskad bindning av Nab3 till Tye7-transkriptet under glukossvält44. I överensstämmelse med denna observation tyder χCRAC-data på att bindningen av Nrd1 minskade under glukossvält och Nrd1-tvärbindningen till Tye7 var som lägst efter 8 minuters stress (figur 4C). Det verkar dock som om denna effekt endast var övergående, för efter 14 minuters glukossvält gick Nrd1-bindningen tillbaka till startnivåerna.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Figur 1: Schematisk representation av χCRAC-protokollet. Märkta stammar odlades tills önskad densitet. RBP indikerar RNA-bindande protein. Därefter togs ett referensprov och tvärfästes med 254 nm UV-ljus. De återstående cellerna skördades genom filtrering och skiftades sedan snabbt till det spänningsinducerande mediet. För χCRAC-experimentet som beskrivs här togs prover och tvärbands 1, 2, 4, 8, 14 och 20 minuter efter skiftet (1). RBP av intresse renades sedan med hjälp av en mycket sträng tvåstegs affinitetsrening (2). Därefter smältes de fångade tvärbundna RNA: erna delvis med RNaser, radiomärkta i 5'-änden och adaptrar ligerades på dem (3). 5'-adaptrarna innehöll unika "in-read" streckkodssekvenser så att de enskilda proverna kunde separeras bioinformatiskt efter sekvensering. RBP-RNA-komplexen eluerades, poolades och fälldes ut tillsammans (4), löstes av SDS-PAGE och visualiserades genom autoradiografi (5). Därefter klipptes en enda gelskiva innehållande den radioaktiva signalen strax ovanför huvudbandet, illustrerad med streckad röd ruta i autoradiografibilden, från gelén (5). Gelskivorna behandlades med proteas K och RNA extraherades därefter (6), omvandlades till cDNA och amplifierades genom PCR (7). PCR-steget introducerade ytterligare streckkoder (gult block introducerat av P7-oligo) så att många bibliotek kunde multiplexeras till ett enda körfält. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Figur 2: Tvärbindning och vakuumfiltrering. (A) Tvärbindaren. Cellsuspensionen hälls i en tratt längst upp till höger på maskinen (se även figur 3A för en närbild) och hålls i en UV-transparent påse i mittfacket. Denna påse flankeras av två fönsterluckor som förblir stängda tills användaren instruerar maskinen att starta bestrålningssteget. Cellerna bestrålas med UV-ljus från brickorna både ovan och under. Maskinen levereras med 254 och 365 nm UV-lampor, där den senare är tillämplig för PAR-CLIP-experiment. Maskinen manövreras via en pekskärmspanel längst upp till höger som gör att man kan kontrollera UV-dosering eller exponeringstid. B) Efter tvärbindning dräneras cellerna från maskinens vänstra sida. Cellsuspensioner återvinns genom vakuum och dräneras i en glaskolv där de därefter kan hällas i en vakuumfiltreringsanordning för skörd. c) Anordningar för vakuumfiltrering. Dessa öppnas och stängs via ett klipp och ett filter sätts in mellan det. Fyra filtreringsanordningar användes parallellt för mycket korta tidsserier för att inte förlora någon tid till följd av filterbyte. D) Efter filtrering dränerades mediesupernatanten i flaskor för senare bortskaffande. Ventiler installerades under vakuumfiltreringsanordningarna för att bibehålla vakuumet i systemet när filtret tas bort. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Figur 3: Tvärbindning suspenderad kontra vidhäftande celler. (A) Tvärbindningen med vari-X-linkerkammaren för suspensionsceller. Cellkulturen hälls i provinloppet (tratten) som ligger längst upp till höger på brickan. (B) Bricka som kan hålla petriskålar av plast eller kvarts för tvärbindning av vidhäftande celler eller små volymer suspensionsceller. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Figur 4: Förberedelse av bibliotek. (A) Exempel på ett autoradiogram från ett Nrd1-HTP χCRAC-experiment. Den starka, koncentrerade signalen representerar proteinet tvärbundet till mycket korta RNA, medan utstryket ovan representerar proteinet tvärbundet till RNA med tillräcklig längd för sekvensering. (B) Utstryket skars ut som visas i ett autoradiogram som tagits efter gelexcision. (C) En representativ qPCR från ett χCRAC cDNA-bibliotek. I detta exempel uppnåddes maximal amplifiering av cDNA vid 16 cykler. Således användes 16 cykler för den slutliga förstärkningen. Felstapeln representerar standardavvikelsen för tre tekniska qPCR-repliker. (D) Exempel på en fosforbild från ett cDNA-bibliotek på en 6% TBE-gel. (E) cDNA-längd och kvalitetsanalys från en chipbaserad kapillärelektrofores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Figur 5: iCLIP-experiment med högt RNas-test för att testa tvärbindning i däggdjursceller. Här visas autoradiogram från GFP-RBM7 iCLIP-experiment som testade effektiviteten av RNP-återhämtning över olika tvärbindningsenergier. Immunprecipitationar utfördes med användning av anti-GFP-antikroppar kopplade till magnetiska pärlor på tvärbundna celler som stabilt uttryckte GFP-RBM7. Immunfällningar inkuberades med höga koncentrationer av RNas I för att trimma associerade RNA till korta, enhetliga längder. RNP visualiserades genom 32P-märkning och SDS-PAGE och migrerades som ett definierat band, nära migrationen av det icke-tvärbundna proteinet. Kvantifiering indikerar resultaten av densitometriska analyser av radioaktivt märkt RBM7-RNA-signal normaliserad till anti-GFP western blot-signalen. (A) Tvärbindningstid för den vanliga UVP-tvärbindaren kontra vår tvärbindning (Vari-X-linker; VxL). (B) Tvärbindningstid för vår tvärbindning på kvarts (vänster) och plast (höger) kulturartiklar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Figur 6: Exempel på genomwebbläsardiagram som visar kraften hos χCRAC för att visa differentiell, tidsmässig bindning av Nrd1 till dess mål. Varje ruta visar diagram för enskilda genomiska regioner. Pilarna anger på vilken sträng generna är kodade (vänster pekande pil = minus sträng; höger pekande pil = plus sträng). Tidpunkterna (min) anges med t0, t1, t2 osv. på y-axlarna i varje delområde. Romerska siffror som anger kromosomerna och koordinaterna visas. (A) Vid glukosbrist binder Nrd1 två glukostransportörer med hög affinitet, HXT6 och HXT7, som båda är uppreglerade i detta tillstånd. (B) Nrd1 har observerats binda till Imd3, ett redan validerat mål för Nab344, med minskad intensitet efter glukossvält. (C) Nrd1-bindning av Tye7 uppvisar en dynamisk och övergående natur, som minskar efter glukossvält till ett minimum efter 8 minuters stress. Bindningen återgår emellertid därefter till basala nivåer efter 14 minuter. Läsningar normaliserades till "läsningar per miljon" (RPM; y-axel). Grå rutor anger regioner som kodar för icke-kodande RNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

Kinetisk tvärbindning och analys av cDNA är en metod som möjliggör undersökning av dynamiken i protein-RNA-interaktioner i levande celler vid hög tidsupplösning. Här beskrivs protokollet i detalj, inklusive tillväxt av jästceller, UV-tvärbindning, skörd, proteinrening och nästa generations sekvenseringsbiblioteksberedningssteg.

Övervakning av protein-RNA-interaktionsdynamik in vivo vid hög tidsupplösning med χCRAC

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

Högupplösande enkelpartikelanalys från elektronkryo-mikroskopi bilder med hjälp av SPHIRE

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Använda i Vitro fluorescens resonans energiöverföring att studera dynamiken i proteinkomplex på en millisekund tidsskala

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom-wide kvantifiering av märkning homogenitet på nivån enda molekyl

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Undersöka dynamiken i cellulära vidhäftning och spridning av epitelceller på fibronectin under oxidativ stress

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Kvantifiering av proteininteraktion Nätverksdynamik med hjälp av multiplexerade Co-immunoprecipitation

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Fluorescens spektroskopi med dubbla färger för att studera protein-proteininteraktion och proteindynamik i levande celler

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Övervakning av proteinaggregeringskinetik in vivo med hjälp av automatiserad inkluderingsräkning i Caenorhabditis elegans

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...