Die Forschung zur Humanmakrophagenbiologie wurde eingeschränkt, da sie auf das Sammeln von Zellen von Spendern beruht. Dieses Protokoll zeigt eine Methode, bei der wir menschliche Makrophagen aus pluripotenten Stammzellen im Labor herstellen können. Dies ist ein robustes Protokoll, das skaliert werden kann, um Makrophagen in großen Mengen für Zelltherapien oder Forschung zu produzieren.
Pluripotente Stammzellen können genetisch manipuliert werden. In diesem Protokoll können wir Makrophagen mit einem bestimmten Phänotyp, Fluoreszenz-Tags und auch Makrophagen erzeugen, um Krankheitszustände zu modellieren. Visuelle Demonstration dieses Protokolls ist nützlich, weil die Verwendung des einfachen Durchgangswerkzeugs vielen Forschern nicht vertraut sein wird.
Auch das Maß an Sorgfalt, das beim Auffüllen von Medien und Ernten von Zellen benötigt wird, ist schwer in Worte zu fassen. Wenn die kultivierten Zellen 80% Konfluenz erreicht haben, ersetzen Sie das verbrauchte Kulturmedium durch 1,5 Milliliter frisches Medium. Halten Sie das Kulturgefäß in einer Hand, rollen Sie ein Einweg-Zell-Passaging-Werkzeug über die Platte in eine Richtung.
Alle Klingen in der Rolle müssen die Platte berühren. Halten Sie gleichmäßigen Druck während des Walzens aufrecht. Wiederholen Sie das Rollen in die gleiche Richtung, bis der gesamte Brunnen abgedeckt wurde.
Drehen Sie das Kulturgefäß um 90 Grad und wiederholen Sie das Rollen. Mit einer sterilen Pipette, verwenden Sie Medien im Brunnen, um geschnittene Kolonien zu vertreiben. Aspirieren Sie CELLstart und ersetzen Sie Medien.
Übertragen Sie Zellen im Verhältnis eins zu vier auf vorbeschichtete Brunnen, wie im Manuskript beschrieben. Um den Differenzierungsprozess am Tag Null zu beginnen, fügen Sie 2,25 Milliliter Stufe eins Medien in zwei Bohrungen einer ultra niedrigen Befestigung sechs-Well-Platte. Dann für eine 80%konfluente Bohrung von iPSCs in einer Sechs-Well-Platte, ersetzen Sie die Wartungsmedien mit 1,5 Millilitern Stufe eins Medien.
Schneiden Sie Kolonien mit einem neuen Zellpassaging-Tool. Mit einer Pipette die geschnittenen Kolonien in die beiden Brunnen der ultraniedrigen Befestigungsplatte sechs-Well-Platte übertragen. Passen Sie am zweiten Tag die Zytokinkonzentrationen an, indem Sie 0,5 Milliliter hESC SFM-Medien auf die Sechs-Brunnen-Platte anlegen, die den Tag zwei embryoiden Körper enthält.
An Tag vier vier Brunnen einer Sechs-Well-Gewebekulturplatte mit 0,1% Gelatine beschichten. Nach der Inkubation für mindestens 10 Minuten, entfernen Sie die Gelatine und fügen Sie 2,5 Milliliter der Stufe zwei Medien. Sammeln Sie geformte embryoide Körper aus den beiden Brunnen einer Sechs-Brunnen-Platte und legen Sie sie in einem 50 Milliliter Zentrifugenrohr.
Lassen Sie sie sich am Boden des Rohres durch Schwerkraft absetzen. Dann saugen Sie vorsichtig die Medien aus der Röhre und suspendieren Sie die embryoiden Körper in zwei Millilitern der Stufe zwei Medien. 10 bis 15 embryoiden Körper in einen gelatinebeschichteten Brunnen mit 2,5 Millilitern Stufe zwei Medien übertragen und bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid inkubieren.
Wechseln Sie für zwei bis drei Wochen alle drei bis vier Tage die Medien. Die Beschichtung der EBs ist von entscheidender Bedeutung. Wenn sie weniger als 10 oder mehr als 15 EBs haben oder ungleichmäßig verteilt sind, kann dies zu niedrigen Erträgen von Makrophagen führen.
Nach zwei bis drei Wochen beginnen die embryoiden Körper, nicht haftende hämatopoetische Zellen in Suspension zu entlassen. Mit einem 40-Mikrometer-Sieb sammeln Sie diese Zellen in ein 50-Milliliter-Rohr und füllen Sie dann die Medien auf. Zentrifugieren Sie die Suspension hämatopoetischer Zellen bei 200 mal g für drei Minuten.
Setzen Sie die hämatopoetischen Zellen in den Medien der Dritten Stufe aus. Dann platten die Zellen mit einer Dichte von 0,2 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter. Ändern Sie die Bühne drei Medien alle fünf Tage.
Nach neun bis elf Tagen werden die Makrophagen vollständig differenziert und voll funktionsfähig sein. Fügen Sie achtmal 10 zu den vierten iPSC-abgeleiteten Makrophagen in 200 Mikroliter der Stufe-3-Medien zu jedem Brunnen einer 96-Well-Platte hinzu. Fügen Sie 100 Mikroliter Perlenlösung zu jedem Brunnen hinzu, der iPSC-abgeleitete Makrophagen enthält.
Verwenden Sie ein bildhtellerübergreifendes Bildsystem, um die Platte abzubilden. Erwerben Sie drei oder mehr Felder in jedem Brunnen, um eine gute Darstellung zu erhalten. iPSC-Kolonien, embryoide Körper, hämatopoetische Suspensionszellen und reife Makrophagen waren morphologisch verschieden.
iPSC-abgeleitete Makrophagen waren groß, hatten einzelne kleine ovale Kerne und hatten reichlich Zytoplasma mit vielen Vesikeln. Makrophagen-Phänotyp wurde durch Durchflusszytometrie untersucht. Ausgereifte iPSC-abgeleitete Makrophagen exprimiert enden den Lineage-Marker CD45 und den Makrophagen-Reifungsmarker 25F9 und waren negativ für Monozyten unreife Makrophagenmarker CD93.
iPSC-abgeleitete Makrophagen exprimieren mehrere Lineage Myeloidmarker und waren positiv für Immunmodulationsmarker CD86. Ein kleiner Teil der Makrophagen exprimierte Chemokinrezeptoren CX3CR1, CCR2, CCR5 und CCR8. Die phagozytische Fähigkeit von iPSC-DM wurde mit Biopartikeln und einem hochauflösenden Bildgebungssystem bewertet.
Biopartikel waren nicht fluoreszierend, wenn sie den Makrophagenkulturen zugesetzt wurden, aber nach phagozytose fluorescierte hellgrün im intrazellulären sauren pH-Wert. Die phagozytische Fraktion stellt den Anteil der Makrophagen dar, die phagozytosierte Biopartikel und der phagozytische Index ist das Maß für die Anzahl der Biopartikel, die jedes Makrophagen aufgenommen hat. Makrophagen können den Phänotyp als Reaktion auf Umwelthinweise verändern.
RT-PCR wurde verwendet, um die hochregulierte mRNA-Expression von Genen zu quantifizieren. Makrophagen, die mit LPS und Interferon gamma oder IL4 behandelt wurden, zeigten einen signifikant geringeren Prozentsatz phagozytischer Zellen im Vergleich zu naiven Makrophagen. Makrophagen, die mit IL10 behandelt wurden, zeigten einen erhöhten Prozentsatz phagozytischer Zellen und einen erhöhten phagozytischen Index.
Dieses Protokoll könnte verwendet werden, um eine standardisatorische Quelle von Zellen zur Behandlung von Krankheiten wie chronischeleber Erkrankungen bereitzustellen, bei denen Makrophagen nachweislich in Tiermodellen therapeutischer Natur sind. iPSC-abgeleitete Makrophagen können verwendet werden, um Makrophagen zu untersuchen, die mit mehreren Krankheitszuständen verbunden sind. Zum Beispiel verwenden wir diese Zellen, um Makrophagen zu untersuchen, die mit Tumoren bei Brustkrebs in Verbindung gebracht werden.
Wir haben den Phänotyp von iPSC-abgeleiteten Makrophagen durch genetische Programmierung mit einem einzigen Transkriptionsfaktor namens KLF1 modifiziert. Damit produzierten wir Makrophagen, die wie erythroide Inselmakrophagen aussehen, und sie haben Einblicke in die Produktion und Reifung roter Blutkörperchen gegeben.
