Human makrofag biologi forskning har begränsats eftersom det bygger på att samla in celler från givare. Detta protokoll visar en metod där vi kan producera mänskliga makrofager från pluripotenta stamceller i laboratoriet. Detta är ett robust protokoll som kan skalas upp för att producera makrofager i stora mängder för cellterapier eller forskning.
Pluripotenta stamceller kan manipuleras genetiskt. Så i detta protokoll, vi kan generera makrofager med en specifik fenotyp, fluorescerande taggar, och även makrofager att modellera sjukdomsstater. Visuell demonstration av detta protokoll är användbart eftersom användningen av det enkla passageverktyget inte kommer att vara bekant för många forskare.
Dessutom är den vårdnivå som behövs när man fyller på media och skördar celler svårt att sätta ord på. När de odlade cellerna har nått 80%konfluency, ersätta den förbrukade odlingsmedium med 1,5 milliliter färskt medium. Håll odlingskärlet i ena handen, rulla ett engångscellspassagverktyg över plattan i en riktning.
Alla blad i rullen måste röra plattan. Behåll ett enhetligt tryck under rullningen. Upprepa rullande i samma riktning tills hela brunnen har täckts.
Rotera odlingskärlet 90 grader och upprepa rullande. Med en steril pipett, använd media i brunnen för att rubba skurna kolonier. Aspirera CELLstart och ersätta media.
Överför celler med ett förhållande mellan 1 och 4 på färdiglackerade brunnar som utarbetats enligt beskrivningen i manuskriptet. För att börja differentieringsprocessen på dag noll, tillsätt 2,25 milliliter av steg ett media i två brunnar av en ultra låg fastsättning sex-väl platta. Sedan för en 80%konfluent brunn av iPSCs i en sex-brunnsplatta, ersätta underhållsmedia med 1,5 milliliter av steg ett media.
Skär kolonier med hjälp av ett nytt cellpassningsverktyg. Med hjälp av en pipett överför du de skurna kolonierna i de två brunnarna i den ultralåga fastsättningen sex-brunnsplatta. På dag två, justera cytokinkoncentrationerna genom att lägga till 0,5 milliliter hESC SFM-medier till sex-brunnsplattan som innehåller dag två embryoidkroppar.
På dag fyra, päls fyra brunnar av en sex-väl vävnad kulturplatta med 0,1%gelatin. Efter inkubering i minst 10 minuter, ta bort gelatinet och tillsätt 2,5 milliliter av steg två media. Samla upp bildade embryoidkroppar från de två brunnarna i en sex-brunnsplatta och placera dem i ett centrifugrör på 50 milliliter.
Låt dem bosätta sig i botten av röret genom gravitation. Sedan försiktigt aspirera media från röret och resuspend de embryoid organ i två milliliter av steg två media. Överför 10 till 15 embryoidkroppar till en gelatinbelagd brunn som innehåller 2,5 milliliter av steg två-medier och inkubera vid 37 grader Celsius med 5%koldioxid.
För två till tre veckor, ändra media var tredje till fjärde dag. Bordläggning av de europeiska organen är avgörande. Att ha färre än 10 eller fler än 15 EBs eller att ha dem ojämnt fördelade kan leda till låg avkastning av makrofager.
Efter två till tre veckor börjar embryoidkropparna släppa nonadherent hematopoietic celler i suspension. Med hjälp av en 40 mikrometer sil, samla dessa celler i en 50 milliliter rör och sedan fylla på media. Centrifug suspensionen av hematopoietic celler vid 200 gånger g i tre minuter.
Resuspend de hematopoietic cellerna i steg tre media. Sedan platta cellerna vid en densitet av 0,2 gånger 10 till sjätte celler per milliliter. Ändra scenen tre media var femte dag.
Efter nio till 11 dagar kommer makrofagerna att vara helt differentierade och fullt fungerande. Lägg till åtta gånger 10 till den fjärde iPSC-härledda makrofager i 200 mikroliter av steg tre media till varje brunn av en 96-brunnsplatta. Lägg till 100 mikroliter av pärllösning till varje brunn som innehåller iPSC-härledda makrofager.
Använd ett bildsystem med hög halt för att avbilda plattan. Förvärva tre eller flera fält över varje brunn för att få en bra representation. iPSC kolonier, embryoid organ, hematopoietic suspension celler och mogna makrofager var morfologiskt distinkta.
iPSC-härledda makrofager var stora, hade enda små ovala-formade kärnor och hade riklig cytoplasma som innehåller många vesicles. Makrofagenotyp bedömdes av flödescytometri. Mogna iPSC-härledda makrofager uttryckt härstamning markör CD45 och macrophage mognadsmarkören 25F9 och var negativa för monocyt omogna makrofag markör CD93.
iPSC-härledda makrofager uttryckt flera härstamning myeloisk markörer och var positiva för immun modulering markör CD86. En liten del av makrofagerna uttryckte chemokinreceptorer CX3CR1, CCR2, CCR5 och CCR8. iPSC-DM phagocytic förmåga utvärderades med hjälp av biopartiklar och en hög innehållshalt bildbehandlingssystem.
Biopartiklar var nonfluorescent när de läggs till makrofagkulturerna, men efter fagocytos fluoresced ljusgrön i intracellulära sura pH. Den fagocytiska fraktionen representerar andelen makrofager som fagocytosed biopartiklar och det fagocytiska indexet är måttet på antalet biopartiklar som varje makrofag intaget. Makrofager kan ändra fenotyp som svar på miljö-signaler.
RT-PCR användes för att kvantifiera uppreglerade mRNA uttryck av gener. Makrofager som behandlades med LPS och interferon gamma eller IL4 visade en betydligt lägre andel av fagocytic celler när jämfört med naiva makrofager. Makrofager som behandlats med IL10 visade en ökad procentandel av fagocytic celler och en ökad fagocytic index.
Detta protokoll skulle kunna användas för att ge en off-the-shelf källa till celler för att behandla sjukdomar såsom kronisk leversjukdom där makrofager har visat sig vara terapeutiska i djurmodeller. iPSC-härledda makrofager kan användas för att studera makrofager som är associerade med flera sjukdomsstater. Till exempel använder vi dessa celler för att studera makrofager i samband med tumörer i bröstcancer.
Vi har modifierat fenotypen av iPSC-härledda makrofager genom genetisk programmering med hjälp av en enda transkriptionsfaktor som kallas KLF1. Med detta producerade vi makrofager som ser ut som erythroid ö makrofager och de har gett insikter i produktion och mognad av röda blodkroppar.
