Name: a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

Dette arbejde blev støttet af Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, Canadian Foundation for Innovation og McGill University start-up fonde.

1. Fremstilling af deutererede reagenser og enzymstrømpeopløsninger
<ol><li>Forbered reagenser, der er nødvendige for HDX-reaktionerne (herunder eventuelle buffere, salte, substrater, ligands osv.) som 100−200x koncentrerede stamopløsninger i D2O (99,9% atomfraktion D). Forbered mindst 50 ml bufferlageropløsning. BEMÆRK: Til karakterisering af HalM2, Der blev fremstillet følgende opløsninger: 500 mM MgCl2,100 mM tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP), 750 mM ATP (i HEPES-buffer), 800 mM...

<ol>
	<li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules.">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li><li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function.">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li><li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamism+and+evolvability.">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li><li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).</li><li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry:+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation.">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522 (1993).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange.">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS,+CXMS,+and+disulfide+trapping.">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+performing,+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+(HDX-MS)+experiments.">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore.">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883 (2015).</li><li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy:+application+to+interleukin+1.beta.">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li><li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins.">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li><li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein.">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li><li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H/D+Exchange+Mass+Spectrometry.">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li><li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein.">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein.">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li><li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry.">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li><li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li><li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1.">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li><li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions.">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).</li><li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics.">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).</li><li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems.">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li><li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuteros:+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry.">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).</li><li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements.">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li><li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen/deuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition.">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li></ol>

HDX-MS-arbejdsgangen, der præsenteres i denne protokol, giver en bemærkelsesværdig robust platform til kortlægning af den rumlige fordeling af strukturelt dynamiske elementer i proteiner og til at undersøge, hvordan disse dynamikker ændrer sig som reaktion på forstyrrelse (ligandbinding, enzym mutagenese osv.). HDX-MS har flere forskellige fordele i forhold til andre strukturelle biologi tilgange, der er almindeligt anvendt til at undersøge kropsbygning dynamik. Mest bemærkelsesværdigt er der kun behov for små...

Proteiner er strukturelt dynamiske molekyler, der prøver forskellige konformationer på tidsskalaer, der spænder fra femtosekundsbindingsvibrationer til omlægninger af hele proteindomæner, som kan forekomme over mange sekunder1. Disse konformationelle udsving er ofte kritiske aspekter af enzym/ proteinfunktion. For eksempel er kropsbygningsændringer forårsaget af ligandbinding ofte af afgørende betydning for modulerende enzymfunktion, enten ved at organisere aktive stedrester, der er nødvendige for katalyse, definere substratbindingssteder i sekventielle kinetiske mekanismer, beskytte reaktive mellemprodukter fra miljøet eller ved at modulere enzymfunktion via allosteriske netværk. Nylige undersøgelser har også vist , at kropsbygningsdynamik kan bevares gennem hele evolutionen , og at turbationer til bevarede molekylære bevægelser kan korreleres med ændringer i substratspecifikitet og fremkomsten af nye enzymfunktioner2,3.
I de senere år har hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDX-MS) hurtigt vist sig som en kraftfuld teknik til at sonde, hvordan protein konformationelle landskaber reagerer på perturbationer såsom ligand binding eller mutagenesis4,5,6,7. I et typisk HDX-MS-eksperiment (Figur 1) anbringes et protein af interesse i buffer tilberedt i D2O, hvilket udløser udskiftning af opløsningsmiddelbyttelige protoner med deuteria. Valutakursen for peptidbindingernes midte er stærkt afhængig af pH, den lokale aminosyresekvens og af amideens lokale strukturelle miljø8. Amider, der beskæftiger sig med hydrogenbindingsinteraktioner (som dem, der er til stede i α-helices og β-sheets), udveksler langsommere end midt i ustrukturerede områder af proteinet, der udsættes for bulkopløsningsmiddel. Således er omfanget af deuteriumoptagelse en afspejling af enzymets struktur. Enzymer, der er kropsbygningsdynamiske, eller som gennemgår strukturelle overgange ved ligandbinding, forventes at give et målbart HDX-respons.
Det mekanistiske grundlag for den langsomme valutakurs for en struktureret midte fremgår af figur 25,8,9. For at kunne gennemgå HDX skal den strukturerede region først forbigående prøve en udfoldet kropsbygning, således at de opløsningsmiddelmolekyler, der katalyserer HDX-udveksling via en bestemt syre/base kemisk mekanisme, har adgang til det udskiftelige midt. I sidste ende bestemmer de relative størrelser af den kemiske valutakurs (kchem) og folde- og refoldingskurserne (kåben og ktæt) HDX-kursen målt i eksperimentet5,8. Fra denne enkle kinetiske model er det klart, at omfanget af deuteriumoptagelse vil afspejle den underliggende kropsbygningsdynamik (som defineret af kopen og kclose). De fleste HDX-MS-eksperimenter udføres i en bottom-up-arbejdsgang, hvor interesseproteinet efter udvekslingsreaktionen fordøjes til peptider, og deuteriumoptagelsen af hver peptid måles som en stigning i masse7. På denne måde tillader HDX-MS, at der kortlægges forstyrrelser af enzymens kropsbygningsdynamik på den lokale rumlige skala af peptider, hvilket gør det muligt for forskeren at vurdere, hvordan forstyrrelsen ændrer dynamikken i forskellige områder af interesseens enzym.
Fordelene ved HDX-MS-tilgangen til belysning af proteinstrukturel dynamik er talrige. For det første kan metoden udføres med små mængder indfødt protein eller på proteinkomplekser i systemer med kvartær struktur10. Det er ikke engang nødvendigt, at det enzympræparat, der anvendes ianalysen,skal være stærkt renset11,12, så længe bottom-up HDX-MS-arbejdsgangen giver et tilstrækkeligt antal selvsikkert identificerede peptider, der dækker proteinsekvensen af interesse. Desuden kan HDX-MS give oplysninger om kropsbygningsdynamik under næsten indfødte forhold uden behov for stedsspecifik proteinmærkning, som ville blive anvendt i enkeltmolekyle fluorescensundersøgelser13, og der er ingen størrelsesgrænse for protein- eller proteinkomplekset, der kan undersøges (hvilket gør tilgange som nuklear magnetisk resonans [NMR] spektroskopi udfordrende)7,14. Endelig kan tidsløste HDX-MS-metoder anvendes til at studere iboende uordnede proteiner, som er vanskelige at studere med røntgenkrystallografi15,16,17,18. Den vigtigste begrænsning af HDX-MS er, at dataene har lav strukturel opløsning. HDX-MS-data er nyttige til at pege på, hvor kropsbygningsdynamikken ændrer sig, og til at afsløre koblede kropsbygningsændringer, men de giver ikke ofte meget indsigt i den præcise molekylære mekanisme, der driver den observerede ændring. De seneste fremskridt inden for kombinationen af metoder til afkobling af elektronfangst med data fra protein-HDX-MS har vist lovende resultater med hensyn til kortlægning af udvekslingssteder for enkelt aminosyrerester19, men der er stadig ofte behov for opfølgende biokemiske og strukturelle undersøgelser for at skabe klarhed om strukturelle modeller, der fremsendes af DATA FRA HDX-MS.
Nedenfor præsenteres en detaljeret protokol for udvikling af en HDX-MS-analyse20. Nedenstående prøveforberedelsesprotokoller bør generelt gælde for ethvert protein, der udviser god opløselighed i vandige buffere. Der findes mere specialiserede prøveforberedelsesmetoder og HDX-MS-arbejdsgange for proteiner, end det er nødvendigt at analysere i nærværelse af vaskemiddel eller fosfolipider21,22,23,24. Instrumentale indstillinger for INDSAMLING AF HDX-MS-data beskrives for et firdobbelt flyvetidsspektrometer med høj opløsning koblet til flydende kromatografisystem. Der kan indsamles data af samme kompleksitet og opløsning på et hvilket som helst af en række kommercielt tilgængelige systemer til flydende kromatografi-massespektrometri (LC-MS). Der findes også nøgleaspekter af databehandlingen ved hjælp af en softwarepakke, der er kommercielt tilgængelig. Vi præsenterer også retningslinjer for dataindsamling og -analyse, der er i overensstemmelse med anbefalingerne fra det bredere HDX-MS community12. Den beskrevne protokol bruges til at studere halM2's dynamiske strukturelle egenskaber, en lanthipeptidsynetase, der katalyserer multistepmodningen af et antimikrobielt peptid naturligt produkt20. Vi illustrerer, hvordan HDX-MS kan bruges til at afsløre substratbindingssteder og allosteriske egenskaber, der har undgået tidligere karakterisering. Flere andre protokoller om protein HDX-MS er blevet offentliggjort i de seneste år25,26. Sammen med det nuværende arbejde skulle disse tidligere bidrag give læseren en vis fleksibilitet i eksperimentelt design.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP-PNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>a2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>435767-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine-HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>SiGMA-Aldrich</td>
			<td>63068-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP Hydrochloride</td>
			<td>TRC Canada</td>
			<td>T012500</td>
			<td>peptide was synthesized upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuteros</td>
			<td>Andy M C Lau, et al</td>
			<td>version 1.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lynx 
			Global Server (PLGS)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schr&#246;dinger</td>
			<td>version 2.2.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDX Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtip pH electrode</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-620-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G2-Si</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes

Hydrogen-deuterium exchange mass spektrometri (HDX-MS) er en kraftfuld metode til biofysisk karakterisering af enzymkonformationelle ændringer og enzym-substratinteraktioner. Blandt de mange fordele bruger HDX-MS kun små mængder materiale, kan udføres under næsten indfødte forhold uden behov for enzym/ substratmærkning og kan give rumligt løst information om enzymkonformationsdynamik – selv for store enzymer og multiproteinkomplekser. Metoden indledes ved fortynding af etzymet af interesse i buffer tilberedt i D2O. Dette udløser udveksling af protium i peptidbinding midt (N-H) med deuterium (N-D). På de ønskede udvekslingstidspunkter slukkes reaktions-aliquots, enzymet proteolyzed i peptider, peptider adskilles af ultra-performance væskekromatografi (UPLC), og ændringen i massen af hver peptid (på grund af udveksling af brint til deuterium) registreres af MS. Mængden af deuterium optagelse af hver peptid er stærkt afhængig af den lokale brint limning miljø af denne peptid. Peptider, der er til stede i meget dynamiske områder af enzymet, udveksler deuterium meget hurtigt, mens peptider fra velordnede regioner udveksles meget langsommere. På denne måde rapporterer HDX-hastigheden om lokal enzymformationsdynamik. Perturbationer til deuteriumoptagelsesniveauer i nærværelse af forskellige ligands kan derefter bruges til at kortlægge ligandbindingssteder, identificere allosteriske netværk og til at forstå konformationsdynamikkens rolle i enzymfunktion. Her illustrerer vi, hvordan vi har brugt HDX-MS til bedre at forstå biosyntesen af en type peptid naturlige produkter kaldet lanthipeptider. Lanthipeptider er genetisk kodede peptider, der er postoversættelsesmæssigt modificeret af store, multifunktionelle, kropsbygningsdynamiske enzymer, der er vanskelige at studere med traditionelle strukturelle biologi tilgange. HDX-MS er en ideel og fleksibel platform til undersøgelse af disse typer enzymers mekanistiske egenskaber.

Det er nødvendigt at vurdere kvaliteten af den proteolytiske fordøjelse og reproducerbarheden af arbejdsgangen for hvert sæt prøveinjektioner. Før der udføres HDX-MS-assays, er det således vigtigt at etablere effektive betingelser for proteolyse af det protein, der er af interesse, for adskillelse af peptider ved hjælp af omvendt fase flydende kromatografi og gasfaseionmobilitet og til påvisning af peptider ved hjælp af MS. Med henblik herpå bør referenceprøverne for det pågældende protein (indsamlet uden ...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptide synthetases katalyserer multistep reaktioner under biosyntesen af peptid naturlige produkter. Her beskriver vi en kontinuerlig, bottom-up, hydrogen-deuterium udveksling massespektrometri (HDX-MS) workflow, der kan anvendes til at studere kropsbygning dynamik lanthipeptid synthetaser, samt andre lignende enzymer involveret i peptid naturlige produkt biosyntese.

En platform for hydrogendeuteriumudvekslingsmassespektrometri (HDX-MS) til undersøgelse af peptidbiosyntetiske enzymer

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Løsning affinitetsrensede proteinkomplekser ved Blå Native PAGE og protein Korrelation Profilering

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolation for Kvantitativ massespektrometri Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Prøveforberedelse til massespektrometri-baseret identifikation af RNA-bindende regioner

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimal forberedelse af Formalin fast prøver for peptid baseret Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation massespektrometri Imaging arbejdsprocesser

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Definere Hsp33's Redox-regulerede anstandsdame aktivitet og kortlægning konformationelle ændringer på Hsp33 ved hjælp af brint-deuterium Exchange massespektrometri

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Påvisning af proteinubiquitinationssteder ved peptidberigelse og massespektrometri

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid profilering og identifikation illustreret af angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

En forberedelse til plasmaprøve til massespektrometri ved hjælp af en automatiseret arbejdsstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Prøve forberedelse til Sonde Elektrospray Ionization Mass Spektrometri

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...