Menselijk macrofaagbiologieonderzoek is beperkt omdat het afhankelijk is van het verzamelen van cellen van donoren. Dit protocol toont een methode waarbij we menselijke macrofagen kunnen produceren uit pluripotente stamcellen in het laboratorium. Dit is een robuust protocol dat kan worden opgeschaald om macrofagen in grote hoeveelheden te produceren voor celtherapieën of onderzoek.
Pluripotente stamcellen kunnen genetisch gemanipuleerd worden. In dit protocol kunnen we macrofagen genereren met een specifiek fenotype, fluorescerende tags en ook macrofagen om ziektetoestanden te modelleren. Visuele demonstratie van dit protocol is nuttig omdat het gebruik van de easy passage tool niet bekend zal zijn bij veel onderzoekers.
Ook het niveau van zorg die nodig is bij het aanvullen van media en het oogsten van cellen is moeilijk onder woorden te brengen. Wanneer de gekweekte cellen 80% samenvloeiing hebben bereikt, vervang het gebruikte cultuurmedium door 1,5 milliliter vers medium. Houd het kweekvat in één hand, rol een wegwerpcel die over de plaat in één richting gaat.
Alle messen in de rol moeten de plaat raken. Houd gelijkmatige druk tijdens het rollen. Herhaal het rollen in dezelfde richting totdat de hele put is bedekt.
Draai het kweekvat 90 graden en herhaal het rollen. Met een steriele pipet, gebruik media in de put te verjagen gesneden kolonies. Copirate CELLstart en vervang media.
Breng cellen over op een verhouding van één tot vier op voorgecoate putten die zijn bereid zoals beschreven in het manuscript. Om te beginnen met de differentiatie proces op dag nul, voeg 2,25 milliliter van fase een media in twee putten van een ultra lage bevestiging zes-put plaat. Dan voor een 80% confluent goed van iPSCs in een zes-put plaat, vervang het onderhoud media met 1,5 milliliter van fase een media.
Snijd kolonies met behulp van een nieuwe cel doorgeven tool. Met behulp van een pipet, breng de gesneden kolonies in de twee putten van de ultra lage bevestiging zes-goed plaat. Pas op dag twee de cytokineconcentraties aan door 0,5 milliliter hESC SFM-media toe te voegen aan de zesputte plaat met de dag twee embryoloze lichamen.
Op dag vier, coat vier putten van een zes-goed weefsel cultuur plaat met 0,1%gelatine. Na het uitbroeden gedurende ten minste 10 minuten, verwijder de gelatine en voeg 2,5 milliliter van fase twee media. Verzamel gevormde embryonale lichamen uit de twee putten van een zes-put plaat en leg ze in een 50 milliliter centrifuge buis.
Laat ze zich op de bodem van de buis vestigen door de zwaartekracht. Dan zorgvuldig aspirate de media uit de buis en resuspend de embryoïne lichamen in twee milliliter van fase twee media. Breng 10 tot 15 embryonale lichamen over naar een gelatinegecoate put met 2,5 milliliter van fase twee media en incubaat bij 37 graden Celsius met 5% kooldioxide.
Gedurende twee tot drie weken, verander de media om de drie tot vier dagen. Plating van de EB's is cruciaal. Het hebben van minder dan 10 of meer dan 15 EB's of het ongelijk verdeeld hebben ervan kan leiden tot lage opbrengsten van macrofagen.
Na twee tot drie weken beginnen de embryoloze lichamen niet-loodzheemlijke hematopoietische cellen in suspensie vrij te geven. Met behulp van een 40 micrometer zeef, verzamel deze cellen in een 50 milliliter buis en vervolgens vullen de media. Centrifuge de suspensie van hematopoietische cellen op 200 keer g gedurende drie minuten.
Resuspend de hematopoietische cellen in fase drie media. Dan plaat de cellen op een dichtheid van 0,2 keer 10 tot de zesde cellen per milliliter. Verander de fase drie media om de vijf dagen.
Na negen tot elf dagen worden de macrofagen volledig gedifferentieerd en volledig functioneel. Voeg acht keer 10 toe aan de vierde iPSC-afgeleide macrofagen in 200 microliter van fase drie media aan elke put van een 96-put plaat. Voeg 100 microliter kraaloplossing toe aan elke put die iPSC-afgeleide macrofagen bevat.
Gebruik een hoog-inhoudsbeeldsysteem om de plaat in beeld te brengen. Verwerf drie of meer velden in elke put om een goede vertegenwoordiging te verkrijgen. iPSC kolonies, embryoide lichamen, hematopoietische suspensiecellen, en volwassen macrofagen waren morfologisch verschillend.
iPSC-afgeleide macrofagen waren groot, hadden enkele kleine ovale kernen en hadden overvloedig cytoplasma met veel akeltjes. Macrofaag fenotype werd beoordeeld door flow cytometrie. Volwassen iPSC-afgeleide macrofagen drukten de afstamming marker CD45 en de macrofaag rijping marker 25F9 en waren negatief voor monocyten onrijpe macrofaag marker CD93.
iPSC-afgeleide macrofagen uitgedrukt verschillende lineage myeloïde markers en waren positief voor immuun modulatie marker CD86. Een klein deel van de macrofagen uitgedrukt chemokine receptoren CX3CR1, CCR2, CCR5, en CCR8. iPSC-DM fagocytische vermogen werd geëvalueerd met behulp van biodeeltjes en een hoog-inhoud imaging systeem.
Biodeeltjes waren niet fluorescerend wanneer toegevoegd aan de macrofaag culturen, maar na fagocytosis fluoresced helder groen in de intracellulaire zure pH. De fagocytische fractie vertegenwoordigt het aandeel van macrofagen dat gepoccytotische biodeeltjes en de fagocytische index is de maat van het aantal biodeeltjes dat elke macrofaag innam. Macrofagen kunnen fenotype veranderen in reactie op milieusignalen.
RT-PCR werd gebruikt om upregulated mRNA expressie van genen te kwantificeren. Macrofagen behandeld met LPS en interferon gamma of IL4 toonde een aanzienlijk lager percentage van fagocytische cellen in vergelijking met naïeve macrofagen. Macrofagen behandeld met IL10 toonden een verhoogd percentage fagocytische cellen en een verhoogde fagocytische index.
Dit protocol kan worden gebruikt om een kant-en-klare bron van cellen te bieden voor de behandeling van ziekten zoals chronische leverziekte waarbij is aangetoond dat macrofagen therapeutisch zijn in diermodellen. iPSC-afgeleide macrofagen kunnen worden gebruikt om macrofagen in verband met verschillende ziektetoestanden te bestuderen. We gebruiken deze cellen bijvoorbeeld om macrofagen te bestuderen die verband houden met tumoren bij borstkanker.
We hebben het fenotype van iPSC-afgeleide macrofagen gewijzigd door genetische programmering met behulp van een enkele transcriptiefactor genaamd KLF1. Hiermee produceerden we macrofagen die lijken op de macrofagen van erythroideiland en ze hebben inzicht gegeven in de productie en rijping van rode bloedcellen.
