मानव मैक्रोफेज जीव विज्ञान अनुसंधान सीमित किया गया है क्योंकि यह दाताओं से कोशिकाओं को इकट्ठा करने पर निर्भर करता है । यह प्रोटोकॉल एक ऐसी विधि दिखाता है जिसमें हम प्रयोगशाला में प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से मानव मैक्रोफेज का उत्पादन कर सकते हैं। यह एक मजबूत प्रोटोकॉल है जिसे सेल उपचार या अनुसंधान के लिए बड़ी मात्रा में मैक्रोफेज का उत्पादन करने के लिए बढ़ाया जा सकता है।
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल में आनुवांशिक रूप से हेरफेर किया जा सकता है। इसलिए इस प्रोटोकॉल में, हम एक विशिष्ट फेनोटाइप, फ्लोरोसेंट टैग के साथ मैक्रोफेज उत्पन्न कर सकते हैं, और मॉडल रोग राज्यों के लिए मैक्रोफेज भी उत्पन्न कर सकते हैं। इस प्रोटोकॉल का दृश्य प्रदर्शन उपयोगी है क्योंकि आसान मार्ग उपकरण का उपयोग कई शोधकर्ताओं से परिचित नहीं होगा।
इसके अलावा, मीडिया और कटाई कोशिकाओं की भरपाई करते समय देखभाल के स्तर की आवश्यकता शब्दों में डालना मुश्किल है। जब सुसंस्कृत कोशिकाओं ८०% उदारता तक पहुंच गए हैं, ताजा माध्यम के १.५ मिलीलीटर के साथ खर्च संस्कृति माध्यम की जगह । एक हाथ में संस्कृति पोत पकड़े, एक दिशा में थाली भर में एक डिस्पोजेबल सेल पासेजिंग उपकरण रोल ।
रोलर में सभी ब्लेड थाली को छूने चाहिए। रोलिंग करते समय एक समान दबाव बनाए रखें। एक ही दिशा में रोलिंग दोहराएं जब तक कि पूरे कुएं को कवर नहीं किया गया हो।
संस्कृति पोत 90 डिग्री घुमाएं और रोलिंग दोहराएं। एक बाँझ पिपेट के साथ, कट कॉलोनियों को उखाड़ फेंकने के लिए कुएं में मीडिया का उपयोग करें। एस्पिरेट सेल्लस्टार्ट और मीडिया की जगह लेते हैं।
पांडुलिपि में वर्णित पूर्व-लेपित कुओं पर एक से चार अनुपात पर कोशिकाओं को स्थानांतरित करें। शून्य दिन पर भेदभाव की प्रक्रिया शुरू करने के लिए, एक अल्ट्रा कम लगाव छह अच्छी तरह से थाली के दो कुओं में मंच एक मीडिया के २.२५ मिलीलीटर जोड़ें । फिर छह-अच्छी प्लेट में आईपीएससी के एक 80% कॉन्फ्ल्यूंट वेल के लिए, रखरखाव मीडिया को स्टेज वन मीडिया के 1.5 मिलीलीटर के साथ प्रतिस्थापित करें।
एक नए सेल पासेजिंग टूल का उपयोग करके कालोनियों में कटौती करें। एक पिपेट का उपयोग करके, अल्ट्रा कम अटैचमेंट छह-वेल प्लेट के दो कुओं में कट कॉलोनियों को स्थानांतरित करें। दूसरे दिन, छह अच्छी तरह से दो भ्रूण निकायों युक्त थाली में एचएससी एसएफएम मीडिया के ०.५ मिलीलीटर जोड़कर साइटोकिन सांद्रता समायोजित करें ।
चार दिन पर, कोट ०.१% जिलेटिन के साथ एक छह अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति प्लेट के चार कुओं । कम से कम 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटिंग के बाद, जिलेटिन को हटा दें और स्टेज दो मीडिया के 2.5 मिलीलीटर जोड़ें। एक छह अच्छी तरह से थाली के दो कुओं से गठित भ्रूण निकायों को इकट्ठा करें और उन्हें 50 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में रखें।
उन्हें गुरुत्वाकर्षण द्वारा ट्यूब के तल पर बसने की अनुमति दें। फिर ध्यान से ट्यूब से मीडिया को आकांक्षी और चरण दो मीडिया के दो मिलीलीटर में भ्रूण निकायों को फिर से खर्च । 10 से 15 भ्रूण निकायों को एक जिलेटिन-लेपित अच्छी तरह से स्थानांतरित करें जिसमें स्टेज दो मीडिया के २.५ मिलीलीटर होते हैं और 5% कार्बन डाइऑक्साइड के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते हैं ।
दो से तीन हफ्ते तक हर तीन से चार दिन में मीडिया बदलें। ईबीएस की चढ़ाना महत्वपूर्ण है । 10 से कम या 15 से अधिक ईबी होने या उन्हें असमान रूप से वितरित करने से मैक्रोफेज की कम पैदावार हो सकती है ।
दो से तीन सप्ताह के बाद, भ्रूणीय निकाय गैर-तदर्थ हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को निलंबन में रिहा करना शुरू कर देते हैं। एक 40 माइक्रोमीटर छलनी का उपयोग करना, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में इन कोशिकाओं को इकट्ठा और फिर मीडिया की भरपाई। तीन मिनट के लिए 200 बार जी पर हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं के निलंबन को अपकेंद्रित्र करें।
स्टेज थ्री मीडिया में हेमेटोपोइटिक कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। फिर कोशिकाओं को 0.2 गुना 10 के घनत्व पर छठी कोशिकाओं को प्रति मिलीलीटर प्लेट करें। हर पांच दिन में स्टेज थ्री मीडिया बदलें।
नौ से 11 दिनों के बाद मैक्रोफेज पूरी तरह से विभेदित और पूरी तरह से कार्यात्मक हो जाएंगे। एक ९६-अच्छी थाली के प्रत्येक कुएं में स्टेज थ्री मीडिया के २०० माइक्रोलीटर में चौथे आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज में आठ गुना 10 जोड़ें । आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज युक्त प्रत्येक अच्छी तरह से मनका समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
प्लेट को इमेज करने के लिए उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करें। एक अच्छा प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए प्रत्येक कुएं में तीन या अधिक क्षेत्र प्राप्त करें। आईपीएससी उपनिवेश, भ्रूण निकाय, हेमेटोपोइटिक सस्पेंशन कोशिकाएं, और परिपक्व मैक्रोफेज रूपात्मक रूप से अलग थे।
आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज बड़े थे, उनमें एक छोटे अंडाकार आकार के नाभिक थे और प्रचुर मात्रा में साइटोप्लाज्म था जिसमें कई वेसिकल्स थे। मैक्रोफेज फेनोटाइप का आकलन फ्लो साइटोमेट्री द्वारा किया गया था। परिपक्व आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज ने वंश मार्कर सीडी 45 और मैक्रोफेज परिपक्वता मार्कर 25F9 व्यक्त किया और मोनोसाइट अपरिपक्व मैक्रोफेज मार्कर सीडी 93 के लिए नकारात्मक थे।
आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज ने कई वंश माइलॉयड मार्कर व्यक्त किए और प्रतिरक्षा मॉड्यूलेशन मार्कर सीडी 86 के लिए सकारात्मक थे। मैक्रोफेज का एक छोटा सा हिस्सा केमोकी रिसेप्टर्स CX3CR1, CCR2, CCR5, और CCR8 व्यक्त किया । आईपीएससी-डीएम फैगोसाइटिक क्षमता का मूल्यांकन बायोकण और उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करके किया गया था।
मैक्रोफेज संस्कृतियों में जोड़े जाने पर बायोपार्टिकल्स गैर-प्रवाहकीय थे, लेकिन फगोसाइटोसिस के बाद इंट्रासेलुलर अम्लीय पीएच में उज्ज्वल हरे रंग का प्रवाहित किया गया। फैगोसाइटिक अंश मैक्रोफेज के अनुपात का प्रतिनिधित्व करता है जो बायोकण और फैगोसाइटिक इंडेक्स को शामिल करता है, जो प्रत्येक मैक्रोफेज की संख्या का पैमाना है। मैक्रोफेज पर्यावरण संकेतों के जवाब में फेनोटाइप बदल सकते हैं।
आर टी-पीसीआर का उपयोग जीन की उपरिनियमित एमआरएनए अभिव्यक्ति को निर्धारित करने के लिए किया गया था। एलपीएस और इंटरफेरॉन गामा या आईएल4 के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज ने भोले मैक्रोफेज की तुलना में फैगोसाइटिक कोशिकाओं का काफी कम प्रतिशत दिखाया। IL10 के साथ इलाज किए गए मैक्रोफेज ने फागोसिटिक कोशिकाओं का प्रतिशत बढ़ाया और एक बढ़ी हुई फैगोसाइटिक इंडेक्स को दिखाया।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग पुरानी जिगर की बीमारी जैसे रोगों के इलाज के लिए कोशिकाओं के एक ऑफ-द-शेल्फ स्रोत प्रदान करने के लिए किया जा सकता है जहां मैक्रोफेज को पशु मॉडलों में चिकित्सीय दिखाया गया है। आईपीएससी से व्युत्पन्न मैक्रोफेज का उपयोग कई रोग राज्यों से जुड़े मैक्रोफेज का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, हम स्तन कैंसर में ट्यूमर से जुड़े मैक्रोफेज का अध्ययन करने के लिए इन कोशिकाओं का उपयोग करते हैं।
हमने केएलएफ 1 नामक एकल ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर का उपयोग करके जेनेटिक प्रोग्रामिंग द्वारा आईपीएससी-व्युत्पन्न मैक्रोफेज के फेनोटाइप को संशोधित किया है। इसके साथ, हमने मैक्रोफेज का उत्पादन किया जो एरिथ्रोइड द्वीप मैक्रोफेज की तरह दिखते हैं और उन्होंने लाल रक्त कोशिकाओं के उत्पादन और परिपक्वता में अंतर्दृष्टि प्रदान की है।