Name: a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

Diese Arbeit wurde vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada, dem Fonds de Recherche du Quebec Nature et Technologie, der Canadian Foundation for Innovation und den Start-up-Fonds der McGill University unterstützt.

1. Herstellung von deuterated Reagenzien und Enzymstofflösungen
<ol><li>Bereiten Sie Reagenzien für die HDX-Reaktionen (einschließlich pufferr, Salze, Substrate, Liganden usw.) als 100-200-fache konzentrierte Stofflösungen in D2O (99,9% Atomfraktion D) vor. Bereiten Sie mindestens 50 ml Pufferlagerlösung vor. HINWEIS: Für die Charakterisierung von HalM2 wurden folgende Lösungen vorbereitet: 500 mM MgCl2, 100 mM Tris (2-Carboxyethyl)phosphin (TCEP), 750 mM ATP (in HEPES-Puffer), 800 mM HE...

<ol>
	<li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules.">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li><li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function.">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li><li>Tokuriki, N., Tawfik, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry:+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation.">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522 (1993).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. 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L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+performing,+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+(HDX-MS)+experiments.">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore.">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883 (2015).</li><li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy:+application+to+interleukin+1.beta.">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li><li>Balasubramaniam, D., Komives, E. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H/D+Exchange+Mass+Spectrometry.">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li><li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein.">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li><li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1.">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li><li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions.">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).</li><li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics.">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).</li><li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems.">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li><li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuteros:+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry.">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).</li><li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements.">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li><li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen/deuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition.">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li></ol>

Der in diesem Protokoll vorgestellte HDX-MS-Workflow bietet eine bemerkenswert robuste Plattform zur Kartierung der räumlichen Verteilung strukturdynamischer Elemente in Proteinen und zur Untersuchung, wie sich diese Dynamik als Reaktion auf Störungen (Ligandenbindung, Enzym-Mutagenese usw.) ändert. HDX-MS bietet mehrere deutliche Vorteile gegenüber anderen strukturbiologischen Ansätzen, die häufig zur Untersuchung der Konformationsdynamik verwendet werden. Vor allem werden nur geringe Mengen Aniis benötigt. Mithi...

Proteine sind strukturell dynamische Moleküle, die verschiedene Konformationen auf Zeitskalen abtasten, die von Bindungsschwingungen im Femtosekundenmaßstab bis hin zu Umlagerungen ganzer Proteindomänen reichen, die über viele Sekunden auftreten können1. Diese Konformationsschwankungen sind oft kritische Aspekte der Enzym-/Proteinfunktion. So sind beispielsweise konforme Veränderungen, die durch Ligandenbindung induziert werden, oft von entscheidender Bedeutung für die Modulation der Enzymfunktion, entweder durch die Organisation aktiver Standortrückstände, die für die Katalyse benötigt werden, die Definition von Substratbindungsstellen in sequenziellen kinetischen Mechanismen, die Abschirmung reaktiver Zwischenprodukte von der Umgebung oder durch Modulation der Enzymfunktion über allosterische Netzwerke. Jüngste Studien haben auch gezeigt, dass die konforme Dynamik während der gesamten Evolution konserviert werden kann und dass Störungen zu konservierten molekularen Bewegungen mit Veränderungen der Substratspezifität und der Entstehung neuer Enzymfunktionenkorreliertwerden können 2,3.
In den letzten Jahren hat sich die Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) schnell als eine leistungsstarke Technik entwickelt, um zu untersuchen, wie Proteinkonformationslandschaften auf Störungen wie Ligandenbindung oder Mutagenese4,5,6,7reagieren. In einem typischen HDX-MS-Experiment (Abbildung 1) wird ein inD2O hergestelltes Protein in einen Puffer gegeben, der den Austausch von lösungsmittelaustauschbaren Protonen durch Deuteria auslöst. Die Wechselkursrate der Amid-Feuchtigkeit der Peptidbindungen hängt stark vom pH-Wert, der lokalen Aminosäuresequenz und der lokalen strukturellen Umgebung des Amids8ab. Amide, die mit Wasserstoffbindungswechselwirkungen (wie sie in α-Helices und β-Blättern vorhanden sind) tätig sind, tauschen sich langsamer aus als Amide in unstrukturierten Regionen des Proteins, die Massenlösungsmitteln ausgesetzt sind. Somit spiegelt das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die Struktur des Enzyms wider. Enzyme, die konform dynamisch sind oder bei Ligandenbindung strukturelle Übergänge durchlaufen, würden eine messbare HDX-Antwort liefern.
Die mechanistische Grundlage für den langsamen Wechselkurs eines strukturierten Amids ist in Abbildung 25,8,9dargestellt. Um HDX zu durchlaufen, muss der strukturierte Bereich zunächst eine entfaltete Konformation vorübergehend abtasten, so dass die Lösungsmittelmoleküle, die den HDX-Austausch über einen bestimmten säure-basenchemischen Mechanismus katalysieren, Zugang zum austauschbaren Amid haben. Letztlich bestimmen die relativen Größen des chemischen Wechselkurses (kchem) und die Falt- und Umfaltraten (koffen und kschließen) die im ExperimentgemesseneHDX-Rate 5,8. Aus diesem einfachen kinetischen Modell geht klar hervor, dass das Ausmaß der Deuteriumaufnahme die zugrunde liegende Konformationsdynamik widerspiegelt (wie definiert durch koffen und kclose). Die meisten HDX-MS-Experimente werden in einem Bottom-up-Workflow durchgeführt, bei dem nach der Austauschreaktion das von Interesse kommende Protein in Peptide verdaut wird und die Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid als Erhöhung der Masse7gemessen wird. Auf diese Weise ermöglicht HDX-MS die Zuordnung von Störungen der Enzym-Konformationsdynamik auf der lokalen räumlichen Skala von Peptiden, sodass der Forscher beurteilen kann, wie die Störung die Dynamik in verschiedenen Regionen des Enzyms von Interesse verändert.
Die Vorteile des HDX-MS-Ansatzes zur Aufklärung der Proteinstrukturdynamik sind zahlreich. Zunächst kann die Methode mit kleinen Mengen an nativem Protein oder auf Proteinkomplexen in Systemen mit quartärer Struktur10durchgeführt werden. Es ist nicht einmal notwendig, dass die im Test verwendete Enzympräparation hochgereinigt wird11,12, solange der Bottom-up-HDX-MS-Workflow eine ausreichende Anzahl von sicher identifizierten Peptiden bietet, die die Proteinsequenz von Interesse abdecken. Darüber hinaus kann HDX-MS Informationen über konforme Dynamiken unter nahezu nativen Bedingungen bereitstellen, ohne dass eine standortspezifische Proteinkennzeichnung erforderlich ist, wie sie in Einzelmolekülfluoreszenzstudien13verwendet würde, und es gibt keine Größenbeschränkung für den Protein- oder Proteinkomplex, die untersucht werden kann (was Ansätze wie Kernspinresonanz [NMR] Spektroskopie schwierig macht)7,14. Schließlich können zeitaufgelöste HDX-MS-Methoden eingesetzt werden, um intrinsisch ungeordnete Proteine zu untersuchen, die mit Röntgenkristallographie15,16,17,18schwer zu untersuchen sind. Die Hauptbeschränkung von HDX-MS ist, dass die Daten von geringer struktureller Auflösung sind. HDX-MS-Daten sind nützlich, um darauf hinzuweisen, wo sich die Konformationsdynamik ändert, und um gekoppelte Konformationsänderungen aufzudecken, aber sie bieten oft nicht viel Einblick in den genauen molekularen Mechanismus, der die beobachtete Veränderung antreibt. Jüngste Fortschritte in der Kombination von Elektronenfang-Dissoziationsmethoden mit Protein-HDX-MS-Daten haben gezeigt, dass Austauschstellen zu einzelnen Aminosäurerückständen19zugeordnet werden können, aber nachfolgende biochemische und strukturelle Studien sind immer noch häufig erforderlich, um Klarheit für Strukturmodelle zu schaffen, die von HDX-MS-Daten übermittelt werden.
Nachfolgend wird ein detailliertes Protokoll für die Entwicklung eines HDX-MS-Assays vorgestellt20. Die nachstehend vorgestellten Probenvorbereitungsprotokolle sollten allgemein für jedes Protein gelten, das eine gute Löslichkeit in wässrigen Puffern aufweist. Speziellere Probenvorbereitungsmethoden und HDX-MS-Workflows stehen für Proteine zur Verfügung, als in Gegenwart von Waschmitteln oder Phospholipiden21,22,23,24untersucht werden müssen. Instrumentale Einstellungen für die HDX-MS-Datenerfassung werden für ein hochauflösendes Quadrupol-Massenspektrometer beschrieben, das an das Flüssigchromatographiesystem gekoppelt ist. Daten von ähnlicher Komplexität und Auflösung könnten auf einem der handelsüblichen Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie-Systeme (LC-MS) gesammelt werden. Wichtige Aspekte der Datenverarbeitung mit einem kommerziell erhältlichen Softwarepaket werden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Wir stellen auch Richtlinien für die Datenerhebung und -analyse vor, die mit den Empfehlungen der breiteren HDX-MS-Community12übereinstimmen. Das beschriebene Protokoll wird verwendet, um die dynamischen strukturellen Eigenschaften von HalM2 zu untersuchen, einer Lanthipeptid-Synthetase, die die mehrstufige Reifung eines antimikrobiellen Peptids20katalysiert. Wir veranschaulichen, wie HDX-MS verwendet werden kann, um Substratbindungsstellen und allosterische Eigenschaften aufzudecken, die einer vorherigen Charakterisierung entgangen sind. Mehrere andere Protokolle zum Protein HDX-MS wurden in den letzten Jahren veröffentlicht25,26. Zusammen mit der vorliegenden Arbeit sollten diese früheren Beiträge dem Leser eine gewisse Flexibilität im experimentellen Design bieten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP-PNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>a2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>435767-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine-HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>SiGMA-Aldrich</td>
			<td>63068-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP Hydrochloride</td>
			<td>TRC Canada</td>
			<td>T012500</td>
			<td>peptide was synthesized upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuteros</td>
			<td>Andy M C Lau, et al</td>
			<td>version 1.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lynx 
			Global Server (PLGS)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schr&#246;dinger</td>
			<td>version 2.2.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDX Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtip pH electrode</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-620-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G2-Si</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes

Die Wasserstoff-Deuterium-Austauschmassenspektrometrie (HDX-MS) ist eine leistungsfähige Methode zur biophysikalischen Charakterisierung von Enzymkonformationsveränderungen und Enzym-Substrat-Wechselwirkungen. Unter seinen vielen Vorteilen verbraucht HDX-MS nur geringe Mengen an Material, kann unter nahezu nativen Bedingungen ohne Enzym-/Substratkennzeichnung durchgeführt werden und kann räumlich aufgelöste Informationen über Enzymkonformationsdynamik liefern – auch für große Enzyme und Multiproteinkomplexe. Die Methode wird durch die Verdünnung des enzyms von Interesse in Puffer inD2O vorbereitet initiiert. Dies löst den Austausch von Protium in Peptidbindungsamiden (N-H) mit Deuterium (N-D) aus. An den gewünschten Austauschzeitpunkten werden Reaktions-Aliquots abgeschreckt, das Enzym in Peptide proteolysiert, die Peptide durch ultra-performance liquid chromatography (UPLC) getrennt und die Veränderung der Masse jedes Peptids (aufgrund des Austauschs von Wasserstoff gegen Deuterium) wird von MS aufgezeichnet. Die Menge der Deuteriumaufnahme durch jedes Peptid hängt stark von der lokalen Wasserstoffbindungsumgebung dieses Peptids ab. Peptide, die in sehr dynamischen Regionen des Enzymaustauschdeuteriums sehr schnell vorhanden sind, während Peptide aus gut geordneten Regionen viel langsamer austauschen. Auf diese Weise berichtet die HDX-Rate über die lokale Enzymkonformationsdynamik. Störungen der Deuteriumaufnahme in Gegenwart verschiedener Liganden können dann verwendet werden, um Ligandenbindungsstellen zu kartieren, allosterische Netzwerke zu identifizieren und die Rolle der Konformationsdynamik in der Enzymfunktion zu verstehen. Hier veranschaulichen wir, wie wir HDX-MS verwendet haben, um die Biosynthese einer Art von Peptid-Naturprodukten namens Lanthipeptide besser zu verstehen. Lanthipeptide sind genetisch kodierte Peptide, die posttranslational durch große, multifunktionale, konformational dynamische Enzyme modifiziert werden, die mit traditionellen strukturbiologischen Ansätzen schwer zu studieren sind. HDX-MS bietet eine ideale und anpassungsfähige Plattform zur Untersuchung der mechanistischen Eigenschaften dieser Enzymtypen.

Es ist notwendig, die Qualität der proteolytischen Verdauung und die Reproduzierbarkeit des Workflows für jeden Satz von Probeninjektionen zu bewerten. Daher ist es vor der Durchführung von HDX-MS-Assays wichtig, wirksame Bedingungen für die Proteolyse des Proteins von Interesse, für die Trennung von Peptiden mittels Reverse-Phase-Flüssigkeitschromatographie und Gasphasenionenmobilität sowie für den Nachweis von Peptiden mit MS zu schaffen. Zu diesem Zweck sollten zunächst die Referenzproben für das Protein von...

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A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Lanthipeptid-Synthetasen katalysieren mehrstufige Reaktionen während der Biosynthese von Peptid-Naturprodukten. Hier beschreiben wir einen kontinuierlichen, Bottom-up, Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie (HDX-MS) Workflow, der verwendet werden kann, um die Konformationsdynamik von Lanthipeptid-Synthetasen zu studieren, sowie andere ähnliche Enzyme, die an der Peptid-Naturproduktbiosynthese beteiligt sind.

Eine Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie -Plattform (HDX-MS) zur Untersuchung biosynthetischer Peptidenzyme

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Forschung

Biochemie

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

Auflösen von Affinity Purified Protein-Komplexen von Blue native PAGE und Protein Correlation Profilieren

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Lipid Droplet Isolierung für die quantitative Massenspektrometrie-Analyse

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

Probenvorbereitung für Masse Spektrometrie-basierte Identifikation der RNA-bindende Regionen

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

Optimale Vorbereitung von Formalin fixiert Proben für Peptid-Matrix basierten Assisted Laser Desorption/Ionisierung Massenspektrometrie Imaging-Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

Nachweis von Protein-Ubiquitinationsstellen durch Peptidanreicherung und Massenspektrometrie

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

Nitropeptid Profilierung und Identifikation illustriert von Angiotensin II

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

Eine Plasma-Probenvorbereitung für die Massenspektrometrie mit einer automatisierten Workstation

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Probenvorbereitung für Probe Elektrospray-Ionen-Massenspektrometrie

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...