Name: a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes
Uploaded: 2020-05-04T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי המועצה לחקר מדעי הטבע וההנדסה של קנדה, פונדס דה Recherche du Quebec Nature et Technologie, הקרן הקנדית לחדשנות, וקרנות הזימון של אוניברסיטת מקגיל.

1. הכנת ריאגנטים מנווטים ופתרונות מלאי אנזימים
<ol><li>הכן ריאגנטים הדרושים לתגובות HDX (כולל כל מאגרים, מלחים, מצעים, ליגנדים וכו ') כפתרונות מלאי מרוכזים 100-200x ב- D2O (99.9% שבר אטום D). הכן לפחות 50 מ"ל של פתרון מלאי מאגר. הערה: לאפיון HalM2, הפתרונות הבאים הוכנו: 500 mM MgCl2, 100 מ"מ טריס (2-קרבוקסית?...

<ol>
	<li>Karplus, M., McCammon, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dynamics+simulations+of+biomolecules.">Molecular dynamics simulations of biomolecules.</a> Nature Structural &amp; Molecular Biology. 9 (9), 646-652 (2002).</li><li>Campbell, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+protein+dynamics+in+the+evolution+of+new+enzyme+function.">The role of protein dynamics in the evolution of new enzyme function.</a> Nature Chemical Biology. 12 (11), 944-950 (2016).</li><li>Tokuriki, N., Tawfik, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+dynamism+and+evolvability.">Protein dynamism and evolvability.</a> Science. 324 (5924), 203-207 (2009).</li><li>Wales, T. E., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+the+analysis+of+protein+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics.</a> Mass Spectrometry Reviews. 25 (1), 158-170 (2006).</li><li>Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen+exchange+mass+spectrometry+for+studying+protein+structure+and+dynamics.">Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics.</a> Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224 (2011).</li><li>Katta, V., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+changes+in+proteins+probed+by+hydrogen-exchange+electrospray-ionization+mass+spectrometry.">Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 5 (4), 214 (1991).</li><li>Zhang, Z., Smith, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+amide+hydrogen+exchange+by+mass+spectrometry:+a+new+tool+for+protein+structure+elucidation.">Determination of amide hydrogen exchange by mass spectrometry: a new tool for protein structure elucidation.</a> Protein Science. 2 (4), 522 (1993).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+structure+effects+on+peptide+group+hydrogen+exchange.">Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange.</a> Proteins. 17 (1), 75-86 (1993).</li><li>Xiao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revealing+the+architecture+of+protein+complexes+by+an+orthogonal+approach+combining+HDXMS,+CXMS,+and+disulfide+trapping.">Revealing the architecture of protein complexes by an orthogonal approach combining HDXMS, CXMS, and disulfide trapping.</a> Nature Protocols. 13 (6), 1403-1428 (2018).</li><li>Smith, D. L., Deng, Y., Zhang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+the+non-covalent+structure+of+proteins+by+amide+hydrogen+exchange+and+mass+spectrometry.">Probing the non-covalent structure of proteins by amide hydrogen exchange and mass spectrometry.</a> Journal of Mass Spectrometry. 32 (2), 135-146 (1997).</li><li>Masson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recommendations+for+performing,+interpreting+and+reporting+hydrogen+deuterium+exchange+mass+spectrometry+(HDX-MS)+experiments.">Recommendations for performing, interpreting and reporting hydrogen deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) experiments.</a> Nature Methods. 16 (7), 595-602 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Site-Specific+Method+for+Irreversible+Covalent+Labeling+of+Proteins+with+a+Fluorophore.">An Efficient Site-Specific Method for Irreversible Covalent Labeling of Proteins with a Fluorophore.</a> Scientific Reports. 5, 16883 (2015).</li><li>Marion, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+the+overlap+problem+in+the+assignment+of+proton+NMR+spectra+of+larger+proteins+by+use+of+three-dimensional+heteronuclear+proton-nitrogen-15+Hartmann-Hahn-multiple+quantum+coherence+and+nuclear+Overhauser-multiple+quantum+coherence+spectroscopy:+application+to+interleukin+1.beta.">Overcoming the overlap problem in the assignment of proton NMR spectra of larger proteins by use of three-dimensional heteronuclear proton-nitrogen-15 Hartmann-Hahn-multiple quantum coherence and nuclear Overhauser-multiple quantum coherence spectroscopy: application to interleukin 1.beta.</a> Biochemistry. 28 (15), 6150-6156 (1989).</li><li>Balasubramaniam, D., Komives, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen-exchange+mass+spectrometry+for+the+study+of+intrinsic+disorder+in+proteins.">Hydrogen-exchange mass spectrometry for the study of intrinsic disorder in proteins.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1834 (6), 1202-1209 (2013).</li><li>Goswami, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time+window+expansion+for+HDX+analysis+of+an+intrinsically+disordered+protein.">Time window expansion for HDX analysis of an intrinsically disordered protein.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (10), 1584-1592 (2013).</li><li>Keppel, T. R., Howard, B. A., Weis, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+Unstructured+Regions+and+Synergistic+Folding+in+Intrinsically+Disordered+Proteins+with+Amide+H/D+Exchange+Mass+Spectrometry.">Mapping Unstructured Regions and Synergistic Folding in Intrinsically Disordered Proteins with Amide H/D Exchange Mass Spectrometry.</a> Biochemistry. 50 (40), 8722-8732 (2011).</li><li>Mitchell, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Characterization+and+Conformational+Analysis+of+the+Herpesvirus+saimiri+Tip-C484+Protein.">Functional Characterization and Conformational Analysis of the Herpesvirus saimiri Tip-C484 Protein.</a> Journal of Molecular Biology. 366 (4), 1282-1293 (2007).</li><li>Pan, J., Han, J., Borchers, C. H., Konermann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+with+top-down+electron+capture+dissociation+for+characterizing+structural+transitions+of+a+17+kDa+protein.">Hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry with top-down electron capture dissociation for characterizing structural transitions of a 17 kDa protein.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (35), 12801-12808 (2009).</li><li>Habibi, Y., Uggowitzer, K. A., Issak, H., Thibodeaux, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+Dynamic+Structural+Properties+of+a+Lanthipeptide+Synthetase+using+Hydrogen-Deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry.">Insights into the Dynamic Structural Properties of a Lanthipeptide Synthetase using Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry.</a> Journal of the American Chemical Society. 141 (37), 14661-14672 (2019).</li><li>Hebling, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+analysis+of+membrane+proteins+in+phospholipid+bilayer+nanodiscs+by+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Conformational analysis of membrane proteins in phospholipid bilayer nanodiscs by hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Analytical Chemistry. 82 (13), 5415-5419 (2010).</li><li>Duc, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effective+application+of+bicelles+for+conformational+analysis+of+G+protein-coupled+receptors+by+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry.">Effective application of bicelles for conformational analysis of G protein-coupled receptors by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 26 (5), 808-817 (2015).</li><li>Canul-Tec, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+allosteric+inhibition+of+excitatory+amino+acid+transporter+1.">Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1.</a> Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).</li><li>Reading, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interrogating+Membrane+Protein+Conformational+Dynamics+within+Native+Lipid+Compositions.">Interrogating Membrane Protein Conformational Dynamics within Native Lipid Compositions.</a> Angewandte Chemie International Edition. 56 (49), 15654-15657 (2017).</li><li>Hentze, N., Mayer, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+protein+dynamics+using+hydrogen+exchange+mass+spectrometry.">Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (81), e50839 (2013).</li><li>Lento, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-resolved+ElectroSpray+Ionization+Hydrogen-deuterium+Exchange+Mass+Spectrometry+for+Studying+Protein+Structure+and+Dynamics.">Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics.</a> Journal of Visualized Experiments. (122), e55464 (2017).</li><li>Schowen, K. B., Schowen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solvent+isotope+effects+on+enzyme+systems.">Solvent isotope effects on enzyme systems.</a> Methods in Enzymology. 87, 551-606 (1982).</li><li>Lau, A. M. C., Ahdash, Z., Martens, C., Politis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deuteros:+software+for+rapid+analysis+and+visualization+of+data+from+differential+hydrogen+deuterium+exchange-mass+spectrometry.">Deuteros: software for rapid analysis and visualization of data from differential hydrogen deuterium exchange-mass spectrometry.</a> Bioinformatics. 35 (7), 3171-3173 (2019).</li><li>Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+utility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+in+biopharmaceutical+comparability+studies.">The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies.</a> Journal of Pharmaceutical Sciences. 100 (6), 2071 (2011).</li><li>Burkitt, W., O'Connor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+the+repeatability+and+reproducibility+of+hydrogen/deuterium+exchange+mass+spectrometry+measurements.">Assessment of the repeatability and reproducibility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry measurements.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 22 (23), 3893-3901 (2008).</li><li>Rob, T., Gill, P. K., Golemi-Kotra, D., Wilson, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+electrospray+ms-coupled+microfluidic+device+for+sub-second+hydrogen/deuterium+exchange+pulse-labelling+reveals+allosteric+effects+in+enzyme+inhibition.">An electrospray ms-coupled microfluidic device for sub-second hydrogen/deuterium exchange pulse-labelling reveals allosteric effects in enzyme inhibition.</a> Lab on a Chip. 13, 2528-2532 (2013).</li></ol>

זרימת העבודה HDX-MS המוצגת בפרוטוקול זה מספקת פלטפורמה איתנה להפליא למיפוי ההתפלגות המרחבית של אלמנטים דינמיים מבנית בחלבונים ולחקור כיצד דינמיקות אלה משתנות בתגובה לטריאבינציה (קשירה ליגנד, מוטגנזיס אנזים וכו '). HDX-MS מחזיק במספר יתרונות ברורים על פני גישות ביולוגיות מבניות אחרות המשמשות ב...

חלבונים הם מולקולות דינמיות מבחינה מבנית המדגמות קונפורמציות שונות על סולמות זמן החל רטט קשר בקנה מידה femtosecond כדי סידור מחדש של תחומי חלבון שלמים אשר יכול להתרחש על פני שניות רבות1. תנודות קונפורמיות אלה הן לעתים קרובות היבטים קריטיים של תפקוד האנזים/חלבון. לדוגמה, שינויים קונפורמיים הנגרמים על ידי קשירה ליגנד הם לעתים קרובות חשובים ביותר עבור מידול תפקוד האנזים, או על ידי ארגון שאריות אתר פעיל הדרושות לקטליזה, הגדרת אתרי איגוד מצע במנגנונים קינטיים רציפים, הגנה על ביניים תגובתיים מהסביבה, או על ידי היפוך פונקציית האנזים באמצעות רשתות allosteric. מחקרים שנעשו לאחרונה הראו גם כי ניתן לשמר דינמיקה קונפורמטיבית לאורך האבולוציה וכי הפרעה לתנועות מולקולריות שמורות יכולה להיות מתואמת עם שינויים בספציפיות המצע והופעתם של פונקציות אנזים חדשות2,3.
בשנים האחרונות, ספקטרומטריית מסה חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) התפתחה במהירות כטכניקה רבת עוצמה כדי לחקור כיצד נופים קונפורמיים של חלבונים מגיבים להפרעות כגון קשירה ליגנד או mutagenesis4,5,6,7. בניסוי HDX-MS טיפוסי (איור 1), חלבון בעל עניין מוכנן למאגר שהוכן ב- D2O, אשר מפעיל החלפת פרוטונים הניתנים להחלפה בממס עם דוטריה. שער החליפין של ה- amide moiety של איגרות החוב פפטיד תלוי מאוד ב- pH, ברצף חומצות האמינו המקומיות ובסביבה המבנית המקומית של אמיד8. בין אלה העוסקים אינטראקציות מליטה מימן (כגון אלה הנוכחים α-helices ו β-sheets) להחליף לאט יותר מאשר בין באזורים לא מובנים של החלבון החשופים ממס בתפזורת. לכן, היקף ספיגת דיטריום הוא השתקפות של המבנה של האנזים. אנזימים דינמיים קונפורמיים, או העוברים מעברים מבניים על קשירה ליגנד, צפויים להניב תגובת HDX מדידה.
הבסיס המכניסטי לשער החליפין האיטי של אמיד מובנה מוצג באיור 25,8,9. על מנת לעבור HDX, האזור המובנה חייב תחילה לטעום באופן ארעי קונפורמציה נפרשת, כך מולקולות ממס לזרז חילופי HDX באמצעות חומצה ספציפית / מנגנון כימי בסיס, יש גישה אמיד להחלפה. בסופו של דבר, סדרי הגודל היחסיים של שער החליפין הכימי (kchem) ושיעורי הקיפול והקיפול מחדש (kopen ו- kclose) קובעים את שער ה- HDX הנמדד בניסוי5,8. ממודל קינטי פשוט זה, ברור כי היקף ספיגת הדיטריום ישקף את הדינמיקה הקונפורמציונית הבסיסית (כהגדרתה על ידי kopen ו- kclose). רוב הניסויים HDX-MS מבוצעים בזרימת עבודה מלמטה למעלה שבו, בעקבות תגובת ההחלפה, החלבון של עניין מתעכל לתוך פפטידים ואת ספיגת דיטריום על ידי כל פפטיד נמדד כמו עלייה במסה7. בדרך זו, HDX-MS מאפשר הפרעה דינמיקה קונפורמציה אנזים להיות ממופה בסולם המרחבי המקומי של פפטידים, המאפשר לחוקר להעריך כיצד הפרעה משנה את הדינמיקה באזורים שונים של האנזים של עניין.
היתרונות של גישת HDX-MS להבהרת הדינמיקה המבנית של החלבון הם רבים. ראשית, השיטה יכולה להתבצע עם כמויות קטנות של חלבון מקומי או על קומפלקסים חלבון במערכות עם מבנה quaternary10. זה אפילו לא הכרחי עבור הכנת האנזים המשמש ב assay להיות מטוהרים מאוד11,12, כל עוד זרימת העבודה HDX-MS מלמטה למעלה מספק מספר מספיק של פפטידים מזוהים בביטחון המכסים את רצף החלבון של עניין. יתר על כן, HDX-MS יכול לספק מידע על דינמיקה קונפורמטיבית בתנאים כמעט מקומיים ללא צורך בתיוג חלבון ספציפי לאתר כפי שהיה משמש במחקרי פלואורסצנטיות מולקולה אחת13, ואין מגבלת גודל למתחם החלבון או החלבון שניתן לחקור (מה שהופך גישות כגון תהודה מגנטית גרעינית [NMR] ספקטרוסקופיה מאתגרת)7,14. לבסוף, ניתן להציע שיטות HDX-MS שנפתרו בזמן כדי ללמוד חלבונים עם הפרעות מהותיות, שקשה ללמוד עם קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן15,16,17,18. המגבלה העיקרית של HDX-MS היא שהנתונים הם ברזולוציה מבנית נמוכה. נתוני HDX-MS שימושיים לצביעה על המקום שבו הדינמיקה הקונפורמית משתנה ולחשוף שינויים קונפורמיים מצמדים, אך לעתים קרובות הם אינם מספקים תובנה רבה לגבי המנגנון המולקולרי המדויק המניע את השינוי שנצפה. ההתקדמות האחרונה בשילוב של שיטות דיסוציאציה לכידת אלקטרונים עם נתוני HDX-MS חלבון הראו הבטחה למיפוי אתרי חילופי שאריות חומצת אמינו יחיד19, אבל מעקב אחר מחקרים ביוכימיים ומבניים עדיין נדרשים לעתים קרובות כדי לספק בהירות מודלים מבניים שהועברו על ידי נתוני HDX-MS.
להלן, פרוטוקול מפורט לפיתוח של HDX-MS assay מוצג20. פרוטוקולי ההכנה לדוגמה המוצגים להלן צריכים להיות רלוונטיים בדרך כלל לכל חלבון המציג מסיסות טובה במאגרים מימיים. שיטות הכנה מדגם מיוחדות יותר ותהליכי עבודה HDX-MS זמינים עבור חלבונים מאשר צריך להיות assayed בנוכחות חומר ניקוי או פוספוליפידים21,22,23,24. הגדרות אינסטרומנטליות לאיסוף נתונים HDX-MS מתוארות עבור ספקטרומטר מסה מרובע ברזולוציה גבוהה בשילוב למערכת כרומטוגרפיה נוזלית. נתונים של מורכבות ורזולוציה דומים ניתן לאסוף על כל אחד ממספר מערכות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה-מסה נוזלית זמינה מסחרית (LC-MS). היבטים מרכזיים של עיבוד הנתונים באמצעות חבילת תוכנה זמינה מסחרית מסופקים גם כן. כמו כן, אנו מציגים קווים מנחים לאיסוף וניתוח נתונים התואמים להמלצות של קהילת HDX-MS הרחבה יותר12. הפרוטוקול המתואר משמש לחקר המאפיינים המבניים הדינמיים של HalM2, סינתטאז lanthipeptide המזרז את התבגרות רב-שלבי של מוצר טבעי פפטיד מיקרוביאלית20. אנו מדגימים כיצד ניתן להשתמש ב- HDX-MS כדי לחשוף אתרי איגוד מצע ומאפיינים אלוסטריים שחמקו מאפיון קודם. מספר פרוטוקולים אחרים על חלבון HDX-MS פורסמו בשנים האחרונות25,26. יחד עם העבודה הנוכחית, תרומות קודמות אלה אמורות לספק לקורא גמישות מסוימת בעיצוב ניסיוני.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[glu-1]-fibrinopeptide B (Glu-Fib)</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mL Amicon Ultracel 10k centrifugal filtration device (Millipore)</td>
			<td>Milipore Sigma</td>
			<td>UFC501096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>acetonitrile</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>A955-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP-PNP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>A2647-25MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>a2383-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D2O</td>
			<td>ALDRICH</td>
			<td>435767-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>formic acid</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>28905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>guanidine-HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>97063-764</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP310-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride</td>
			<td>SiGMA-Aldrich</td>
			<td>63068-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0440</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>potassium phosphate</td>
			<td>BioBasic</td>
			<td>PB0445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TCEP Hydrochloride</td>
			<td>TRC Canada</td>
			<td>T012500</td>
			<td>peptide was synthesized upon request</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Deuteros</td>
			<td>Andy M C Lau, et al</td>
			<td>version 1.08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DynamX</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MassLynx</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 4.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Lynx 
			Global Server (PLGS)</td>
			<td>Waters</td>
			<td>version 3.0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PyMOL</td>
			<td>Schr&#246;dinger</td>
			<td>version 2.2.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name of Material/ Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Instrument and equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C18 analytical Column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186002346</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC BEH C8 VanGuard Pre-column</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186003978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ACQUITY UPLC M-Class HDX System</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HDX Manager</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microtip pH electrode</td>
			<td>Thermo Fisher</td>
			<td>13-620-291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Enzymate BEH column or Pepsin solumn</td>
			<td>Waters</td>
			<td>186007233</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Waters Synapt G2-Si</td>
			<td>Waters</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (hdx-ms) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes

ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) היא שיטה רבת עוצמה לאפיון ביופיזי של שינויים קונפורמיים של אנזימים ואינטראקציות בין מצע אנזימים. בין היתרונות הרבים שלה, HDX-MS צורכת רק כמויות קטנות של חומר, יכול להתבצע בתנאים מקומיים קרובים ללא צורך תיוג אנזים / מצע, והוא יכול לספק מידע נפתרה spatially על דינמיקה קונפורמציה אנזים-אפילו עבור אנזימים גדולים קומפלקסים multiprotein. השיטה היא ביוזמת דילול של האנזים של עניין לתוך חוצץ מוכן D2O. זה מפעיל את חילופי פרוטיום ב אמיד אג"ח פפטיד (N-H) עם דיטריום (N-D). בנקודות זמן ההחלפה הרצויות, אליקוטים תגובה מרווה, האנזים הוא proteolyzed לתוך פפטידים, פפטידים מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים אולטרה (UPLC), ואת השינוי במסה של כל פפטיד (עקב חילופי מימן עבור דיטריום) נרשם על ידי טרשת נפוצה. כמות ספיגת הדיאוטריום על ידי כל פפטיד תלויה מאוד בסביבת מליטה מימן המקומית של פפטיד זה. פפטידים נוכחים באזורים דינמיים מאוד של דיטריום חילופי אנזימים במהירות רבה, ואילו פפטידים שמקורם באזורים מסודרים היטב עוברים חילופים הרבה יותר לאט. באופן זה, שיעור HDX מדווח על דינמיקה קונפורמציה אנזים מקומי. לאחר מכן ניתן להשתמש בהפרעות לרמות ספיגת הדיטריום בנוכחות ליגנדים שונים כדי למפות אתרי קשירה ליגנד, לזהות רשתות allosteric, ולהבין את התפקיד של דינמיקה קונפורמית בתפקוד האנזים. כאן, אנו ממחישים כיצד השתמשנו ב- HDX-MS כדי להבין טוב יותר את הביוסינתזה של סוג של מוצרים טבעיים פפטיד הנקרא lanthipeptides. Lanthipeptides הם פפטידים מקודדים גנטית כי הם לאחר תרגום שונה על ידי אנזימים גדולים, רב תכליתיים, דינמי קונפורמי שקשה ללמוד עם גישות ביולוגיה מבנית מסורתית. HDX-MS מספק פלטפורמה אידיאלית ומותאמת לבדיקת התכונות המכניסטיות של אנזימים מסוג זה.

יש צורך להעריך את איכות העיכול הפרוטאוליטי ואת הרבייה של זרימת העבודה עבור כל קבוצה של זריקות מדגם. לכן, לפני ביצוע מבחני HDX-MS, חיוני לקבוע תנאים יעילים לפרוטאואליזה של החלבון המעניין, להפרדת פפטידים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית פאזה הפוכה וניידות שלב גז יון, ולגילוי פפטידים באמצעות טרשת נפ?...

Watch this Scientific Journal Video about A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes at JoVE.com

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry HDX-MS Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

סינתזות Lanthipeptide לזרז תגובות מרובות צעדים במהלך הביוסינתזה של מוצרים טבעיים פפטיד. כאן, אנו מתארים רציף, מלמטה למעלה, מימן-deuterium חילופי ספקטרומטריית מסה (HDX-MS) זרימת עבודה שניתן להפעיל כדי ללמוד את הדינמיקה הקונפורמטיבית של סינתטאז lanthipeptide, כמו גם אנזימים דומים אחרים המעורבים ביוסינתזה של מוצר טבעי פפטיד.

פלטפורמת ספקטרומטריית מסה של חילופי מימן-דיטריום (HDX-MS) לבדיקת אנזימים ביוסינתטיים פפטיד

Hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) is a powerful method for the biophysical characterization of enzyme conformational changes and ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Hydrogen-Deuterium Exchange Mass Spectrometry (HDX-MS) Platform for Investigating Peptide Biosynthetic Enzymes

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

פתרון מתחמי פרוטאין טהור זיקה לפי דף Native הכחול פרופיל מתאם חלבון

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

בידוד אגל ליפידים על ניתוח כמותי ספקטרומטריית מסה

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

Sample Preparation for Mass Spectrometry-based Identification of RNA-binding Regions

הכנת הדוגמא לזיהוי מבוססי ספקטרומטר מסה של RNA-איגוד אזורים

Noncoding RNAs play important roles in several nuclear processes, including regulating gene expression, chromatin structure, and DNA repair. In most ...

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

הכנה אופטימלית של פורמלין קבוע דוגמאות עבור פפטיד מבוסס מטריקס בסיוע לייזר Desorption/יינון ספקטרומטר מסה הדמיה זרימות עבודה

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

Defining Hsp33's Redox-regulated Chaperone Activity and Mapping Conformational Changes on Hsp33 Using Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry

הגדרת פעילות מוסדר חמצון-חיזור המלווה של Hsp33 ומיפוי השינויים הסתגלותי על Hsp33 באמצעות ספקטרומטר מסה של המרת מימן-דאוטריום

Living organisms regularly need to cope with fluctuating environments during their life cycle, including changes in temperature, pH, the accumulation of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

איתור מקומות לגילוי החלבון על ידי העשרה מפפטיד וספקטרומטר מסה

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Nitropeptide Profiling and Identification Illustrated by Angiotensin II

ניטרופפטיד פרופיל וזיהוי מאויר על ידי אנגיוטנסין השני

Protein nitration is one of the most important post-translational modifications (PTM) on tyrosine residues and it can be induced by chemical actions of ...

A Plasma Sample Preparation for Mass Spectrometry using an Automated Workstation

הכנה לדגימת פלזמה לספקטרומטר מסה באמצעות תחנת עבודה אוטומטית

Sample preparation for mass spectrometry analysis in proteomics requires enzymatic cleavage of proteins into a peptide mixture. This process involves ...

Sample Preparation for Probe Electrospray Ionization Mass Spectrometry

הכנה לדוגמא לתרסיס אלקטרונון מהמוני ספקטרומטר מונמטריה

Mass spectrometry (MS) is a powerful tool in analytical chemistry because it provides very accurate information about molecules, such as mass-to-charge ...