La investigación de la biología de los macrófagos humanos ha sido limitada porque se basa en la recolección de células de donantes. Este protocolo muestra un método en el que podemos producir macrófagos humanos a partir de células madre pluripotentes en el laboratorio. Este es un protocolo robusto que se puede ampliar para producir macrófagos en grandes cantidades para terapias celulares o investigación.
Las células madre pluripotentes pueden ser manipuladas genéticamente. Así que en este protocolo, podemos generar macrófagos con un fenotipo específico, etiquetas fluorescentes, y también macrófagos para modelar estados de enfermedad. La demostración visual de este protocolo es útil porque el uso de la herramienta de paso fácil no será familiar para muchos investigadores.
Además, el nivel de cuidado necesario al reponer los medios y las células de recolección es difícil de poner en palabras. Cuando las células cultivadas hayan alcanzado el 80% de confluencia, reemplace el medio de cultivo gastado por 1,5 mililitros de medio fresco. Sosteniendo el recipiente de cultivo en una mano, enrolle una herramienta de paso de celda desechable a través de la placa en una dirección.
Todas las cuchillas del rodillo deben tocar la placa. Mantenga una presión uniforme mientras rueda. Repita el balanceo en la misma dirección hasta que todo el pozo haya sido cubierto.
Gire el recipiente de cultivo 90 grados y repita la rodadura. Con una pipeta estéril, utilice medios en el pozo para desalojar las colonias cortadas. Aspirar CELLstart y reemplazar medios.
Transfiera las células en una proporción de uno a cuatro a pozos pre-recubiertos preparados como se describe en el manuscrito. Para comenzar el proceso de diferenciación en el día cero, agregue 2,25 mililitros de medios de la primera etapa en dos pozos de una placa de seis pozos de fijación ultra baja. Luego, para un pozo 80%confluente de iPSCs en una placa de seis pocillos, reemplace el medio de mantenimiento con 1,5 mililitros de medios de la primera etapa.
Corte colonias utilizando una nueva herramienta de paso de celdas. Usando una pipeta, transfiera las colonias cortadas a los dos pozos de la placa de seis pozos de fijación ultra baja. En el segundo día, ajuste las concentraciones de citoquinas añadiendo 0,5 mililitros de medios HESC SFM a la placa de seis pozos que contiene el día dos cuerpos embrionados.
En el cuarto día, cubra cuatro pozos de una placa de cultivo de tejido de seis pozos con 0,1% de gelatina. Después de incubar durante al menos 10 minutos, retire la gelatina y agregue 2,5 mililitros de medios de la segunda etapa. Recoger los cuerpos embrionados formados de los dos pozos de una placa de seis pozos y colocarlos en un tubo centrífugo de 50 mililitros.
Permita que se asienten en la parte inferior del tubo por gravedad. A continuación, aspirar cuidadosamente los medios del tubo y resuspender los cuerpos embrionados en dos mililitros de medios de la etapa dos. Transfiera de 10 a 15 cuerpos embrionados a un pozo recubierto de gelatina que contenga 2,5 mililitros de medios de la segunda etapa e incubar a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono.
De dos a tres semanas, cambie los medios cada tres o cuatro días. El revestimiento de los EBs es crucial. Tener menos de 10 o más de 15 EBs o tenerlos distribuidos de manera desigual puede conducir a bajos rendimientos de macrófagos.
Después de dos a tres semanas, los cuerpos embrionados comienzan a liberar células hematopoyéticas no adherentes en suspensión. Usando un colador de 40 micrómetros, recoja estas células en un tubo de 50 mililitros y luego reponer los medios. Centrifugar la suspensión de células hematopoyéticas a 200 veces g durante tres minutos.
Resuspender las células hematopoyéticas en la etapa tres medios. Luego plancha las células a una densidad de 0,2 veces 10 a las sextas células por mililitro. Cambie la etapa tres medios cada cinco días.
Después de nueve a 11 días, los macrófagos serán completamente diferenciados y completamente funcionales. Agregue ocho veces 10 a los cuartos macrófagos derivados de iPSC en 200 microlitros de medios de etapa tres a cada pocótulo de una placa de 96 pocillos. Añadir 100 microlitros de solución de perlas a cada pozo que contenga macrófagos derivados de iPSC.
Utilice un sistema de imágenes de alto contenido para crear imágenes de la placa. Adquiera tres o más campos a través de cada pozo para obtener una buena representación. Las colonias iPSC, los cuerpos embrionados, las células de suspensión hematopoyéticas y los macrófagos maduros eran morfológicamente distintos.
Los macrófagos derivados de iPSC eran grandes, tenían pequeños núcleos ovalados y tenían abundante citoplasma que contenía muchas vesículas. El fenotipo de macrófago se evaluó mediante citometría de flujo. Los macrófagos maduros derivados de iPSC expresaron el marcador de linaje CD45 y el marcador de maduración de macrófagos 25F9 y fueron negativos para el marcador de macrófagos inmaduras monocitos CD93.
Los macrófagos derivados de iPSC expresaron varios marcadores mieloide de linaje y fueron positivos para el marcador de modulación inmune CD86. Una pequeña proporción de los macrófagos expresó receptores de quimiocina CX3CR1, CCR2, CCR5 y CCR8. La capacidad fagocítica iPSC-DM se evaluó utilizando biopartículas y un sistema de imágenes de alto contenido.
Las biopartículas no eran fluorescentes cuando se añadieron a los cultivos de macrófagos, pero después de la fagocitosis fluoresced verde brillante en el pH ácido intracelular. La fracción fagocítica representa la proporción de macrófagos que las biopartículas fagocitosias y el índice fagocítico es la medida del número de biopartículas que ingirió cada macrófago. Los macrófagos pueden cambiar el fenotipo en respuesta a las señales ambientales.
RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de ARNm regulada por los genes. Los macrófagos tratados con LPS y la gamma de interferón o IL4 mostraron un porcentaje significativamente menor de células fagocíticas en comparación con los macrófagos ingenuos. Los macrófagos tratados con IL10 mostraron un mayor porcentaje de células fagocíticas y un mayor índice fagocítico.
Este protocolo podría utilizarse para proporcionar una fuente de células lista para usar para tratar enfermedades como la enfermedad hepática crónica, donde se ha demostrado que los macrófagos son terapéuticos en modelos animales. Los macrófagos derivados del iPSC se pueden utilizar para estudiar los macrófagos asociados con varios estados de la enfermedad. Por ejemplo, utilizamos estas células para estudiar los macrófagos asociados con tumores en el cáncer de mama.
Hemos modificado el fenotipo de los macrófagos derivados de iPSC mediante programación genética utilizando un único factor de transcripción llamado KLF1. Con esto, producimos macrófagos que parecen macrófagos isleños eritroides y han proporcionado información sobre la producción y maduración de los glóbulos rojos.
