Name: a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

وقد تم دعم هذا العمل من قبل مجلس العلوم الطبيعية والبحوث الهندسية في كندا، ومؤسسة كيبيك للطبيعة والتكنولوجيات، والمؤسسة الكندية للابتكار، وصناديق بدء جامعة ماكغيل.

1. إعداد الكواشف deuterated وحلول مخزون الانزيم
<ol><li>إعداد الكواشف اللازمة لتفاعلات HDX (بما في ذلك أي مخازن مؤقتة أو أملاح أو ركائز أو ليغاند، وما إلى ذلك) كحلول مخزون مركزة 100−200x في D2O (99.9٪ جزء الذرة D). قم بإعداد ما لا يقل عن 50 مل من حلول المخزون المؤقت. ملاحظة: لتوصيف HalM2، تم إعداد الحلول ال...

<ol>
	<li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules.">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li><li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function.">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li><li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamism+and+evolvability.">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li><li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).</li><li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry:+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation.">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522 (1993).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange.">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS,+CXMS,+and+disulfide+trapping.">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+performing,+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+(HDX-MS)+experiments.">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore.">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883 (2015).</li><li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy:+application+to+interleukin+1.beta.">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li><li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins.">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li><li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein.">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li><li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H/D+Exchange+Mass+Spectrometry.">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li><li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein.">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein.">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li><li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry.">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li><li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li><li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1.">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li><li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions.">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).</li><li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics.">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).</li><li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems.">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li><li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuteros:+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry.">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).</li><li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements.">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li><li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen/deuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition.">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li></ol>

يوفر سير عمل HDX-MS المعروض في هذا البروتوكول منصة قوية بشكل ملحوظ لرسم خرائط التوزيع المكاني للعناصر الديناميكية هيكليا في البروتينات والتحقيق في كيفية تغير هذه الديناميكيات استجابة للاضطرابات (الربط الرابط ، وتولد الانزيم ، وما إلى ذلك). يحمل HDX-MS العديد من المزايا المتميزة على نهج البيول?...

البروتينات هي جزيئات ديناميكية هيكليا التي عينة تشكيلات مختلفة على نطاقات زمنية تتراوح بين اهتزاز السندات على نطاق femtosecond لإعادة ترتيب مجالات البروتين بأكملها التي يمكن أن تحدث على مدى ثوان عديدة1. هذه التقلبات تشكيلية غالبا ما تكون الجوانب الحاسمة للانزيم / وظيفة البروتين. على سبيل المثال ، غالبا ما تكون التغييرات التشكيلية الناجمة عن الربط الرابط ذات أهمية حاسمة لتعديل وظيفة الإنزيم ، إما عن طريق تنظيم بقايا الموقع النشطة اللازمة للحفز ، أو تحديد مواقع ربط الركيزة في آليات حركية متسلسلة ، أو حماية الوسيطات التفاعلية من البيئة ، أو عن طريق تعديل وظيفة الإنزيم عبر شبكات allosteric. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أيضا أن ديناميات تشكيلية يمكن الحفاظ عليها في جميع أنحاء التطور، وأنه يمكن ربط الاضطرابات إلى الحركات الجزيئية المحفوظة مع التغيرات في خصوصية الركيزة وظهور وظائف إنزيم جديدة2،3.
في السنوات الأخيرة ، ظهر قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) بسرعة كتقنية قوية للتحقيق في كيفية استجابة المناظر الطبيعية المطابقة للبروتين للاضطرابات مثل الربط ليغاند أو موتاجينيسيس4،5،6،7. في تجربة HDX-MS النموذجية (الشكل 1)، يتم وضع بروتين مثير للاهتمام في المخزن المؤقت المعد في D2O ، مما يؤدي إلى استبدال البروتونات القابلة للتبادل مع الديوتيريا. سعر الصرف من moiety أميدي من السندات الببتيد يعتمد بقوة على درجة الحموضة، وتسلسل الأحماض الأمينية المحلية، وعلى البيئة الهيكلية المحلية من أميدي8. Amides التي تشارك في التفاعلات الترابط الهيدروجين (مثل تلك الموجودة في α helices وأوراق β) تبادل أبطأ من وسط في المناطق غير المنظمة من البروتين التي تتعرض للمذيبات السائبة. وبالتالي ، فإن مدى امتصاص الديوتريوم هو انعكاس لهيكل الإنزيم. ومن المتوقع أن الإنزيمات التي هي ديناميكية تشكيليا، أو التي تخضع لتحولات هيكلية على الربط ليغاند، أن تسفر عن استجابة HDX قابلة للقياس.
يظهر الأساس الميكانيكي لسعر الصرف البطيء للamide منظم في الشكل 2 5،8،9. من أجل الخضوع ل HDX ، يجب على المنطقة المنظمة أولا أن تقوم أولا بأخذ عينات عابرة من تشكيل تم الكشف عنه ، بحيث يمكن للجزيئات المذيبة التي تحفز تبادل HDX عبر آلية كيميائية حمضية / أساسية محددة ، الوصول إلى أميد القابلة للتبادل. في نهاية المطاف ، فإن المقادير النسبية لسعر الصرف الكيميائي(ككيم)ومعدلات الطي وإعادة طي (كمفتوحة وك إغلاق) تحديد معدل HDX تقاس في التجربة5،8. من هذا النموذج الحركي البسيط ، من الواضح أن مدى امتصاص الديوتريوم سيعكس الديناميكيات التوافقية الأساسية (كما يحددها kopen و kclose). يتم تنفيذ معظم التجارب HDX-MS في سير العمل من أسفل إلى أعلى حيث، بعد رد فعل تبادل، يتم هضم البروتين من الفائدة في الببتيدات ويتم قياس امتصاص الديوتريوم من قبل كل الببتيد كزيادة في كتلة7. وبهذه الطريقة ، يسمح HDX-MS بالاضطرابات لديناميكيات تشكيل الإنزيم ليتم تعيينها على النطاق المكاني المحلي للببتيدات ، مما يسمح للباحث بتقييم كيفية تغيير الاضطراب للديناميكيات في مناطق مختلفة من إنزيم الاهتمام.
مزايا نهج HDX-MS لتوضيح الديناميات الهيكلية البروتين عديدة. أولا ، يمكن تنفيذ هذه الطريقة بكميات صغيرة من البروتين الأصلي أو على مجمعات البروتين في أنظمة ذات بنية رباعية10. ليس من الضروري حتى لإعداد الانزيم المستخدمة في المقايسة أن يكون تنقية عالية11،12، طالما أن من أسفل إلى أعلى HDX - MS سير العمل يوفر عددا كافيا من الببتيدات التي تم تحديدها بثقة التي تغطي تسلسل البروتين من الفائدة. وعلاوة على ذلك، HDX-MS يمكن أن توفر معلومات عن ديناميات تشكيلية في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع العلامات البروتين موقع محدد كما يمكن استخدامها في دراسات مضان جزيء واحد13،وليس هناك حد لحجم البروتين أو البروتين المعقدة التي يمكن التحقيق فيها (مما يجعل النهج مثل الرنين المغناطيسي النووي [NMR] الطيف تحديا)7،14. وأخيرا، يمكن استخدام طرق HDX-MS التي تم حلها زمنيا لدراسة البروتينات المضطربة في جوهرها، والتي يصعب دراستها مع التصوير البلوري بالأشعة السينية15و16و17و18. القيد الرئيسي ل HDX-MS هو أن البيانات ذات دقة هيكلية منخفضة. إن بيانات HDX-MS مفيدة للإشارة إلى الأماكن التي تتغير فيها الديناميكيات التوافقية وللكشف عن التغيرات التوافقية المقترنة ، ولكنها لا توفر في كثير من الأحيان الكثير من البصيرة في الآلية الجزيئية الدقيقة التي تقود التغيير الملحوظ. وقد أظهرت التطورات الأخيرة في الجمع بين أساليب التفكك التقاط الإلكترون مع البروتين HDX-MS البيانات واعدة لرسم خرائط مواقع تبادل لبقايا الأحماض الأمينية واحد19،ولكن لا تزال هناك حاجة في كثير من الأحيان متابعة الدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية لتوفير الوضوح للنماذج الهيكلية التي أحالها HDX-MS البيانات.
أدناه، يتم تقديم بروتوكول مفصل لتطوير فحص HDX-MS20. يجب أن تنطبق بروتوكولات إعداد العينة المعروضة أدناه بشكل عام على أي بروتين يظهر قابلية جيدة للذوبان في المخازن المؤقتة المائية. تتوفر طرق إعداد عينات أكثر تخصصا وسير عمل HDX-MS للبروتينات من الحاجة إلى الفحص في وجود المنظفات أو الفوسفوليبيدات21و22و23و24. يتم وصف الإعدادات الفعالة لجمع بيانات HDX-MS لمطياف كتلة رباعي القطب عالي الدقة مقرون بنظام الكروماتوغرافيا السائلة. ويمكن جمع بيانات مماثلة التعقيد والدقة على أي واحد من عدد من نظم قياس الطيف الكروماتوغرافيا الكتلية السائلة المتاحة تجاريا. كما يتم توفير الجوانب الرئيسية لمعالجة البيانات باستخدام حزمة برامج متاحة تجاريا. كما نقدم إرشادات لجمع البيانات وتحليلها تتسق مع التوصيات التي قدمها مجتمع HDX-MSالأوسع 12. يستخدم البروتوكول الموصوف لدراسة الخصائص الهيكلية الديناميكية ل HalM2 ، وهو موالفة lanthipeptide التي تحفز نضوج متعدد الخطوات لمنتج الببتيد الطبيعي المضاد للميكروبات20. نحن نوضح كيف يمكن استخدام HDX-MS للكشف عن مواقع الربط الركيزة والخصائص التستوستيرون التي استعصت على التوصيف السابق. وقد نشرت العديد من البروتوكولات الأخرى على البروتين HDX-MS في السنوات الأخيرة25,26. وإلى جانب العمل الحالي، ينبغي أن توفر هذه المساهمات السابقة للقارئ بعض المرونة في التصميم التجريبي.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP-PNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>a2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>435767-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine-HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>SiGMA-Aldrich</td>
			<td>63068-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP Hydrochloride</td>
			<td>TRC Canada</td>
			<td>T012500</td>
			<td>peptide was synthesized upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuteros</td>
			<td>Andy M C Lau, et al</td>
			<td>version 1.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lynx 
			Global Server (PLGS)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schr&#246;dinger</td>
			<td>version 2.2.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDX Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtip pH electrode</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-620-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G2-Si</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes

قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) هو طريقة قوية لتوصيف البيوفيزيائي للتغيرات في تشكيل الإنزيم والتفاعلات بين الإنزيم والركيزة. من بين فوائده العديدة ، يستهلك HDX-MS كميات صغيرة فقط من المواد ، ويمكن إجراؤه في ظل ظروف محلية قريبة دون الحاجة إلى وضع علامات الإنزيم / الركيزة ، ويمكن أن يوفر معلومات محلولة مكانيا عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم - حتى بالنسبة للإنزيمات الكبيرة ومجمعات متعددة البروتين. يتم البدء في هذه الطريقة عن طريق تخفيف إنزيم الفائدة في المخزن المؤقت المعد في D2O. وهذا يؤدي إلى تبادل البروتيوم في السندات الببتيد amides (N-H) مع الديوتريوم (N-D). في نقاط وقت التبادل المطلوبة ، يتم إخماد تفاعل aliquots ، ويتم إعادة دمج الإنزيم في الببتيدات ، ويتم فصل الببتيدات عن طريق الكروماتوغرافيا السائلة فائقة الأداء (UPLC) ، ويتم تسجيل التغير في كتلة كل ببتيد (بسبب تبادل الهيدروجين للديوتريوم) من قبل MS. تعتمد كمية امتصاص الديوتريوم من قبل كل ببتيد بشكل كبير على بيئة الترابط الهيدروجيني المحلية لذلك الببتيد. الببتيدات الموجودة في مناطق ديناميكية جدا من الديوتريوم تبادل الانزيم بسرعة كبيرة، في حين الببتيدات المستمدة من المناطق مرتبة جيدا تخضع لتبادل ببطء أكثر من ذلك بكثير. وبهذه الطريقة، يبلغ معدل HDX عن ديناميكيات تشكيل الإنزيم المحلية. يمكن بعد ذلك استخدام الاضطرابات إلى مستويات امتصاص الديوتريوم في وجود ليغاندس مختلفة لرسم خريطة لمواقع الربط ليغاند، وتحديد شبكات allosteric، وفهم دور ديناميات تشكيلية في وظيفة الانزيم. هنا، نوضح كيف استخدمنا HDX-MS لفهم التمثيل الحيوي لنوع من المنتجات الطبيعية الببتيد يسمى lanthipeptides بشكل أفضل. اللانثيبتيدات هي الببتيدات المشفرة وراثيا التي يتم تعديلها بعد الترجمة من قبل إنزيمات كبيرة متعددة الوظائف وديناميكية تشكيلية يصعب دراستها مع نهج البيولوجيا الهيكلية التقليدية. يوفر HDX-MS منصة مثالية وقابلة للتكيف للتحقيق في الخصائص الميكانيكية لهذه الأنواع من الإنزيمات.

من الضروري تقييم نوعية الهضم البروتيوليكي وقابلية تكرار سير العمل لكل مجموعة من حقن العينة. وبالتالي ، قبل إجراء فحوصات HDX-MS ، من الضروري وضع ظروف فعالة للتحلل البروتيني للبروتين المهم ، لفصل الببتيدات باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة للمرحلة العكسية وحركة أيونات مرحلة الغاز ، والكشف عن...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide synthetases يحفز ردود الفعل متعددة الخطوات خلال التمثيل الحيوي للمنتجات الطبيعية الببتيد. هنا، ونحن نصف مستمر، من أسفل إلى أعلى، الهيدروجين الديوتريوم تبادل الطيف الكتل (HDX-MS) سير العمل التي يمكن استخدامها لدراسة الديناميات التركيبية من synthetases lanthipeptide، فضلا عن الإنزيمات المماثلة الأخرى المشاركة في التمثيل الحيوي للمنتج الطبيعي الببتيد.

منصة قياس الطيف الكتلي لتبادل الهيدروجين والديوتريوم (HDX-MS) للتحقيق في إنزيمات الببتيد التركيب الحيوي

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

حل تقارب تنقية البروتين المجمعات التي كتبها Blue الأصلية PAGE والبروتين الارتباط التنميط

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

إعداد نموذج لتحديد الهوية الجماعية على أساس قياس الطيف الكتلي للجيش الملكي النيبالي-ربط المناطق

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

الإعداد الأمثل من الفورمالين الثابتة عينات الببتيد تستند إلى مصفوفة بمساعدة الليزر التصوير مهام سير العمل الطيف الكتلي الامتزاز/التأين

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

تعريف النشاط وصي ينظم الأكسدة والاختزال في Hsp33 وتعيين التغييرات كونفورماشونال في Hsp33 باستخدام الهيدروجين الديوتريوم التبادل الكتلي

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

الكشف عن مواقع اكتشاف البروتين من قبل إثراء الببتيد وقياس الطيف الكتلي

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

توصيف وتعريف الببتيد الموضحة من قبل أنجيوتنسين الثاني

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

إعداد عينة البلازما لقياس الطيف الكتلي باستخدام محطة عمل آلية

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

إعداد عينة لمسبار Electrospray قياس الطيف الكتلي

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...