Bu çalışma, Wellcome Trust (091549 S.G.'ye ve 109093/Z/15/A'dan S.M.'ye), Wellcome Trust Centre for Cell Biology çekirdek hibesi (092076) ve Tıbbi Araştırma Konseyi Klinik Olmayan Kıdemli Araştırma Bursu (MR/R008205/1'den S.G.'ye), Avrupa Moleküler Biyoloji Örgütü'nden uzun süreli doktora sonrası burs (ALTF 1070-2017'den R.A.C.'ye) tarafından desteklenmiştir. ve Danimarka Bağımsız Araştırma Fonu (T.H.J).

A. Langford ve W. Worboys, ticari bir şirket olan UVO3'e bağlıdır. Çalışma tasarımında, veri toplama ve yorumlamada veya çalışmayı yayınlanmak üzere gönderme kararında hiçbir rolleri yoktu.

Yeni çapraz bağlama ve hücre toplama cihazlarıyla birleştirilen χCRAC yöntemi, çok çeşitli model organizmalara uygulanabilir olduğu ve bu nedenle RNA alanına genel ilgi göstermesi gerektiği için büyük bir potansiyele sahiptir. χCRAC'ın kullanılabileceği birçok alan vardır. Örneğin, yöntem, proteinlerin hiyerarşik montajını, genellikle proteinler ve RNA molekülleri arasındaki dinamik etkileşimleri içeren splisozom ve ribozom gibi büyük makromoleküler komplekslere ölçmek için kullanılabilir. Ayrıca, hücreler çeşitli streslere maruz kaldıklarında RNA bozunma faktörleri ve substratları arasındaki etkileşimleri izlemek için rutin olarak kullanıyoruz. Bu, adaptif yanıtın hangi aşamasında bu faktörlerin en aktif olduğunu, hangi substratlara bağlandıklarını ve bu etkileşimlerin ne kadar dinamik olduğunu belirlememizi sağlar. Bu tür veriler, araştırmacıların çevresel değişikliklere adaptasyonda her bir faktörün göreceli katkısını belirlemelerini sağlamalıdır.
χCRAC, proteini son derece sıkı ve denatüre edici koşullar altında saflaştırmak için çift afiniteli saflaştırma etiketleri (HTF veya HTP) kullanır. Bu, kosafifiye RNA'nın, ilgilenilen proteine kovalent olarak çapraz bağlanmış RNA'lar için yüksek oranda zenginleştirilmesini sağlar. Ancak, benzeşim etiketlerine güvenmenin dezavantajları vardır. Örneğin, etiket protein fonksiyonuna müdahale edebilir, bu da RNA bağlayıcı interaktomunun çarpık bir okumasını verebilir. Ek olarak, bazı model organizmalar için etiketleri kullanmak her zaman mümkün olmayabilir, çünkü DNA parçalarını genoma entegre etmek veya ekspresyon plazmidlerini dönüştürmek için genetik araçlar henüz mevcut değildir. Bununla birlikte, χCRAC protokolünün bazı bölümlerini, RBP'nin saflaştırılması için antikorlara dayanan CLIP tabanlı protokollerle uyumlu hale getirmek için değiştirmek kolaydır. Gerçekten de, bu çalışma iCLIP bazlı saflaştırmaları çapraz bağlayıcımızla birleştirmenin mümkün olduğunu göstermiştir. Şimdi, insan RNA bağlayıcı proteinlerinin yeni ortaya çıkan RNA transkriptleriyle zamansal ilişkisini incelemek için CLIP protokolleri geliştirme sürecindeyiz.
Yeni bir protein üzerinde χCRAC gerçekleştirirken, maksimum çapraz bağlanmayı indüklemek için UV maruziyeti optimize edilmelidir. Bu önemlidir, çünkü yüksek UV maruziyeti, saflaştırma adımı sırasında RNA'nın geri kazanımını azaltabilir. Rekombinant RBP'yi eksprese eden hücreler çeşitli UV dozlarına, 100 mJ / cm2, 250 mJ / cm2, 500 mJ / cm2 ve 1 J /cm2'ye maruz bırakıldı. RNP'ler daha sonra yakalandı ve RNA'lar parçalandı ve radyo-etiketlendi. Daha sonra, RNP'ler SDS-PAGE tarafından çözüldü ve hangi maruziyetin en yoğun sinyali verdiğini (yani maksimum çapraz bağlama) çıkarmak için bir otoradyogram alındı.
Deney koşulları optimize edildikten sonra, χCRAC gerçekleştirilirken birkaç kontrol deneyi önerilir. İlk olarak, saflaştırma boncuklarına arka plan bağlanmasını izlemek için UV ışınlanmış, etiketlenmemiş bir numune kullanılabilir. İkincisi, bir vardiya deneyi sırasında χCRAC uygulanırken, hücrelerin orijinal ortama geri kaydırıldığı ikinci bir zaman serisi, hücrelerin filtrasyonunun kendisinin RNA seviyelerinde veya protein-RNA etkileşimlerinde değişikliklere neden olup olmadığının araştırılmasını sağlar.
Giriş'te belirtildiği gibi, yakın zamanda yayınlanmış çok sayıda makale, CLIP protokolünde bir dizi optimizasyon önermektedir. Bu, kızılötesi tarama10 yoluyla protein-RNA kompleksini tespit etmek için floresan olarak etiketlenmiş adaptörlerin kullanımını ve ayrıca ortaya çıkan kütüphanelerin karmaşıklığını arttırdığı gösterilen çeşitli nükleik asit saflaştırma ve boyut seçim adımlarına optimizasyonları içerir12,45. Şu anda χCRAC protokolünü daha da hassaslaştırmak için bu iyileştirmelerden bazılarını uyguluyoruz. Burada sunulan protokol, verilerin karmaşıklığını artıran orijinal CRAC ve χCRAC protokollerinde bir dizi iyileştirme içermektedir. Örneğin, daha önce, SDS-PAGE jelleri üzerindeki çapraz bağlı, radyoaktif protein-RNA komplekslerini çözdükten sonra, bir nitroselüloz membranına aktarıldı ve çapraz bağlı RNA lekeden izole edildi. Bununla birlikte, RNP'nin transferi ve ardından RNA ekstraksiyonu, özellikle RNA polimeraz alt birimleri gibi büyük RBP'lerle uğraşırken çok verimsiz olabilir. Bu, çapraz bağlı RNA'nın geri kazanımında önemli bir azalmaya neden olabilir. Mevcut protokolde, çapraz bağlı RNA, Şekil 1'de gösterildiği gibi doğrudan SDS-PAGE jel dilimlerinden ekstrakte edilir. Bu, çapraz bağlı RNA'ların geri kazanımını arttırdı. Ek olarak, cDNA'ların PCR amplifikasyonundan sonra, ürün başlangıçta% 3, düşük erime sıcaklıklı agaroz jelleri üzerinde çözüldü ve daha sonra jelden 175-300 bp PCR ürünleri ekstrakte edildi. Bununla birlikte, bu jeller kolayca aşırı yüklenebilir ve bu da DNA'nın çok zayıf bir şekilde ayrılmasına neden olur. Agaroz jellerinin prekast TBE jellerle değiştirilmesi, daha tutarlı boyut ayrımı ve PCR ürünlerinin daha iyi geri kazanılması ile sonuçlandı.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated from:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Synthetic and Systems Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.
to:
Stuart W. McKellar1 
Ivayla Ivanova1 
Robert W. van Nues2 
Ross A. Cordiner3 
Mehak Chauhan1 
Niki&#160;Christopoulou1 
Will Worboys4 
Andrew Langford4 
Torben Heick Jensen3 
Sander Granneman1 
1Centre for Engineering Biology, University of Edinburgh 
2Institute of Cell Biology, University of Edinburgh 
3Department of Molecular Biology and Genetics, Aarhus University, 4UVO3 Ltd.

An erratum was issued for:&#160;<a href="https://www.jove.com/t/61027">Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC</a>. The Authors section was updated.

Erratum: Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics in vivo at High Temporal Resolution using &#967;CRAC

RNA'lar genellikle işlevlerini yerine getirmek için RBP'lere güvenirler, bu da bu moleküller arasındaki dinamikleri anlamaya büyük ilgi duymuştur. Birçok RBP, çok çeşitli organizmalarda tanımlanmıştır. Bununla birlikte, RBP-RNA etkileşimlerini in vivo olarak incelemek her zaman zor olmuştur. Bu tür etkileşimlerin incelenmesinde büyük bir atılım, CLIP1'in ortaya çıkmasıyla geldi. Bu yöntem, RBP'ler ve doğrudan bağlı RNA'ları arasındaki kovalent bağları (yani, sıfır mesafeli çapraz bağlama) indüklemek için ultraviyole (UV, 254 nm) ışınlamasını kullanır. Daha sonra, ilgilenilen RBP, yalnızca proteinlere kovalent olarak çapraz bağlı RNA'ların tanımlanmasını sağlamak için sıkı koşullar altında immünosaflaştırılır. Bağlı RNA'lar daha sonra RNazlarla kısmen sindirilir ve daha sonra dizileme için cDNA kütüphanelerine dönüştürülür. Yüksek saflaştırma sıkılığı, çapraz bağlı ribonükleoprotein (RNP) kompleksinin SDS-PAGE saflaştırılmasıyla daha da geliştirilen protein ve RNA geri kazanımının özgüllüğünü büyük ölçüde arttırdığı için önemlidir. CLIP ve ilgili yöntemler ayrıca protein bağlanma bölgesine nükleotid çözünürlüğü anlayışı sağlar, çünkü dizileme kütüphanesinin hazırlanması sırasında, RNA'ya çapraz bağlanan amino asitler sıklıkla ters transkriptazı sonlandırır veya enzimin bu bölgede mutasyonlar oluşturmasına neden olur 1,2,3.
Tanıtılmasından bu yana, orijinal CLIP protokolü dikkate değer çeşitlilikte türev metodolojileri üretmiştir. Özellikle önemli bir atılım, yüksek verimli sıralamayı CLIP yaklaşım3 ile birleştiren HITS-CLIP'in (veya CLIP-seq) geliştirilmesiyle geldi. Bu, o zamandan beri tüm CLIP tabanlı metodolojiler tarafından benimsenmiştir. iCLIP, RBP bağlama bölgelerinin daha doğru haritalanmasını kolaylaştıran RNase aracılı kırpma ve adaptör ligasyon tekniklerinde iyileştirmeler getirmiştir4. PAR-CLIP, 4tiyo-idrar / urasil etiketlemeyi 365 nm'de çapraz bağlama ile birleştirerek, T-C ikamelerini analiz ederek çapraz bağlama bölgelerini haritalamayı mümkün kıldı5. CRAC, üre-iCLIP, dCLIP ve uvCLAP, afinite reçinesine arka plan bağlanmasını daha da azaltan ve protein yakalama 2,6,7,8,9'un özgüllüğünü daha da artıran denatüre etme koşulları ve çift afinite saflaştırma adımları getirmiştir. Ek olarak, CRAC, uvCLAP ve dCLIP, ilgilenilen RBP'yi bir afinite etiketi ile etiketlemeyi tanıttı, böylece spesifik antikorlar üretme ihtiyacının üstesinden geldi.
CLIP metodolojisini hızlandırmak için çeşitli optimizasyonlar da yapılmıştır. Orijinal CLIP protokolü, SDS-PAGE'den sonra RBP-RNA komplekslerini görselleştirmek için yakalanan RNA'ların radyoetiketlemesini kullandı. Bununla birlikte, radyoaktivite kullanımı, bu tür çalışmalar için kurulmamış laboratuvarlar için sorunlu olabilir. irCLIP, kızılötesi görüntüleme10 yoluyla görselleştirmeyi kolaylaştıran florofor kuplajlı bir adaptör içerir ve sCLIP, streptavidin konjuge HRP11 aracılığıyla görselleştirmek için yakalanan RNA'ların biyotinilasyonunu kullanır. Ayrıca, eCLIP RNA etiketlemesinden tamamen vazgeçer; bunun yerine, protein sadece bilinen büyüklüğüne göre eksize edilir12. Streptavidin bazlı saflaştırma, biyotinillenmiş bir 3' adaptörün RNA'lara bağlandığı ve ters transkripsiyon ve daireselleştirme13'ten sonra saflaştırmayı sağlamak için kullanıldığı FAST-iCLIP'de kütüphane hazırlama sürecini hızlandırmak için de kullanılmıştır. iCLIP protokolündeki ek geliştirmeler de kütüphanelerin karmaşıklığını büyük ölçüde artırdı4.
Son olarak, CLIP, RBP'lerin farklı hücresel alt bölmelerden 14,15'ten yakalanmasını sağlamak, fotoaktive edilebilir ribonükleozitlerindarbeli indüksiyonu kullanılarak yeni transkribe edilmiş RNA'ları görselleştirmek için 5,16,17, metillenmiş RNA'ları yakalamak için18,19,20, RNA-RNA etkileşimlerini incelemek21,22 ve 3' uçlarını haritalamak için modifiye edilmiştir 23,24.
RBP'ler ve RNA'lar arasındaki etkileşimleri anlamamıza yardımcı olan CLIP tabanlı tekniklerin büyük katkılarına rağmen, UV çapraz bağlamanın verimsizliği ile sınırlandırılmıştır. Tek katmanlı bir tabakada yetiştirilen kültür hücrelerinin çapraz bağlanması genellikle nispeten kolay olsa da, bu dokularda veya çözeltideki hücrelerde önemli ölçüde daha zordur. Dokular, gerekli hücre katmanlarına nüfuz etmek için birden fazla UV maruziyeti turu gerektirebilirken, mikrobiyal hücreler genellikle aromatik, UV emici bileşikler içeren zengin ortamlarda yetiştirilir25. Gerçekten de, bu tür örnekler için RBP'ler ve bağlı RNA'ları arasında yeterli çapraz bağlantı oluşturmak için 30 dakikaya kadar UV ışınlama süreleri kullanılmıştır26,27,28. Bu genişletilmiş UV maruziyeti, hücre içinde, bazı uygulamalarda nihai verileri kirletebilecek UV kaynaklı DNA hasarı gibi stres tepkilerini indükler.
CLIP çalışmalarının çoğu, bir hücredeki spesifik protein-RNA etkileşimlerinin tek bir "anlık görüntüsünü" üretmeye odaklanmıştır. Bununla birlikte, protein-RNA etkileşimleri, özellikle hücreler çevrelerinde değişikliklere maruz kaldıklarında doğal olarak dinamiktir. Bu, temel besin maddelerinin mevcudiyetinde ani bir azalma veya sıcaklıktaki hızlı değişiklikleri içerebilir. Bu nedenle, stres sırasında bir RBP'nin rolünü gerçekten anlamak için, zamana bağlı analizler yapmak en iyisidir, çünkü stres sırasında RBP hedeflerinin tüm spektrumunu yakalayabilir ve seçilen RBP'nin stres tepkisinin hangi aşamasında aktif olduğunu belirleyebilirler. Özellikle, mayadaki çalışmalar, adaptasyonun ilk birkaç dakikasının hayatta kalmak için kesinlikle çok önemli olduğunu ve bakterilerdeki RNA yarı ömrünün dakikalardan saniyelere kadar değişebileceğini göstermiştir 29,30,31,32,33. Bu nedenle, bu tür zaman çözümlü analizler ideal olarak yüksek zamansal çözünürlükte yapılmalıdır. Bununla birlikte, uzun çapraz bağlama süreleri, erken aşama adaptif yanıtların incelenmesini özellikle zorlaştırmaktadır.
Bu sorunların üstesinden gelmek için, yakın zamanda hücreleri dakikalarca süren zaman dilimlerinde çapraz bağlayabilen ve toplayabilen gelişmiş bir yöntem geliştirdik. χCRAC yöntemimiz, RBP-RNA etkileşimlerindeki dinamik değişikliklerin daha önce tanık olunmamış çözünürlükte nicel olarak ölçülmesini sağlar. Bu yöntem için çok önemli olan, çözeltideki maya ve bakterilerde gerekli çapraz bağlanma süresini yaklaşık 10 kat azaltan ve RBP-RNA etkileşimlerini anında etkili bir şekilde donduran yeni bir UV ışınlama cihazı32'nin geliştirilmesiydi. Ek olarak, UV ışınlamasından sonra hücreleri hızlı bir şekilde toplamak için, yaklaşık 30 s32'de 0.5 L'lik bir kültürde katlanarak büyüyen mayayı hasat edebilen bir vakum filtrasyon cihazı geliştirdik. Bu teknolojik yenilikler, RBP-RNA dinamiklerinin dakika ölçeğinde çözünürlükte incelenmesine izin verir. Ek olarak, pratikliğini artırmak için orijinal CRAC protokolü2'ye çeşitli optimizasyonlar da getirdik.
χCRAC kullanarak, yakın zamanda glikoz yoksunluğuna yanıt olarak bir maya nükleer RBP'si olan Nab3'ün hedefini inceledik. Saccharomyces cerevisiae'de Nab3, NNS kompleksini oluşturmak için Nrd1, bir RBP ve RNA helikaz Sen1 ile bir kompleks oluşturabilir. RNA polimerazına ve yeni ortaya çıkan transkripte NNS'nin bağlanması, transkripsiyonel sonlandırmayı tetikleyebilir34. Bu kompleks çoğunlukla şifreli kodlamayan RNA transkriptlerinin çıkarılmasında rol oynar, ancak protein kodlayan genlerin ekspresyonunu düzenlediği de gösterilmiştir. Çalışma, Nab3'ün sadece bir dakikalık stresten sonra kodlamayan ve kodlamayan transkriptlere diferansiyel hedeflemesini gösterdi32. Nab3 ile ko-transkripsiyonel sonlandırmanın, retrotranspozon genlerinin çok geçici, nabız benzeri bir ekspresyonu ile sonuçlandığını ve geleneksel CLIP tabanlı yaklaşımlar kullanılarak tespit edilmesinin zor olacağını gösterdik. Ek olarak, UV çapraz bağlayıcımızdaki kısa UV ışınlama süreleri, kısa ömürlü kodlamayan RNA'ların geri kazanımını da önemli ölçüde artırdı32. χCRAC muhtemelen RBP'lerin strese verilen tepkiyi anlık zaman ölçeklerinde nasıl şekillendirdiğini değil, aynı zamanda bir yanıtın tüm yaşam döngüsü boyunca değişen rollerini de aydınlatmada çok önemli bir araç olacaktır. Bu makale, χCRAC protokolündeki tüm adımlara ayrıntılı bir genel bakış sunmaktadır. Açıklayıcı amaçlar için, yöntem, transkripsiyonel sonlandırma ve RNA bozunumunda35,36 ile ilgili olan maya Nrd1 proteinini ve çok sayıda zaman noktasında glikoz yoksunluğuna yanıt olarak RNA hedefomunu incelemek için kullanıldı. Son olarak, UV ışınlama ünitemizin RBP'leri HeLa hücrelerinde RNA'ya hızlı bir şekilde çapraz bağlayabildiğini ve yapışkan hücrelerde yüksek çözünürlüklü zaman çözümlü analizler yapmayı mümkün kıldığını da gösteriyoruz.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:876px;" width="876">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1,4-dithioreitol</td>
			<td style="width:85px;">Merck</td>
			<td style="width:101px;">10708984001</td>
			<td style="width:495px;">Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 120.086</td>
			<td>General reaction tube</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">2 mL tubes</td>
			<td style="width:85px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:101px;">0030 123.344</td>
			<td>For holding columns and collection of waste</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">32P-yATP</td>
			<td style="width:85px;">Perkin Elmer</td>
			<td style="width:101px;">NEG502Z-250</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4-12% Bis-Tris gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">NP0321BOX</td>
			<td>SDS-PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">4X loading buffer</td>
			<td style="width:85px;">Novex</td>
			<td style="width:101px;">NP0008</td>
			<td>Protein loading dye concentrate</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">50 bp ladder</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">N3236</td>
			<td>Reference ladder for excising region of interest from the amplified cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">50% PEG</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">B100045</td>
			<td>For the L5 linker ligation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">6% TBE gel</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>EC6265BOX</td>
			<td>For separation and purification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Acetone</td>
			<td style="width:85px;">ACROS Organics</td>
			<td style="width:101px;">423245000</td>
			<td>Washing of TCA-precipitated proteins</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">anti-FLAG beads</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M8823-1ML</td>
			<td>For purifcation of FLAG-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">ATP (100 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">R0441</td>
			<td>For ligation of the L5 linker onto the 5&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Beta-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">M3148-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Biomax MS intensifying screen</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">Z363162-1EA</td>
			<td>For intensifying the autoradiogram signal</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Chloroform</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">1010219</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">11873580001</td>
			<td>For inhibition of cellular proteases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Complete supplement mixture -TRP</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">DCS0149</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Costar Spin-X 0.22 &#181;m filters</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">CLS8160</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">DNase RQ1</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M6101</td>
			<td>For DNA digest following cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">dNTPs (10 mM)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">4638956001</td>
			<td>For reverse transcription and PCR</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Ethanol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10041814</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Ethylenediaminetetraacetic acid</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM9261</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Exonuclease I</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0293</td>
			<td>For degradation of primers following PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glass microfiber filters</td>
			<td style="width:85px;">Whatman</td>
			<td style="width:101px;">1823-010</td>
			<td>For isolating the excised cDNAs following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glucose</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">GLU03</td>
			<td>For preparation of glucose-containing, synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Glycogen (20 mg/mL)</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">10901393001</td>
			<td>Precipitation of proteins, RNA and DNA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">GST-TEV</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>Construct and purification protocol is available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Guanidium hydrochloroide</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">10071503</td>
			<td>Required for pulldown denaturing conditions and washing buffer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">IgG beads</td>
			<td style="width:85px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:101px;">17-0969-01</td>
			<td>For purification of protein A-tagged RBPs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Imidazole</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I2399-100G</td>
			<td>For elution of captured proteins from Nickel beads</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">A393-500</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Luna Universal One-Step RT-qPCR</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">E3005S</td>
			<td>For qPCR of the cDNA in order to calculate required number of PCR cycles</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Magnesium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Fluka Analytical</td>
			<td style="width:101px;">63020-1L</td>
			<td>For PNK buffer</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:195px;">Membrane filters</td>
			<td style="width:85px;">Millipore</td>
			<td style="width:101px;">AAWP09000 for yeast or HAWP09000 for bacteria</td>
			<td>For vacuum filtration of cells</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Micro bio-spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Biorad</td>
			<td style="width:101px;">732-6204</td>
			<td>For collecting eluate after gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Ni-NTA beads</td>
			<td style="width:85px;">Qiagen</td>
			<td style="width:101px;">30210</td>
			<td>For secondary protein capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">NP-40</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">I8896-100ML</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Pfu polymerase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M7741</td>
			<td>For amplification of the cDNA library</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Phenol</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">P4682-400ML</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Pierce spin columns</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">69725</td>
			<td>For on-column enzymatic reactions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Protease K</td>
			<td style="width:85px;">Roche</td>
			<td style="width:101px;">3115887001</td>
			<td>For degradation of the RBP following gel extraction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Quartz Petri dish</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>For cross-linking of adherent cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 400 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Radiography films</td>
			<td style="width:85px;">Amersham</td>
			<td style="width:101px;">28906843</td>
			<td>For autoradiography visualisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNAClean XP beads</td>
			<td style="width:85px;">Beckmann</td>
			<td style="width:101px;">A63987</td>
			<td>SPRI beads for clean up of RNAs and cDNAs</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">RNase H</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0297</td>
			<td>For degradation of RNAs following reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">RNase-It</td>
			<td style="width:85px;">Agilent</td>
			<td style="width:101px;">400720</td>
			<td>For RNA digestion</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">rRNasin</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">N2511</td>
			<td>For inhibition of any contaminating RNases during enzymatic reaction</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium acetate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">S2889-1KG</td>
			<td>For phenol-chloroform extraction following RNA purification and DNA precipitation</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">7647-14-5</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium deoxycholate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">D6750-100G</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Sodium dodecylsulfate</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">L3771-1KG</td>
			<td>For protease K buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">SUPERase-In</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">AM2694</td>
			<td>For inhibition of cellular RNases after lysis</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">SuperScript IV</td>
			<td style="width:85px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:101px;">18090010</td>
			<td>For reverse transcription</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0201</td>
			<td>For radiolabelling the 5&#39; end of the RNA</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:195px;">T4 RNA ligase 1</td>
			<td style="width:85px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:101px;">M0204</td>
			<td>For ligation of the L5 adaptor onto the RNA 5&#39; end</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">T4 RNase ligase 2, truncated K222Q</td>
			<td style="width:85px;">NEB</td>
			<td style="width:101px;">M0351S</td>
			<td>For ligation of the App_PE linker onto the 3&#39; end of captured RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TBE buffer (10X)</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td>15581-028</td>
			<td>For running TBE gels</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">TEV protease</td>
			<td style="width:85px;">Homemade</td>
			<td style="width:101px;"></td>
			<td>For eluting captured proteins following FLAG capture</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Thermosensitive alkaline phosphatase</td>
			<td style="width:85px;">Promega</td>
			<td style="width:101px;">M9910</td>
			<td>For 5&#39; and 3&#39; dephosphorylation of RNAs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Trichloroacetic acid (100%)</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T0699-100ML</td>
			<td>For precipitation of RBP-RNA complexes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:85px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:101px;">15504-020</td>
			<td>Buffer component</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:195px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:85px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:101px;">T8787-100ML</td>
			<td>Buffer component in mammalian cell lysis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari Filter</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Device for vacuum harvesting cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 100 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Vari-X-Linker</td>
			<td style="width:85px;">UVO3</td>
			<td style="width:101px;">N/A</td>
			<td>Cross-linker for cross-linking cells. Available from https://www.vari-x-link.com for 16,000 GBP</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Yeast nitrogen base</td>
			<td style="width:85px;">Formedium</td>
			<td style="width:101px;">CYN0410</td>
			<td>For preparation of synthetic defined medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:195px;">Zirconia beads</td>
			<td style="width:85px;">Thistle</td>
			<td>11079105Z for yeast or 11079101Z for bacteria</td>
			<td>For cell lysis via bead beating</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

monitoring protein-rna interaction dynamics in vivo at high temporal resolution using &#967;crac

RNA bağlayıcı proteinler (RBP'ler) ve RNA substratları arasındaki etkileşim, akışkanlık ve karmaşıklık gösterir. Yaşam süresi boyunca, tek bir RNA, üretimini, kararlılığını, aktivitesini ve bozulmasını düzenleyecek birçok farklı RBP tarafından bağlanabilir. Bu nedenle, bu iki molekül türü arasında var olan dinamikleri anlamak için çok şey yapılmıştır. Özellikle önemli bir atılım, 'cross-l mürekkepleme ve immunoprecipitation' (CLIP) ortaya çıkmasıyla geldi. Bu teknik, hangi RNA'ların belirli bir RBP tarafından bağlandığına dair sıkı bir araştırmaya izin verdi. Kısacası, ilgilenilen protein, RNA substratlarına in vivo olarak çapraz bağlanmış, oldukça katı koşullar altında saflaştırılmış UV'dir ve daha sonra proteine kovalent olarak çapraz bağlanmış RNA'lar cDNA kütüphanelerine dönüştürülür ve sıralanır. Kuruluşundan bu yana, CLIP'yi belirli çalışma alanlarına uygun hale getirmek için birçok türev teknik geliştirilmiştir. Bununla birlikte, ultraviyole ışık kullanarak çapraz bağlama, bilinen bir şekilde verimsizdir. Bu, RBP-RNA etkileşimlerinin zamansal çalışmasını imkansız kılan uzun maruz kalma süreleri ile sonuçlanır. Bu sorunun üstesinden gelmek için, yakın zamanda çok daha gelişmiş UV ışınlama ve hücre toplama cihazları tasarladık ve ürettik. Bu yeni araçları kullanarak, canlı hücrelerdeki RBP-RNA etkileşimlerinin yüksek zamansal çözünürlükte zamana bağlı analizleri için bir protokol geliştirdik: Kinetik CRoss bağlantısı ve cDNA'larının (χCRAC) birnalizi. Son zamanlarda bu tekniği, maya RBP'lerinin besin stresi adaptasyonundaki rolünü incelemek için kullandık. Bu makalede χCRAC yöntemine ayrıntılı bir genel bakış sunulmakta ve Nrd1 RBP ile elde edilen son sonuçlar sunulmaktadır.

χCRAC yönteminin etkinliğini göstermek için, HTP etiketli bir Nrd1 proteinini eksprese eden maya suşları ile bir zaman kursu deneyi yapıldı. Yöntemin nasıl çalıştığını açıklayan ayrıntılı bir şematik gösterim Şekil 1'de verilmiştir. Nab3 gibi, Nrd1 de çeşitli RNA transkriptlerinin nükleer RNA bozunumunda rol oynar37. Corden laboratuvarından yapılan önceki çalışmalar, RNA hedeflerine Nrd1 bağlanmasının, hücreler glikoz açlığına maruz kaldığında önemli ölçüde değiştiğini öne sürdü28,38. Bu nedenle, glikoz içeren ortamda (SD-TRP) katlanarak büyüyen hücreler, Nrd1-RNA etkileşimlerindeki dinamik değişiklikleri izlemek için bir zaman boyunca glikoz (S-TRP) olmadan aynı ortama kaydırıldı. Numuneler vardiyadan önce Vari-X-bağlayıcı odasında (Şekil 3A) alındı ve çapraz bağlandı ve daha sonra 1, 2, 4, 8, 14 ve 20 dakika sonra bağlandı. Hücre büyümesi için kullanılan ortam, bu aromatik amino asit tarafından UV emilimini azaltmak için triptofanda kasıtlı olarak eksikti. Filtreyle sterilize edilmiş sentetik ortamın kullanılmasının en iyisi olduğunu unutmayın, çünkü ortamın otoklavlanması şekerlerin karamelizasyonuna yol açabilir. Bu daha sonra çapraz bağlama verimliliğini azaltır.
Şekil 4A , χCRAC deneyinden temsili bir otoradyografi göstermektedir. Bu örnekte, örneklerin birlikte havuza alınmadığını unutmayın. Bunun yerine, her biri jel üzerinde ayrı ayrı çalıştırıldı. Bu, proteinin test edilen tüm zaman noktalarında RNA'ya etkili bir şekilde çapraz bağlandığını göstermek için ilk deneysel testler için önerilir. RBP'nin beklenen moleküler ağırlığında, dizileme için uygun olmayan çok kısa, radyoaktif işaretli RNA'lara bağlı proteini temsil eden özellikle yoğun bir sinyal gözlendi. Bu nedenle, daha uzun RNA fragmanlarına çapraz bağlanmış protein olan bu bandın üzerindeki yayma sinyali izole edildi. Parça, protein bandının hemen üstünden artı yaklaşık 30 kDa'dan kesildi. Şekil 4B , eksizyonu takiben bir otoradyogramı göstermektedir, protein jelde kalan kısa RNA'lara çapraz bağlanmıştır ve daha önce yayılmış olan sinyal şimdi eksize edilmiştir.
Ters transkripsiyondan sonra, cDNA kütüphanesi PCR kullanılarak güçlendirilmelidir. Bununla birlikte, kütüphanenin aşırı amplifikasyonundan kaçınılmalıdır, çünkü bu, polimeraz tarafından tercihen çoğaltılan dizilere karşı önyargı oluşturabilir ve PCR artefaktları üretebilir. Aşırı güçlendirilmiş kütüphaneler ayrıca sıralayıcıda okunan çok sayıda yinelenen dizi içerir. Son kütüphanenin amplifikasyonu için ideal PCR döngüsü sayısını hesaplamak için, cDNA'nın bir alikotu P5 ve BC oligonükleotidleri kullanılarak qPCR yoluyla büyütüldü. Kütüphanenin en yüksek floresana ulaştığı ilk döngü PCR döngü sayısı olarak seçildi. Şekil 4C , tipik bir cDNA kütüphanesinden 16'lık bir tepe döngüsü sayısı veren bir qPCR örneği vermektedir. Bu değer daha sonra son χCRAC PCR için kullanıldı. Sıralanan verileri işlemek için, daha önce laboratuvarımızda geliştirilen yazılımı (pyCRAC) ve kinetik CRAC verilerinin analizi için ilgili boru hattını kullandık (Nues ve ark., 2017; https://git.ecdf.ed.ac.uk/sgrannem/pycrac, https://bitbucket.org/sgrann/kinetic_crac_pipeline/src/default/). Bu açık kaynaklı yazılım araçları, verilerin çoğullanmasının çözülmesini ve kırpılmasını, PCR kopyalarının kaldırılmasını, istatistiksel olarak anlamlı tepe noktalarının tanımlanmasını, kümenin bitişik dizilere okunmasını ve bağlanma motiflerinin tanımlanmasını sağlar39. Bu araçların nasıl çalıştığına dair daha fazla ayrıntı ilgili web sayfalarında bulunabilir.
Ayrıca memeli hücreleri için bir χCRAC protokolü geliştirmeye başladık. Memeli hücre hatlarının çoğunluğu tek katmanlı olarak yetiştirilir ve UV geçirgen torba ile çapraz bağlayıcımızdaki tepsi, yapışkan hücrelerle yapılan deneyler için uygun değildir. Bu sorunun üstesinden gelmek için, kullanıcıların 1-2 Petri kabını (150 mm çapında ve 25 mm derinliğinde) yapışkan hücrelerle UV ışınlayabilecekleri bir aşama geliştirdik (Şekil 3B). İlk test olarak, memeli hücreleri için çapraz bağlayıcının etkinliği, anti-GFP antikorları ve geleneksel bir CLIP tabanlı saflaştırma kullanılarak çapraz bağlanma ve kararlı şekilde etiketlenmiş GFP-RBM7'nin yakalanması yoluyla ölçülmüştür. Şekil 5A'da gösterildiği gibi, çapraz bağlayıcı, yaygın olarak kullanılan bir UV ışınlama cihazıyla karşılaştırılabilir verimliliklerde 254 nm UV ışınlaması kullanarak tek katmanlı olarak yetiştirilen memeli hücrelerinden protein-RNA komplekslerini geri kazanabildi. Bununla birlikte, normalde UV çapraz bağlama deneyleri için kullanılan standart hücre kültürü plastik eşyaları 254 nm UV'ye kadar geçilemez. Bu nedenle, çapraz bağlayıcımızda hücreler sadece UV lambalarının üst bankasından ışınlama alacaktır. Bunun üstesinden gelmek için, hücre büyümesi ve çapraz bağlanma için UV geçirgen bir kuvars Petri kabı geliştirdik. Kuvars kültür kaplarının kullanımı, 2 s kadar az UV ışınlaması ile protein-RNA komplekslerinin sağlam bir şekilde geri kazanıldığını göstermiştir (Şekil 5B). CLIP teknolojileri gibi memeli hücreleri için RBP yakalama yöntemleriyle birleştirildiğinde, bu kısa çapraz bağlama süreleri, genotoksik streslere veya protein faktörlerinin hızlı tükenmesine yanıt olarak veya transkripsiyonel veya hücre döngüsü senkronizasyonuna paralel olarak RBP'lerin mekansal zamansal RNA bağlanma profillerini geri kazanmak için zaman dilimleriyle uyumludur.
Şekil 6'da , χCRAC işlem hattı tarafından işlenen Nrd1 verilerinin birkaç örneği gösterilmektedir. Bu şekil, işlem hattı tarafından oluşturulan yatak grafiği dosyaları ve verilerin yayın kalitesinde genom tarayıcı görüntülerini oluşturmayı basitleştirmek için tasarladığımız python GenomeBrowser paketi (https://pypi.org/project/GenomeBrowser/1.6.3/) kullanılarak hazırlanmıştır. Gri dikdörtgenler, şifreli kararsız transkript (CUT'lar), kararlı karakterize edilmemiş transkriptler (SUT'ler)40 ve Xrn1'e duyarlı kararsız transkriptler (XUT'lar)41 gibi kodlamayan RNA'ları ifade eden genomik bölgeleri temsil eder. Şekil 6'daki veriler, Nrd1'in bu kodlamayan RNA transkriptlerinin çoğuna bağlandığını ve bu proteinin bu transkript sınıfının42 sınıfının bozulmasında rol oynadığı fikriyle tutarlı olduğunu göstermektedir. Şekil 6A , kromozom IV üzerinde ~ 15 kb'lik bir bölgeyi göstermektedir. Burada, Nrd1'in, her ikisi de glikoz açlığı sırasında yukarı regüle edilen yüksek afiniteli glikoz taşıyıcıları HXT6 ve HXT7'yi kodlayan transkriptlere bağlanmasında önemli bir artış olmuştur. NNS kompleksi tarafından transkripsiyon sonlanmasının, glikoz açlığı sırasında bu genlerin indüksiyon kinetiğini etkilemesi muhtemeldir. Şekil 6B , Nab343 tarafından düzenlendiği bilinen Imd3 transkriptine Nrd1 çapraz bağlama örneğini göstermektedir. Bu durumda, veriler glikoz açlığına bağlanmada önemli bir azalma olduğunu göstermiştir. Önceki çalışmalar, glukoz açlığı44 sırasında Nab3'ün Tye7 transkriptine bağlanmasının azaldığını göstermiştir. Bu gözlemle tutarlı olarak, χCRAC verileri, glikoz açlığı sırasında Nrd1'in bağlanmasının azaldığını ve Nrd1'in Tye7'ye çapraz bağlanmasının 8 dakikalık stresten sonra en düşük seviyede olduğunu göstermektedir (Şekil 4C). Bununla birlikte, bu etkinin sadece geçici olduğu görülmektedir, çünkü 14 dakikalık glikoz açlığından sonra, Nrd1 bağlanması başlangıç seviyelerine geri dönmüştür.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2.jpg"> Şekil 1: χCRAC protokolünün şematik gösterimi. Etiketli suşlar istenen yoğunluğa kadar yetiştirildi. RBP, RNA bağlayıcı proteini gösterir. Daha sonra bir referans numune alındı ve 254 nm UV ışığı ile çapraz bağlandı. Kalan hücreler filtrasyon yoluyla toplandı ve daha sonra hızla strese neden olan ortama kaydırıldı. Burada açıklanan χCRAC deneyi için, örnekler alındı ve vardiyadan 1, 2, 4, 8, 14 ve 20 dakika sonra çapraz bağlandı (1). İlgilenilen RBP daha sonra son derece katı iki adımlı bir afinite saflaştırması kullanılarak saflaştırıldı (2). Daha sonra, yakalanan çapraz bağlı RNA'lar kısmen RNazlarla sindirildi, 5' ucunda radyo-etiketli ve adaptörler üzerlerine bağlandı (3). 5' adaptörler benzersiz "okunan" barkod dizileri içeriyordu, böylece tek tek numuneler sıralamadan sonra biyoinformatik olarak ayrılabiliyordu. RBP-RNA kompleksleri daha sonra salınım, havuzlanmış ve birlikte çökeltilmiş (4), SDS-PAGE ile çözülmüş ve otoradyografi ile görselleştirilmiştir (5). Daha sonra, otoradyografi görüntüsünde kesikli kırmızı kutu ile gösterilen, ana bandın hemen üzerindeki radyoaktif sinyali içeren tek bir jel dilimi jelden kesildi (5). Jel dilimleri proteaz K ile muamele edildi ve RNA daha sonra ekstrakte edildi (6), cDNA'lara dönüştürüldü ve PCR (7) ile güçlendirildi. PCR adımı, birçok kütüphanenin tek bir şeride çoğaltılabilmesi için ek barkodlar (P7 oligo tarafından tanıtılan sarı blok) getirdi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig1v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2.jpg"> Şekil 2: Çapraz bağlama ve vakum filtreleme. (A) Çapraz bağlayıcı. Hücre süspansiyonu, makinenin sağ üst köşesinde bulunan bir huniye dökülür (yakın çekim için ayrıca Şekil 3A'ya bakınız) ve orta tepside bulunan UV şeffaf bir torbada tutulur. Bu torba, kullanıcı makineye ışınlama adımını başlatması talimatını verene kadar kapalı kalan iki panjurla çevrilidir. Hücreler hem yukarıdaki hem de aşağıdaki tepsilerden UV ışığı ile ışınlanır. Makine 254 ve 365 nm UV lambalarla birlikte gelir, ikincisi PAR-CLIP deneyleri için geçerlidir. Makine, sağ üstte bulunan ve UV dozajını veya maruz kalma süresini kontrol etmeyi sağlayan dokunmatik bir panelden çalıştırılır. (B) Çapraz bağlamayı takiben, hücreler makinenin sol tarafından boşaltılır. Hücre süspansiyonları vakum yoluyla geri kazanılır ve daha sonra hasat için bir vakum filtreleme cihazına dökülebilecekleri bir cam şişeye boşaltılır. (C) Vakum filtrasyon cihazları. Bunlar bir klips aracılığıyla açılıp kapatılır ve arasına bir filtre yerleştirilir. Filtrelerin değiştirilmesi sonucu hiç zaman kaybetmemek için çok kısa süreli seriler için dört filtreleme cihazı paralel olarak kullanılmıştır. (D) Filtrelemeyi takiben, ortam süpernatantı daha sonra imha edilmek üzere şişelere boşaltıldı. Filtre çıkarıldığında sistemdeki vakumu korumak için vakum filtrasyon cihazlarının altına vanalar monte edilmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig2v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2.jpg"> Şekil 3: Çapraz bağlama askıya alınmış ve yapışkan hücreler. (A) Süspansiyon hücreleri için Vari-X-bağlayıcı hazneli çapraz bağlayıcı. Hücre kültürü, tepsinin sağ üst köşesinde bulunan numune girişine (huni) dökülür. (B) Yapışkan hücreleri veya küçük hacimli süspansiyon hücrelerini çapraz bağlamak için plastik veya kuvars Petri kaplarını tutabilen tepsi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig3v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2.jpg"> Şekil 4: Kütüphane hazırlığı. (A) Nrd1-HTP χCRAC deneyinden bir otoradyogram örneği. Güçlü, konsantre sinyal, çok kısa RNA'lara çapraz bağlanmış proteini temsil ederken, yukarıdaki yayma, dizileme için yeterli uzunluktaki RNA'lara çapraz bağlanmış proteini temsil eder. (B) Yayma, jel eksizyonundan sonra alınan bir otoradyogramda gösterildiği gibi eksize edildi. (C) χCRAC cDNA kütüphanesinden temsili bir qPCR. Bu örnekte, cDNA'nın maksimum amplifikasyonuna 16 döngüde ulaşılmıştır. Böylece, son amplifikasyon için 16 döngü kullanıldı. Hata çubuğu, üç teknik qPCR çoğaltmasının standart sapmasını temsil eder. (D) %6 TBE jeli üzerindeki bir cDNA kütüphanesinden fosfor görüntüsü örneği. (E) Çip bazlı kılcal elektroforezden cDNA uzunluğu ve kalite analizi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig4v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2.jpg"> Şekil 5: Memeli hücrelerinde çapraz bağlanmayı test etmek için yüksek RNaz testi iCLIP deneyi. GFP-RBM7 iCLIP deneylerinden elde edilen otoradyogramlar, çeşitli çapraz bağlama enerjilerinde RNP geri kazanımının verimliliğini test etmiştir. İmmünopresipitasyonlar, GFP-RBM7'yi kararlı bir şekilde eksprese eden çapraz bağlı hücreler üzerindeki manyetik boncuklara bağlı anti-GFP antikorları kullanılarak gerçekleştirildi. İmmünoçökeltiler, ilişkili RNA'ları kısa, düzgün uzunluklara kırpmak için yüksek konsantrasyonlarda RNaz I ile inkübe edildi. RNP'ler 32P etiketleme ve SDS-PAGE ile görselleştirildi ve çapraz bağlı olmayan proteinin göçüne yakın, tanımlanmış bir bant olarak göç etti. Niceliklendirme, anti-GFP batı leke sinyaline normalleştirilmiş radyoaktif işaretli RBM7-RNA sinyalinin densitometrik analizlerinin sonuçlarını gösterir. (A) Yaygın olarak kullanılan UVP çapraz bağlayıcısının çapraz bağlayıcı ile çapraz bağlayıcı zaman seyri (Vari-X-bağlayıcı; VxL). (B) Kuvars (solda) ve plastik (sağda) kültür gereçleri üzerindeki çapraz bağlayıcımızın çapraz bağlama zaman seyri. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig5v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2.jpg"> Şekil 6: χCRAC'ın Nrd1'in hedeflerine diferansiyel, zamansal bağlanmasını gösterme gücünü gösteren örnek genom tarayıcı grafikleri. Her kutu ayrı genomik bölgeler için grafikler gösterir. Oklar, genlerin hangi iplikçikte kodlandığını gösterir (sola işaret eden ok = eksi iplikçik; sağa işaret eden ok = artı iplikçik). Zaman noktaları (dk), her bir alt grafiğin y eksenlerinde t0, t1, t2 vb. İle gösterilir. Kromozomları ve koordinatları gösteren Romen rakamları gösterilir. (A) Glikoz yoksunluğu üzerine, Nrd1, her ikisi de bu durumda yukarı regüle edilen iki yüksek afiniteli glikoz taşıyıcısını, HXT6 ve HXT7'yi bağlar. (B) Nrd1'in, Nab344'ün zaten doğrulanmış bir hedefi olan Imd3'e bağlandığı ve glikoz açlığını takiben yoğunluğun azaldığı gözlenmiştir. (C) Tye7'nin Nrd1 bağlanması dinamik ve geçici bir nitelik sergiler, glikoz açlığından sonra 8 dakikalık stresten sonra minimuma iner. Bununla birlikte, bağlanma daha sonra 14 dakika sonra bazal seviyelere geri döner. Okumalar "milyonda okuma" (RPM; y ekseni) olarak normalleştirildi. Gri kutular, kodlamayan RNA'ları kodlayan bölgeleri gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61027/61027fig6v2large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using Ãâ€¡CRAC at JoVE.com

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using ÃƒÂÃ¢â‚¬Â¡CRAC

cDNA'nın kinetik çapraz bağlanması ve analizi, canlı hücrelerdeki protein-RNA etkileşimlerinin dinamiklerinin yüksek zamansal çözünürlükte araştırılmasını sağlayan bir yöntemdir. Burada protokol, maya hücrelerinin büyümesi, UV çapraz bağlama, hasat, protein saflaştırma ve yeni nesil dizileme kütüphanesi hazırlama adımları dahil olmak üzere ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

χCRAC Kullanarak Yüksek Zamansal Çözünürlükte Protein-RNA Etkileşim Dinamiğinin İn Vivo İzlenmesi

The interaction between RNA-binding proteins (RBPs) and their RNA substrates exhibits fluidity and complexity. Within its lifespan, a single RNA can be ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Monitoring Protein-RNA Interaction Dynamics In Vivo at High Temporal Resolution Using &#967;CRAC

High-resolution Single Particle Analysis from Electron Cryo-microscopy Images Using SPHIRE

SPHIRE Kullanılarak Elektron Kriyo-mikroskopi Görüntülerinden Yüksek Çözünürlüklü Tek Parçacık Analizi

SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy) is a novel open-source, user-friendly software suite for the semi-automated processing of single ...

Using In Vitro Fluorescence Resonance Energy Transfer to Study the Dynamics Of Protein Complexes at a Millisecond Time Scale

Protein kompleksleri milisaniyelik zaman ölçekte dinamikleri çalışmaya vitro Floresans rezonans enerji transferi içinde kullanma

Proteins are the primary operators of biological systems, and they usually interact with other macro- or small molecules to carry out their biological ...

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

In Vivo Kalsiyum Görüntüleme C. elegans Vücut Duvar Kasları

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Proteome-wide Quantification of Labeling Homogeneity at the Single Molecule Level

Proteom çapında Quantification maddelerinin homojenliği tek molekül düzeyinde etiketlenmesi

Cell proteomes are often characterized using electrophoresis assays, where all species of proteins in the cells are non-specifically labeled with a ...

Examining the Dynamics of Cellular Adhesion and Spreading of Epithelial Cells on Fibronectin During Oxidative Stress

Oksidatif Stres Sırasında Fibronektin Üzerine Hücresel Adezyon Dinamiğinin İncelenmesi ve Epitel Hücrelerinin Yayılması

The adhesion and spreading of cells onto the extracellular matrix (ECM) are essential cellular processes during organismal development and for the ...

Quantification of Protein Interaction Network Dynamics using Multiplexed Co-Immunoprecipitation

Multipleksed Co-İmmünopreyağış Kullanarak Protein Etkileşim Ağı Dinamiğinin Ölçülmesi

Dynamic protein-protein interactions control cellular behavior, from motility to DNA replication to signal transduction. However, monitoring dynamic ...

Dual-Color Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy to Study Protein-Protein Interaction and Protein Dynamics in Live Cells

Canlı Hücrelerde Protein-Protein Etkileşimi ve Protein Dinamiklerini incelemek için Çift Renkli Floresan Çapraz Korelasyon Spektroskopisi

We present a protocol and workflow to perform live cell dual-color fluorescence cross-correlation spectroscopy (FCCS) combined with F&#246;rster Resonance ...

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Monitoring Protein Aggregation Kinetics In Vivo using Automated Inclusion Counting in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans'ta Otomatik Inklüzyon Sayımı Kullanarak Protein Agregasyon Kinetiğinin In Vivo'da İzlenmesi

Protein aggregation into insoluble inclusions is a hallmark of a variety of human diseases, many of which are age-related. The nematode Caenorhabditis ...