Name: simplified reverse genetics method to recover recombinant rotaviruses expressing reporter proteins
Uploaded: 2020-04-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins at JoVE.com

Bu çalışma NIH'nin R03 AI131072 ve R21 AI144881, Indiana Üniversitesi Start-Up Finansmanı ve Lawrence M. Blatt Vakfı tarafından desteklenmiştir. IU Rotahoosier laboratuvarı üyelerine, Ulrich Desselberger'e ve Guido Papa'ya ters genetik protokolünün geliştirilmesine yaptıkları birçok katkı ve öneri için teşekkür ederiz.

1. Medya hazırlama ve hücre kültürü bakımı
<ol><li>T7 RNA polimeraz (BHK-T7) ve Afrika yeşil maymun böbrek MA104 hücreleri ifade bebek hamster böbrek hücreleri edinin. NOT: BHK-T7 (veya BSR-T7) hücreleri ticari olarak mevcut değildir, ancak RNA virüs biyolojisi incelemek için ters genetik kullanan laboratuvarların ortak bir hücre hattıdır. Bu protokolde kullanılan BHK-T7 hücre hattı Dr Ursula J. Buchholz (Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MD, ABD), orijinal BHK hücre hattı t7 RNA polim...

<ol>
	<li>Crawford, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection.">Rotavirus infection.</a> Nature Reviews Disease Primers. 3 (17083), 1-16 (2017).</li><li>Settembre, E. C., Chen, J. Z., Dormitzer, P. R., Grigorieff, N., Harrison, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+model+of+an+infectious+rotavirus+particle.">Atomic model of an infectious rotavirus particle.</a> The EMBO Journal. 30 (2), 408-416 (2011).</li><li>. Taxonomic information. Virus taxonomy: 2018b release Available from: <a target="_blank" href="https://talk.ictvonline.org/taxonomy">https://talk.ictvonline.org/taxonomy</a> (2019)</li><li>Tate, J. E., Burton, A. H., Boschi-Pinto, C., Parashar, U. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=World+Health+Organization-Coordinated+Global+Rotavirus+Surveillance+Network.+Global,+regional,+and+national+estimates+of+rotavirus+mortality+in+children+&lt;5+years+of+age.">World Health Organization-Coordinated Global Rotavirus Surveillance Network. Global, regional, and national estimates of rotavirus mortality in children &lt;5 years of age.</a> Clinical Infectious Diseases. 62, 96-105 (2016).</li><li>Troeger, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+vaccination+and+the+global+burden+of+rotavirus+diarrhea+among+children+younger+than+5+years.">Rotavirus vaccination and the global burden of rotavirus diarrhea among children younger than 5 years.</a> JAMA Pediatrics. 172 (10), 958-965 (2018).</li><li>Matthijnssens, J., Van Ranst, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+constellation+and+evolution+of+group+A+rotaviruses+infecting+humans.">Genotype constellation and evolution of group A rotaviruses infecting humans.</a> Current Opinion in Virology. 2 (4), 426-433 (2012).</li><li>McDonald, S. M., Nelson, M. I., Turner, P. E., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reassortment+in+segmented+RNA+viruses:+mechanisms+and+outcomes.">Reassortment in segmented RNA viruses: mechanisms and outcomes.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (7), 448-460 (2016).</li><li>Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+diversity+and+evolution+in+the+post-vaccine+world.">Rotavirus diversity and evolution in the post-vaccine world.</a> Discovery Medicine. 13 (68), 85-97 (2012).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Entirely+plasmid-based+reverse+genetics+system+for+rotaviruses.">Entirely plasmid-based reverse genetics system for rotaviruses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2349-2354 (2017).</li><li>Trask, S. D., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+insights+into+the+coupling+of+virion+assembly+and+rotavirus+replication.">Structural insights into the coupling of virion assembly and rotavirus replication.</a> Nature Reviews Microbiology. 10 (3), 165-177 (2012).</li><li>Guglielmi, K. M., McDonald, S. M., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+intraparticle+synthesis+of+the+rotavirus+double-stranded+RNA+genome.">Mechanism of intraparticle synthesis of the rotavirus double-stranded RNA genome.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (24), 18123-18128 (2010).</li><li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+proteins+by+using+an+optimized+reverse+genetics+system.">Generation of recombinant rotaviruses expressing fluorescent proteins by using an optimized reverse genetics system.</a> Journal of Virology. 92 (13), 00588-00618 (2018).</li><li>Trask, S. D., Taraporewala, Z. F., Boehme, K. W., Dermody, T. S., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+selection+mechanisms+drive+efficient+single-gene+reverse+genetics+for+rotavirus.">Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 18652-18657 (2010).</li><li>Fabbretti, E., Afrikanova, I., Vascotto, F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+non-structural+rotavirus+proteins,+NSP2+and+NSP5,+form+viroplasm-like+structures+in+vivo.">Two non-structural rotavirus proteins, NSP2 and NSP5, form viroplasm-like structures in vivo.</a> Journal of General Virology. 80, 333-339 (1999).</li><li>Eichwald, C., Rodriguez, J. F., Burrone, O. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+rotavirus+NSP2/NSP5+interactions+and+the+dynamics+of+viroplasm+formation.">Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation.</a> Journal of General Virology. 85, 625-634 (2004).</li><li>Kawagishi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+system+for+a+human+group+A+rotavirus.">Reverse genetics system for a human group A rotavirus.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+infectious+recombinant+human+rotaviruses+from+just+11+cloned+cDNAs+encoding+the+rotavirus+genome.">Generation of infectious recombinant human rotaviruses from just 11 cloned cDNAs encoding the rotavirus genome.</a> Journal of Virology. 93 (8), 02207-02218 (2019).</li><li>Mohanty, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+point+mutation+in+the+rhesus+rotavirus+VP4+protein+generated+through+a+rotavirus+reverse+genetics+system+attenuates+biliary+atresia+in+the+murine+model.">A point mutation in the rhesus rotavirus VP4 protein generated through a rotavirus reverse genetics system attenuates biliary atresia in the murine model.</a> Journal of Virology. 91 (15), 00510-00517 (2017).</li><li>Navarro, A., Trask, S. D., Patton, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+genetically+stable+recombinant+rotaviruses+containing+novel+genome+rearrangements+and+heterologous+sequences+by+reverse+genetics.">Generation of genetically stable recombinant rotaviruses containing novel genome rearrangements and heterologous sequences by reverse genetics.</a> Journal of Virology. 87, 6211-6220 (2013).</li><li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rotavirus+infection+alters+splicing+of+the+stress-related+transcription+factor+XBP1.">Rotavirus infection alters splicing of the stress-related transcription factor XBP1.</a> Journal of Virology. 93 (5), 01739-01818 (2019).</li><li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+recombinant+rotavirus+expressing+NSP3-UnaG+fusion+protein+by+a+simplified+reverse+genetics+system.">Generation of recombinant rotavirus expressing NSP3-UnaG fusion protein by a simplified reverse genetics system.</a> Journal of Virology. , 1616-1619 (2019).</li><li>Papa, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombinant+rotaviruses+rescued+by+reverse+genetics+reveal+the+role+of+NSP5+hyperphosphorylation+in+the+assembly+of+viral+factories.">Recombinant rotaviruses rescued by reverse genetics reveal the role of NSP5 hyperphosphorylation in the assembly of viral factories.</a> Journal of Virology. , (2019).</li><li>Komoto, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reverse+genetics+system+demonstrates+that+rotavirus+nonstructural+protein+NSP6+is+not+essential+for+viral+replication+in+cell+culture.">Reverse genetics system demonstrates that rotavirus nonstructural protein NSP6 is not essential for viral replication in cell culture.</a> Journal of Virology. 91 (21), 00695-00717 (2017).</li><li>Philip, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+of+recombinant+rotaviruses+expressing+fluorescent+reporter+proteins.">Collection of recombinant rotaviruses expressing fluorescent reporter proteins.</a> Microbiology Resource Announcements. 8 (27), 00523-00619 (2019).</li><li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+stable+rotavirus+reporter+expression+systems.">Development of stable rotavirus reporter expression systems.</a> Journal of Virology. , 01774-01818 (2019).</li><li>Donnelly, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+'cleavage'+activities+of+foot-and-mouth+disease+virus+2A+site-directed+mutants+and+naturally+occurring+'2A-like'+sequences.">The 'cleavage' activities of foot-and-mouth disease virus 2A site-directed mutants and naturally occurring '2A-like' sequences.</a> Journal of General Virology. 82, 1027-1041 (2001).</li><li>Kumagai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bilirubin-inducible+fluorescent+protein+from+eel+muscle.">A bilirubin-inducible fluorescent protein from eel muscle.</a> Cell. 153, 1602-1611 (2013).</li><li>Rodriguez, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+growing+and+glowing+toolbox+of+fluorescent+and+photoactive+proteins.">The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins.</a> Trends in Biochemical Sciences. 42, 111-129 (2017).</li><li>Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+bovine+respiratory+syncytial+virus+(BRSV)+from+cDNA:+BRSV+NS2+is+not+essential+for+virus+replication+in+tissue+culture,+and+the+human+RSV+leader+region+acts+as+a+functional+BRSV+genome+promoter.">Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter.</a> Journal of Virology. 73, 251-259 (1999).</li><li>Centers for Disease Control and Prevention (CDC). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biosafety in microbiological and biomedical laboratories (BMBL), 5th edition. , (2009).</li><li>Arnold, M., Patton, J. T., McDonald, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing,+storage,+and+quantification+of+rotaviruses.">Culturing, storage, and quantification of rotaviruses.</a> Current Protocols in Microbiology. 15 (1), (2009).</li><li>Benureau, Y., Huet, J. C., Charpilienne, A., Poncet, D., Cohen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin+is+associated+with+the+rotavirus+capsid+and+is+activated+by+solubilization+of+outer+capsid+proteins.">Trypsin is associated with the rotavirus capsid and is activated by solubilization of outer capsid proteins.</a> Journal of General Virology. 86 (11), 3143-3151 (2005).</li></ol>

Laboratuvarımızda, rekombinant SA11 rotavirüsleri üretmek için burada tanımlanan ters genetik protokolüne rutin olarak güveniyoruz. Bu yaklaşımla, moleküler biyoloji teknikleri konusunda çok az deneyimi olan veya rotavirüslerle çalışan bireyler ilk denemelerinde bile rekombinant virüsleri kurtarırlar. Bu protokolü takip eden 100'e yakın rekombinant virüs ürettik, yabancı proteinleri (örneğin, FP'leri) ifade etmek için yeniden tasarlanmış genomlara sahip olanlar ve dizi eklemeleri, silmeler ve ...

Rotavirüsler bebeklerde ve küçük çocuklarda şiddetli gastroenteritin başlıca nedenleri olduğu gibi, diğer birçok memeli ve kuştürününgenç 1. Reoviridae ailesinin üyeleri olarak, rotavirüsler parçalı çift iplikçikli RNA (dsRNA) genomuna sahiptir. Genom segmentleri, üç konsantrik protein katmanından oluşan zarfsız bir ikozahedral virion içinde bulunur2. Genom segmentlerinin dizilimi ve filogenetik analizine dayanarak dokuz rotavirüs türü (A−D, F−J)tanımlanmıştır 3. Rotavirüs türleri A oluşan bu suşları insan hastalığının büyük çoğunluğu sorumludur4. Son on yılda başlayan çocukluk çağı bağışıklama programlarına rotavirüs aşılarının getirilmesi, rotavirüs mortalitesi ve morbiditesinde önemli azalmalarla ilişkilidir. En önemlisi, rotavirüs e bağlı çocukluk ölümlerinin sayısı 2000 yılında yaklaşık 528.000'den 2016'da 128.500'e düşmüştür4,5. Rotavirüs aşıları virüsün canlı zayıflatılmış suşları formüle edilir, 2-3 doz yaş 6 ay tarafından çocuklara uygulanan ile. Insanlar ve diğer memeli türlerinde dolaşan genetik olarak çeşitli rotavirüs suşları çok sayıda, hızla mutagenez ve reassortment yoluyla gelişmek için yetenekleri ile birlikte, rotavirüslerin türleri çocuklara bulaştıran antijenik değişikliklere yol açabilir6,7,8. Bu tür değişiklikler mevcut aşıların etkinliğini zayıflatabilir, bunların değiştirilmesi veya değiştirilmesi gerektirebilir.
11 rotavirüs genom segmentinden herhangi birinin manipülasyonunu sağlayan tam plazmid tabanlı ters genetik sistemlerin geliştirilmesi ancak9. Bu sistemlerin kullanılabilirliği ile, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinmoleküler ayrıntılarını çözmek, anti-rotavirüs bileşikleri için geliştirilmiş yüksek işlemli tarama yöntemleri geliştirmek ve rotavirüs aşılarının potansiyel olarak daha etkili sınıfları oluşturmak mümkün hale gelmiştir. Rotavirüs replikasyonu sırasında, kapaklı viral (+)RNA'lar sadece viral proteinlerin sentezine rehberlik etmekle kalmıyor, aynı zamanda dsRNA genom segmentlerinin sentezi için şablon görevi de veriyor10,11. Bugüne kadar açıklanan tüm rotavirüs ters genetik sistemleri, rekombinant virüslerin kurtarılmasında kullanılan cDNA kaynaklı (+)RNA'ların kaynağı olarak Memeli hücre hatlarına T7 transkripsiyon vektörlerinin transfeksiyonuna dayanır9,12,13. Transkripsiyon vektörleri içinde, tam uzunlukta viral cDNA'lar, t7 promotörü ve aşağı akım hepatit delta virüsü (HDV) ribozyme arasında konumlandırılır, öyle ki viral (+)RNA'lar otantik 5' ve 3'-termini içeren T7 RNA polimeraz ile sentezlenirler (Şekil 1A). Birinci nesil ters genetik sistemde, rekombinant virüsler t7 RNA polimeraz (BHK-T7) ile 11 T7 (pT7) transkripsiyon vektörü ifade eden bebek hamster böbrek hücrelerinin transfecting tarafından yapılmıştır, simian SA11 virüs suşu benzersiz bir (+)RNA sentezi yönlendiren her, ve üç CMV promotör sürücü ekspresyon plazmidler, bir kuş reovirus p10FAST füzyon proteini kodlama ve vaccinia virüsü D1R-D12L kapama enzim kompleksi iki kodlama alt birimleri9. Transfected BHK-T7 hücrelerinde üretilen rekombinant SA11 virüsleri MA104 hücreleri ile overseeding tarafından güçlendirilmiştir, rotavirüs büyümesi için izin veren bir hücre hattı. İlk nesil ters genetik sisteminin değiştirilmiş bir sürümü artık destek plazmids12kullandığı tarif edilmiştir. Bunun yerine, modifiye sistemi başarıyla 11 SA11 T7 transkripsiyon vektörleri ile BHK-T7 hücreleri transfecting tarafından rekombinant rotavirüsler üretir, uyarı ile viral fabrika (viroplazm) yapı taşları (nonstructural proteinler NSP2 ve NSP5) düzeyleri 3 kat diğer vektörler14,15daha yüksek eklenir . Ters genetik sisteminin modifiye versiyonları da rotavirüs16,,17insan KU ve Odelia suşlarının kurtarma destekleyen geliştirilmiştir . Rotavirüs genomu, VP418, NSP19, NSP219, NSP320,21ve NSP522,23içine tanıtılan mutasyonlar ile bugüne kadar oluşturulan rekombinant virüsler ile, ters genetik tarafından manipülasyon için son derece münasip olduğunu. Şimdiye kadar üretilen en yararlı virüsler arasında floresan muhabir proteinleri ifade etmek için tasarlanmış olanlar (FS)9,12,21,24,25.
Bu yayında, laboratuvarımızda kullandığımız ters genetik sisteminin protokolünü sa11 rotavirüs rekombinant suşları üretmek için sağlıyoruz. Protokolümüzün temel özelliği BHK-T7 hücrelerinin 11 pT7 transkripsiyon vektörü (pT7/NSP2SA11 ve pT7/NSP5SA11 vektörlerinin 3x seviyelerini içerecek şekilde modifiye edilmiş) ve Afrika domuz ateşi virüsünü (ASFV) NP868 capping enzim21 (2 Şekil)kodlayan bir CMV ekspresyonu vektörü ile birlikte transfeksiyonudur. Elimizde, NP868R plazmid varlığı transfected BHK-T7 hücreleri ile rekombinant virüslerin yüksek titreüretimine yol açar. Bu yayında, pT7/NSP3SA11 plazmidini, sadece segment 7 protein ürünü NSP3'ü değil, aynı zamanda ayrı bir FP'yi ifade eden rekombinant virüslerin üretilebildiği şekilde modifiye etmek için bir protokol de salıyoruz. Bu bir FP ORF (Şekil 1B)24,26tarafından takip bir downstream 2A çeviri durdurma-yeniden başlatma elemanı içeren pT7/NSP3SA11 plazmid NSP3 açık okuma çerçevesi (ORF) yeniden mühendislik tarafından gerçekleştirilir . Bu yaklaşım sayesinde, çeşitli LP'leri ifade eden rekombinant rotavirüsler oluşturduk: UnaG (yeşil), mKate (uzak kırmızı), mRuby (kırmızı), TagBFP (mavi), CFP (siyan) ve YFP (sarı)24,27,28. Bu FP ifade eden rotavirüsler NSP3 ORF silmeden yapılır, böylece işleyen viral proteinlerin tam bir tamamlayıcı kodlamak için beklenen virüsler verimli.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:984px;" width="983">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Baby Hamster Kidney - T7 RdRP (BHK-T7) Cells</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td style="width:229px;">Contact: ubuchholz@niaid.nih.gov</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:419px;">Bio-Rad 8-16% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;">45608105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Cellometer AutoT4 viable cell counter</td>
			<td style="width:180px;">Nexcelom</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:22px;width:419px;">ChemiDoc MP Gel Imaging System</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Chloroform</td>
			<td style="width:180px;">MP</td>
			<td style="width:156px;">194002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Clarity Western Enhanced Chemiluminescence (ECL) Substrate</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;">170-5060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Competent E.coli DH5alpha Bacteria</td>
			<td style="width:180px;">Lucigen</td>
			<td style="width:156px;">60602-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Complete Protease Inhibitor</td>
			<td style="width:180px;">Pierce</td>
			<td style="width:156px;">A32965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Disposable Transfer Pipettes, Ultrafine Extended Tips</td>
			<td style="width:180px;">MTC Bio</td>
			<td style="width:156px;">P4113-11</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:180px;">Lonza</td>
			<td style="width:156px;">12-604F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Eagle&#39;s Minimal Essential Medium, 2x (2xEMEM)</td>
			<td style="width:180px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:156px;">115-073-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Ethanol, Absolute (200 proof)</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:156px;">BP2818-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Ethidium Bromide Solution (10 mg/ml)</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:156px;">35-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:156px;">35-011-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Flag M2 Antibody, Mouse Monoclonal</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">F1804</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">GenEluate HP Plasmid Midiprep Kit</td>
			<td style="width:180px;">Sigma</td>
			<td style="width:156px;">NA0200-1KT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Geneticin (G-418)</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">10131-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Gibco FluroBrite DMEM</td>
			<td style="width:180px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:156px;">A1896701</td>
			<td>DMEM with low background fluorescence</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Glasgow Minimal Essential Medium (GMEM)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:156px;">11710-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Goat Anti-Rabbit IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated</td>
			<td style="width:180px;">Cell-Signaling Technology</td>
			<td style="width:156px;">7074S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Guinea Pig Anti-NSP3 Antiserum</td>
			<td>Patton lab</td>
			<td>lot 55068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Guinea Pig Anti-VP6 Antierum</td>
			<td>Patton lab</td>
			<td>lot 53963</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Horse Anti-Guinea Pig IgG, Horseradish Peroxidase (HRP) Conjugated</td>
			<td style="width:180px;">KPL</td>
			<td>5220-0366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Horse Anti-Mouse IgG, Horseradish eroxidase (HRP) Conjugated</td>
			<td style="width:180px;">Cell-Signaling Technology</td>
			<td style="width:156px;">7076S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">iNtRON Biotechnology e-Myco Mycoplasma PCR Detection Kit</td>
			<td style="width:180px;">JH Science</td>
			<td style="width:156px;">25235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Isopropyl alcohol</td>
			<td style="width:180px;">Macron</td>
			<td style="width:156px;">3032-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">L-glutamine Solution (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:156px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Luria Agar Powder (Miller&#39;s LB Agar)</td>
			<td style="width:180px;">RPI research products</td>
			<td style="width:156px;">L24020-2000.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Medium 199 (M199) Culture Medium</td>
			<td style="width:180px;">Hyclone</td>
			<td style="width:156px;">Sh30253.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Minimal Essential Medium -Eagle Joklik&#39;s Forumation (SMEM)</td>
			<td style="width:180px;">Lonza</td>
			<td style="width:156px;">04-719Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Monkey Kidney (MA104) Cells</td>
			<td style="width:180px;">ATCC</td>
			<td style="width:156px;">ATCC CRL-2378.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">NanoDrop One Spectrophotometer</td>
			<td style="width:180px;">ThermoScientific</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Neutral Red Solution (0.33%)</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">N2889-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Non-Essential Amino Acid Solution (100x)</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:156px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Novex 10% Tris-Glycine Polyacrylamide Mini-Gel</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">XP00102BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Nuclease-Free Molecular Biology Grade Water</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">NucleoSpin Gel and PCR Clean-Up Kit</td>
			<td style="width:180px;">Takara</td>
			<td style="width:156px;">740609.25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:156px;">31985-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Pellet pestle (RNase-free, disposable)</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:156px;">12-141-368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Penicillin-Streptomycin Solution, (100x penn-strep)</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:156px;">30-002-Cl</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:419px;">Phosphate Buffered Saline (PBS), 10x</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:156px;">BP399-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Porcine Trypsin, Type IX-S</td>
			<td style="width:180px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:156px;">T0303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">PureYield Plasmid Miniprep System</td>
			<td style="width:180px;">Promega</td>
			<td style="width:156px;">A1223</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Qiagen Plasmid Maxi Kit</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:156px;">12162</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Qiagen Plasmid Midi Kit</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:156px;">12143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">QIAprep Spin Miniprep Kit</td>
			<td style="width:180px;">Qiagen</td>
			<td style="width:156px;">27104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">SA11 pT7 Transcription Vectors</td>
			<td style="width:180px;">Addgene</td>
			<td style="width:156px;">89162-89172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">SA11 pT7/NSP3 Transcription Vectors Expressing Fluorescent Proteins</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td>Contact: jtpatton@iu.edu</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">SeaKem LE Agarose</td>
			<td style="width:180px;">Lonza</td>
			<td style="width:156px;">50000</td>
			<td>For gel electrophoresis</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">SeaPlaque agarose</td>
			<td style="width:180px;">Lonza</td>
			<td style="width:156px;">50100</td>
			<td>For plaque assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Superscript III One-Step RT-PCR kit</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:156px;">12574-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trans-Blot Turbo Nitrocellulose Transfer Kit</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;">170-4270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trans-Llot Turbo Transfer System</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">TransIT-LTI Transfection Reagent</td>
			<td style="width:180px;">Mirus</td>
			<td style="width:156px;">MIR2306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tris-Glycine-SDS Gel Running Buffer (10x)</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;">161-0772</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Triton X 100</td>
			<td style="width:180px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:156px;">BP151-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trizol RNA Extraction Reagent</td>
			<td style="width:180px;">Ambion</td>
			<td style="width:156px;">15596026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:180px;">Corning</td>
			<td style="width:156px;">25-900-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Trypsin (0.05%)-EDTA (0.1%) Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:180px;">Quality Biological</td>
			<td style="width:156px;">118-087-721</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tryptose Phosphate Broth</td>
			<td style="width:180px;">Gibco</td>
			<td style="width:156px;">18050-039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Tween-20</td>
			<td style="width:180px;">VWR</td>
			<td style="width:156px;">0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Vertrel VF solvent</td>
			<td style="width:180px;">Zoro</td>
			<td style="width:156px;">G0707178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:419px;">Zoe Fluorescent Live Cell Imager</td>
			<td style="width:180px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:156px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified reverse genetics method to recover recombinant rotaviruses expressing reporter proteins

Rotavirüsler, insanlar da dahil olmak üzere birçok memeli ve kuş konak türlerinin genç şiddetli gastroenterit neden segmentli çift iplikli RNA virüslerin büyük ve gelişen bir nüfustur. Rotavirüs ters genetik sistemlerinin son gelişiyle, rotavirüs biyolojisini keşfetmek, mevcut rotavirüs aşılarını değiştirmek ve optimize etmek ve rotavirüs çok hedefli aşı vektörlerini geliştirmek için yönlendirilmiş mutagenezi kullanmak mümkün hale gelmiştir. Bu raporda, rekombinant rotavirüslerin etkin ve güvenilir bir şekilde geri kazanılmasına olanak tanıyan basitleştirilmiş bir ters genetik sistemini tanımlıyoruz. Sistem, tam uzunlukta rotavirüs (+)RNA'ları ve bir RNA kapama enzimini BHK hücrelerine kodlayan bir CMV vektörünü ifade eden T7 transkripsiyon vektörlerinin eş transfeksiyonuna dayanmaktadır. Rekombinant rotavirüsler MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücreleri overseeding tarafından yükseltilir, virüs büyümesi için son derece müsamahakar bir maymun böbrek hücre hattı. Bu raporda, genom segment7 'ye (NSP3) 2A çevirisel stop-restart elementi girişi yoluyla ayrı bir floresan muhabir proteini ifade eden rekombinant rotavirüsler imal etme yaklaşımını da açıklıyoruz. Bu yaklaşım, viral açık okuma çerçevelerinin herhangi birini silerek veya değiştirmekten kaçınarak, floresan proteini ifade ederken tamamen işlevsel viral proteinleri koruyan rekombinant rotavirüslerin üretimine olanak sağlar.

Bu makalede açıklanan ters genetik protokolü birden fazla farklı adımda devam eder: (1) BHK-T7 hücrelerinin rotavirüs pT7 transkripsiyon vektörleri ve pCMV/NP868R ekspresyonu plazmidi ile birlikte transfeksiyonu, (2) MA104 hücreleri ile transfected BHK-T7 hücrelerinin overseeding, (3) BHK-T7/MA104 hücreleri lysates bulunan rekombinant virüslerin amplifikasyon ma104 hücreleri kullanarak, ve (4) MA104 hücreleri kullanarak rekombinant virüsün plak izolasyonu(Şekil 2). Bizim eli...

Watch this Scientific Journal Video about Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins at JoVE.com

Simplified Reverse Genetics Method to Recover Recombinant Rotaviruses Expressing Reporter Proteins

Plazmid DNA'sından rekombinant rotavirüslerin üretimi, rotavirüs replikasyonu ve patogenezinin incelenmesi, rotavirüs ekspresyonu vektörleri ve aşılarının geliştirilmesi için gerekli bir araçtır. Burada, floresan muhabir proteinleri ifade eden suşlar da dahil olmak üzere rekombinant rotavirüsler imal etmek için basitleştirilmiş bir ters genetik yaklaşımını tanımlıyoruz.

Rekombinant Rotavirüsleri İyileştirmek Için Basitleştirilmiş Ters Genetik Yöntemi Muhabir Proteinleri İfade Ediyor

Rotaviruses are a large and evolving population of segmented double-stranded RNA viruses that cause severe gastroenteritis in the young of many mammalian ...

Bu protokol rekombinant rotavirüsler yapmak için güvenilir ve verimli bir ters genetik sistemi açıklar. Ayrıca floresan marker proteinleri ifade rekombinant rotavirüsler yapmak nasıl açıklar. Bu yöntem plazmidlerin az sayıda gerektiren basit ve ayrı flor proteinleri yanı sıra viral proteinler ifade rekombinant rotavirüsler üretebilir.BHKT7 hücrelerini 12 kuyulu plakalara tohumlayarak başlayın. PBS ile hücrelerin taze enfluent monolayer durulayın. Daha sonra tripsin-EDTA çözeltisi ile monolayer bozun ve GMEM tam orta beş mililitre hücreleri resuspend.Trypan mavisi ve otomatik bir hücre sayacı kullanarak canlı BHKT7 hücrelerinin konsantrasyonu belirleyin. Daha sonra 12 kuyulu hücre kültür plakasının her kuyunun içine bir mililitre GMEM'deki beşinci hücrelere iki kez 10 tohum koyun. Plakayı bir gecede %5 karbondioksit kuvözde 37 derecede kuluçkaya yatırın.Ertesi gün, el yazması yönlere göre transfeksiyon için plazmid karışımı nı hazırlayın. Daha sonra her plazmid karışımına önceden ısıtılmış azaltılmış serum ortamının 110 mikrolitresini ekleyin ve hafifçe karıştırmak için pipet yukarı ve aşağı. Karışıma 32 mikrolitre transfeksiyon reaktifi ekleyin.Girdap ve 20 dakika oda sıcaklığında kuluçka aşağıdaki kısa bir santrifüj yapın. Bu arada, Iki mililitre GMEM eksik orta bhkt7 hücreleri durulayın. Her kuyuya bir mililitre eksik Orta SMEM ekleyin ve plakayı kuvöze geri verin.20 dakikalık kuluçkadan sonra, transfeksiyon karışımını her kuyuya damla damla eklemek için 200 mikrolitrelik pipettor kullanın. Yavaşça plakayı sallayın ve kuvöze geri ver. Transfeksiyondan iki gün sonra, MA104 hücrelerinin yeni bir monokatmanını PBS ile durulayın.Tripsin-EDTA çözeltisi ile monolayer bozun ve DMEM tam orta beş mililitre hücreleri yeniden askıya. Hücreleri sayın ve konsantrasyonu dMEM'in mililitresi başına beşinci hücrelere sekiz kez 10'a ayarlayın. Transfected BHKT7 hücreleri ile kuyulara damla akıllıca MA104 hücrelerinin 0.25 mililitre ekleyin.Tripsin konsantrasyonunu her kuyuya mililitre başına bir miligrama 0,8 mikrolitre ekleyerek mililitre başına 0,5 mikrograma ayarlayın. Kalan MA104 hücrelerini DMEM'deki mililitre başına beşinci hücrelere 1,5 kat 10 konsantrasyonla seyreltin ve altı kuyulu bir plakanın her kuyuya iki mililitre yerleştirin. Transfeksiyondan altı gün sonra, transfected hücrelerden rekombinant virüsü kurtarmak.BHKT7 MA104 hücrelerini steril koşullar altında üç döngü donma/çözülme ye tabi tarak plakaları negatif 20 santigrat derecelik bir dondurucu ile oda sıcaklığı arasında hareket ettirin. Lysates'i 1,5 mililitrelik tüplere aktarın. Tüpleri 500 kez g ve hücresel enkazı peletlemek için 4 santigrat derecede 10 dakika santrifüj edin.Supernatant toplamak ve dört santigrat derece saklayın. 100 mikrolitre açıklıklı hücre lysate'ye tripsin ekleyin ve mililitre başına 10 mikrogramlık son konsantrasyona ekleyin ve karışımı bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Daha sonra 10 ila 10 arasında değişen bir seri seyreltme serisi hazırlamak 10 için negatif bir için 10 dmem eksik ortamda negatif yedi.MA104 monolayers iki mililitre PBS ve bir kez DMEM eksik orta ile iki kez durulayın. Plakalara 400 mikrolitre lysate seyreltme ekleyin ve 37 santigrat derece ve %5 karbondioksit le kuluçkaya yatırın, seyreltmeleri tek kata dağıtmak için her 10 ila 15 dakikada bir sallayın. Eşit hacimlerde önceden ısıtılmış 2X EMEM ile %1,5 erimiş ve soğutulmuş agarose'u birleştirerek bir agarose MEM kaplama çözeltisi hazırlayın.Bu çözeltiyi bir su banyosunda 42 santigrat derecede koruyun ve tripsin konsantrasyonu hücrelere yerleştirmeden hemen önce mililitre başına 0,5 mikrograma ayarlayın. Altı kuyulu plakadan seyreltmeler aspire edin. Daha sonra hücreleri iki mililitre eksik orta ile bir kez durulayın.Yavaşça her kuyuda hücre monolayer üzerine agarose MEM kaplama çözeltisi üç mililitre ekleyin. Agarose oda sıcaklığında sertleşmeye izin verin. Sonra plakaları kuvöze geri ver.Üç gün sonra, daha önce açıklandığı gibi bir agarose MEM kaplama çözeltisi hazırlayın ve kullanımdan hemen önce mililitre başına 50 mikrogramlık son konsantrasyona nötr kırmızı ekleyin. Altı kuyu plakalar mevcut agarose üstüne bindirme çözeltisi iki mililitre ekleyin. Agarose sertleştirmek ve kuvöz plaka dönmek için izin, ışık nötr kırmızı plakaları korumak için emin olun.Önümüzdeki altı saat içinde, bir ışık kutusu yardımıyla rotavirüs plakları belirlemek. Hücre tabakasına kadar uzanan agarose fişleri geri kazanarak, net bir şekilde tanımlanmış plakları almak için tek kullanımlık transfer pipetleri kullanın. 0,5 mililitre DMEM eksik orta ve girdap içeren 1,5 mililitrelik bir tüp içine fişi 30 saniye boyunca çıkarın.MA104 monolayers veya DMEM eksik orta ve tripsin mililitre başına 0,5 mikrogram at25 şişesi üzerinde yayılım tarafından orta eluted plak izole virüs yükseltmek. 1.5 mililitre mikrosantrifüj tüpleriçine 600 mikrolitre açıklık enfekte hücre litates ve guanidinium tiyosiyanat 400 mikrolitre ekleyin. 30 saniye boyunca girdap ve beş dakika oda sıcaklığında onları kuluçkaya yat.Sonra kloroform 200 mikrolitre ekleyin. 30 saniye boyunca çözeltiyi girdap ve üç dakika kuluçkaya yatırın. 13, 000 kez g ve dört santigrat derece de beş dakikalık bir mikrosanrifugation sonra, taze bir tüp içine üst sulu faz 550 mikrolitre aktarın.Soğuk isopropil alkol iki cilt ekleyin ve tüp ters dört ila altı kez. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika kuluçkaya yatırın. Sonra 13, 000 kez g ve dört derece santigrat 10 dakika santrifüj.RNA peletini bırakarak süpernatant'ı atın. RNA'yı bir mililitre 75 etanol ekleyerek bir kez ters çevirerek ve 7, 500 kez g ve dört santigrat derecede beş dakika santrifüj ederek yıkayın. Etanol'ü dikkatlice çıkardıktan sonra RNA'nın 5 ila 10 dakika boyunca kurumasını bekleyin.Daha sonra peleti 15 mikrolitre çekirdeğin serbest suyunda eritin. Çözünmüş RNA örneğinin 10 mikrolitresine iki mikrolitre 6X DNA yükleme tamponu ekleyin. Önceden dökme%10 poliakrilamid mini jel üzerine yükleyin.Tris-glisin çalışan tampon elektroforez ile RNA'lar sabit bir 16 miliamper akım altında iki saat boyunca çözün. Jel çalışması tamamlandıktan sonra, mililitre ethidyum bromür başına bir mikrogram içeren suda 5 ila 10 dakika bekletin ve UV transilluminator ile rotavirüs genom segmentleri tespit. Bu ters genetik protokolü kolayca plak izolasyonu için izin MA104 hücreleri üzerinde bir plak tsay ile tespit edilebilir rekombinant SA11 virüsleri oluşturmak için kullanılmıştır.Plak saflaştırılmış rSA11 yabani tip ve SA11-UnaG virüslerinin dsRNA genomları fenol ve guanidinium tiyosiyanat içeren bir solüsyon ile çıkarıldı, %10 poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile çözüldü ve etid bromür ile boyanarak tespit edildi. Beklendiği gibi, rSA11-UnaG segment ivedi veya NSP3 dsRNA 2A-3xFLUnaG dizilerinin varlığı nedeniyle rSA11 wild tipinden çok daha yavaş göç etti. UnaG floresan proteininekspresyonkontrol etmek için, MA104 hücreleri yabani tip ve rekombinant virüs ile enfekte edildi ve canlı hücre görüntüleyici ile incelendi.Analiz, rSA11-UnaG'nin yeşil floresan ürettiğini, rSA11 yabani tipli hücrelerde floresan saptanmadı. RSA11-NSP3-2A-xflUnaG'nin 2A elementinin iki ayrı proteinin ekspresyonunu teşvik edip etmediğini araştırmak için immünoblot analizi yapıldı. Analiz, NSP3-2A ve 3xFL-UnaG'ın fonksiyonel 2A elementini gösteren ayrı proteinler olarak ifade edildiğini gösterdi.Rekombinant rotavirüs başarılı kurtarma için, transfeksiyon ve MA104 hücreleri için kaliteli, iyi korunmuş BHKT7 hücreleri tohumlama üzerinde yanı sıra son derece saf plazmidlerin doğru miktarda kullanmak önemlidir. Bu protokol, rotavirüs NSP3 genini değiştirmek için ters genetik sisteminin nasıl kullanılacağını açıklasa da, aynı yaklaşım SP1 gibi diğer genleri değiştirmek için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

'Bioluminescent' Reporter Phage for the Detection of Category A Bacterial Pathogens

Kategori Algılama Bir Bakteriyel Patojenler &#39;Bioluminescent&#39; Muhabir Faj

Yersinia pestis and Bacillus anthracis are Category A bacterial pathogens that are the causative agents of the plague and anthrax, respectively 1. ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

A Method for Labeling Vasculature in Embryonic Mice

Embriyonik Farelerde damarları Etiketleme Bir Yöntem

The establishment of a functional blood vessel network is an essential part of organogenesis, and is required for optimal organ function. For example, in ...

Using Reverse Genetics to Manipulate the NSs Gene of the Rift Valley Fever Virus MP-12 Strain to Improve Vaccine Safety and Efficacy

Rift Vadisi Ateşi Virüsü Aşı Güvenliği ve Etkinliği Artırmak İçin MP-12 Gerinim NSS Gen işleyin Ters Genetik kullanma

Rift Valley fever virus (RVFV), which causes hemorrhagic fever, neurological disorders or blindness in humans, and a high rate abortion and fetal ...

Reverse Genetics Mediated Recovery of Infectious Murine Norovirus

Bulaşıcı Mürin Norovirüs Ters Genetik Aracılı Kurtarma

Human noroviruses are responsible for most cases of human gastroenteritis (GE) worldwide and are recurrent problem in environments where close ...

Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System

Bakülovirüs İfade Sistemi ile Novel H7N9 influenza virüs hemaglutinin Fonksiyonel rekombinant ve Neuraminidase Proteinlerin İfadesi

The baculovirus expression system is a powerful tool for expression of  recombinant proteins. Here we use it to produce correctly folded and  glycosylated ...

Using Fluorescent Proteins to Monitor Glycosome Dynamics in the African Trypanosome

Floresan Proteinleri kullanarak Afrika tripanosom içinde Glycosome Dynamics Monitör

Trypanosoma brucei is a kinetoplastid parasite that causes human African trypanosomiasis (HAT), or sleeping sickness, and a wasting disease, nagana, in ...

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Basitleştirilmiş İnsan Nötrofil Ekstrasellüler Tuzaklar (NET) İzolasyon ve Taşıma

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Intranasal Administration of Recombinant Influenza Vaccines in Chimeric Mouse Models to Study Mucosal Immunity

Kimerik fare modellerinde Rekombinant Grip aşıların burun içinde yoluyla mukozal bağışıklık Okumak

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the ...

Visualization of IL-22-expressing Lymphocytes Using Reporter Mice

Raportör fareler kullanılarak IL-22 eksprese eden lenfositlerin Görselleştirme

Reporter mice have been widely used to observe the localization of expression of targeted genes. This protocol focuses on a strategy to establish a new ...

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Sistein Thiols rekombinant proteinler Vitro siteye özgü Glikozilasyon için hedefleme

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...