Name: an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants
Uploaded: 2020-05-22T12:30:00
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Wir danken Dr. Brigitte Sturm für ihre Unterstützung beim ECLIA-Instrument.

Die Zulassung für die Beschaffung von Hautbiopsien zu Forschungszwecken wurde von der Human Research Ethics Committee of the Children es Hospital in Westmead, Australien, eingeholt. Die Zustimmung zu Tierversuchen erhielt das Bundesministerium für Wissenschaft, Forschung und Wirtschaft, die nach den örtlichen Tierschutzbestimmungen durchgeführt wurden (GZ: 66.009/0218-II/3b/2015).
ANMERKUNG: Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1dargestellt.
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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mild+overexpression+of+MeCP2+causes+a+progressive+neurological+disorder+in+mice.">Mild overexpression of MeCP2 causes a progressive neurological disorder in mice.</a> Human Molecular Genetics. 13 (21), 2679-2689 (2004).</li><li>Luikenhuis, S., Giacometti, E., Beard, C. F., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+MeCP2+in+postmitotic+neurons+rescues+Rett+syndrome+in+mice.">Expression of MeCP2 in postmitotic neurons rescues Rett syndrome in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (16), 6033-6038 (2004).</li></ol>

Zur Messung der endogenen MeCP2-, rekombinanten MeCP2- und TAT-MeCP2-Spiegel wurde eine 96-Well-Platte ECLIA entwickelt. Es hat sich gezeigt, dass der Verlust der MeCP2-Proteinfunktion zum RTT-Syndrom6führt, für das die Behandlung derzeit auf Symptommanagement und Physiotherapie beschränkt ist. Eine vielversprechende Behandlungsmöglichkeit ist die sogenannte Proteinersatztherapie, bei der MeCP2-Spiegel bis zu ihrer benötigten Konzentration12,,<sup class="xre...

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) basiert auf einem Verfahren, bei dem Etiketten verwendet werden, die bei elektrochemisch stimulierter Lumineszenz emittiert werden. Es ist eine allgemein anwendbare Technik für den quantitativen Nachweis biologischer Analyten in der Grundlagenindustrie und der akademischen Forschung, der Lebensmittelindustrie sowie in der klinischen Diagnostik1. Üblicherweise wird eine Einwegplatte mit Carbon-Tintenelektroden verwendet. Diese Elektroden fungieren als Festphasenträger für den Immunoassay. Ein sekundärer Antikörper wird mit einem elektrochemilumineszierenden Etikett konjugiert und wenn Strom auf das System aufgebracht wird, wird die Lichtemission des chemischen Etiketts ausgelöst. Ein ultra-low noise charge coupled device (CCD) zeichnet die Lichtintensität auf, die direkt proportional zum Antigen ist, das an den Aufnahmeantikörper gebunden ist, was zur Quantifizierung des Zielanalyten der Probe2führt. Im Vergleich zum enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA) gilt ECLIA als vorteilhaft, da es eine höhere Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit sowie eine bessere Automatisierung und Konsistenzbietet 3.
Hier analysierten wir die Methyl-CpG-Bindungsprotein-2 (MeCP2)-Spiegel in Proben menschlichen und murinen Ursprungs sowie verschiedene Varianten des rekombinanten Proteins mit dem neu entwickelten ECLIA-System. MecP2 ist ein X-verknüpftes Nukleinsäure-bindendes Protein, das bekanntermaßen mit methylierten DNA-Sequenzen interagiert. Dieses Protein ist in die Regulation der Genexpression4,5verwickelt. Funktionsverlustmutationen im Gen, die dieses Protein kodiert, sind die Hauptschuldigen, die das Rett-Syndrom (RTT), eine schwere neuroentwicklungsbedingten Störungverursachen 6. Eine weitere MeCP2-bedingte Erkrankung, das MECP2-Duplikationssyndrom, führt auch zu neurologischen Symptomen, die sich mit denen von RTT7überschneiden können. MECP2 Insbesondere sind Frauen meist von RTT betroffen, während Männer meist vom MECP2-Duplikationssyndrom 6,7betroffen sind.
Diese Störungen sind mit unzureichenden oder überschüssigen MeCP2-Spiegeln bzw. im Zentralnervensystem (ZNS) verbunden. Daher müssten Behandlungsoptionen für RTT, die eine Erhöhung des MeCP2-Spiegels im CNS beinhalten, die nachteiligen Auswirkungen im Zusammenhang mit einem Überschuss an MeCP27vermieden werden. Aufgrund dieser Tatsache ist eine hochsensible und genaue Quantifizierung des MeCP2-Proteinspiegels, wie sie vom ECLIA-System bereitgestellt wird, entscheidend für die Weiterentwicklung der RTT sowie der Forschung zum MECP2-Duplizierungssyndrom. MECP2 Die präzisen Messungen von endogenen und exogenen MeCP2-Spiegeln aus menschlichen Zelllinien und Mausgewebeproben sowie eines rekombinanten Proteins bestehend aus humanem MeCP2-Isoform B (auch bekannt als Isoform e1) und einer minimalen N-terminalen HIV-TAT-Transduktionsdomäne (TAT-MeCP2), die das Potenzial hat, die Blut-Hirn-Schranke8,,9 zu überqueren, werden in dieser Arbeit vorgestellt.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,4-Dithiothreitol (DTT)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9779</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>500-0006</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Detection AB SULFO-TAG labeled anti-rabbit</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R32AB-1</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Discovery workbench 4.0</td>
			<td>Meso Scale Discovery</td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>41966-029</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s PBS (sterile)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537-500ML</td>
			<td>Sample preperation, Washing solution, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9665</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G2025</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gold Read Buffer T (1x) with surfactant</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R92TG</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMBLE Dounce tissue grinder set</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8938</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Shaker, rocking motion (low speed)</td>
			<td>GFL</td>
			<td>3014</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium chloride hexahydrate (MgCl*6H20)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M2670</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MeCP2 (Human) Recombinant Protein (P01)</td>
			<td>Abnova Corporation</td>
			<td>H00004204-P01</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microseal B seal</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories Inc.</td>
			<td>MSB1001</td>
			<td>for plate sealing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal Anti-MeCP2, produced in mouse, clone Mec-168, purified immunoglobulin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818-100UL; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody, Coating solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD Blocker A</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>R93BA-4</td>
			<td>Blocker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MSD SECTOR Imager 2400</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>I30AA-0</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-Array 96-well Plate</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>L15XB-3/L11BX-3</td>
			<td>MeCP2 ECLIA protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>15140122</td>
			<td>Sample preperation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyclonal Anti-MeCP2, produced in rabbit</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom-designed</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl)</td>
			<td>Merck KGaA</td>
			<td>1049361000</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (1B11)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>SAB1404063; RRID:AB_10737296</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (4B6)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>WH0004204M1; RRID:AB_1842411</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Mec-168)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M6818; RRID:AB_262075</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Mouse, anti-MeCP2 (Men-8)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7443; RRID:AB_477235</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primary AB Rabbit, anti-MeCP2 (D4F3)</td>
			<td>Cell Signaling Technology</td>
			<td>3456S; RRID:AB_2143849</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease Inhibitor Cocktail (100X)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>8340</td>
			<td>Hypotonic lysis reagent, Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Eurogentec S.A.</td>
			<td>custom</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Secondary AB, Rabbit, anti-MeCP2</td>
			<td>Merck</td>
			<td>07-013</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3014</td>
			<td>Extraction Buffer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SULFO-TAG Labeled Anti-Rabbit Antibody (goat)</td>
			<td>Meso Scale Diagnostics</td>
			<td>W0015528S</td>
			<td>Antibody</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TAT-MeCP2 fusion protein</td>
			<td>in-house production</td>
			<td></td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin EDTA 0.25% (1X)</td>
			<td>gibco by Life Technologies</td>
			<td>25200-056</td>
			<td>Cell treatment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9416</td>
			<td>Washing solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an electrochemiluminescence-based assay for mecp2 protein variants

Die ECLIA ist eine vielseitige Methode, die in der Lage ist, endogene und rekombinante Proteinmengen in einem 96-Well-Format zu quantifizieren. Um die ECLIA-Effizienz zu demonstrieren, wurde dieser Test verwendet, um intrinsische Konzentrationen von MeCP2 im Gehirngewebe der Maus und die Aufnahme von TAT-MeCP2 in humanen dermalen Fibroblasten zu analysieren. Der MeCP2-ECLIA erzeugt hochpräzise und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler. Zusammenfassend haben wir eine quantitative Methode zur Bewertung von MeCP2-Proteinvarianten entwickelt, die in Hochdurchsatz-Bildschirmen eingesetzt werden können.

Das Prinzip des ECLIA-Systems ist in Abbildung 1beschrieben. Standardkurven für zwei MeCP2-Varianten sind in Abbildung 2dargestellt. Eine genaue Quantifizierung war über einen breiten Konzentrationsbereich (1.800 ng/ml) möglich. In Abbildung 3wurden MeCP2-Spiegel von Lysaten aus Dem mausgehirn und HDFs analysiert. Die MeCP2-Expression in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten, Wildtyp- und Knockout-Mäusen wurde in <strong class...

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An Electrochemiluminescence-Based Assay for MeCP2 Protein Variants

Der Elektrochemilumineszenz-Immunoassay (ECLIA) ist ein neuartiger Ansatz für den quantitativen Nachweis endogener und exogen angewendeter MeCP2-Proteinvarianten, der hochquantitative, genaue und reproduzierbare Messungen mit geringem Intra- und Inter-Assay-Fehler über einen weiten Arbeitsbereich erzeugt. Hier wird das Protokoll für die MeCP2-ECLIA im 96-Well-Format beschrieben.

Ein Electrochemilumineszenz-basierter Assay für MeCP2-Proteinvarianten

The ECLIA is a versatile method which is able to quantify endogenous and recombinant protein amounts in a 96-well format. To demonstrate ECLIA efficiency, ...

Die ECLIA ist eine einfache, aber effiziente Methode zur Quantifizierung des zellulären Niveaus von MeCP2. Die ECLIA ist schnell, empfindlicher und einfacher zu handhaben im Vergleich zu anderen Quantifizierungsmethoden wie dem Western Blot und dem ELISA. Um die Waschlösung vorzubereiten, die 0,5%Tween 20 in PBS ist, fügen Sie 500 Mikroliter Tween 20 zu einem Liter PBS hinzu und mischen Sie kräftig.Bereiten Sie eine Blockierlösung von 3%Blocker A und PBS vor und rühren Sie vorsichtig. Sterilisieren Sie die Blockierlösung durch Filtration. Um die Assay-Verdünnungslösung 1%Blocker A und PBS vorzubereiten, fügen Sie die Blockierlösung fünf Milliliter zu 10 MilliliterPBS hinzu.Als nächstes tauen Sie die monoklonale Maus Anti-MeCP2 Antikörper auf Eis. Mischen Sie 0,67 Mikroliter des Antikörpers mit vier Milliliter PBS, dann wirbeln Sie die Lösung. Um die 96-Well-Hochbindungsplatte zu beschichten, geben Sie sorgfältig 25 Mikroliter Beschichtungslösung in die untere Ecke jedes Brunnens, mit einem Mehrkanal-Pipetter.Dab die 96-Well-Platte sanft auf jeder Seite, um sicherzustellen, dass die Beschichtungslösung den Boden jedes Brunnens bedeckt. Versiegeln Sie die Platte mit Klebefolie und bebrüten Sie über Nacht bei vier Grad Celsius. Holen Sie die 96-Well-Platte aus dem Kühlschrank und entfernen Sie die Folie.Entfernen Sie die Antikörperbeschichtungslösung in den Brunnen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schieben. Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Als nächstes fügen Sie 125 Mikroliter Blockierlösung zu jedem Brunnen hinzu.Dann versiegeln Sie die Platte erneut mit Klebefolie. Legen Sie die Platte auf einen Orbital-Mikroplatten-Shaker, der auf 800 Umdrehungen pro Minute eingestellt ist, und inkubieren Sie sie 90 Minuten lang bei Raumtemperatur. Tauen Sie auf Eis eine Durchstechflasche mit MeCP2 oder Tat-MeCP2 Protein-Stock-Lösung, Maus Gehirnlysate, und HDF Lysate.Verdünnen Sie die Proteinstammlösung in sauberen Röhrchen, wie in Tabelle 2 des Manuskripts beschrieben. Als nächstes die Lysatproben verdünnen. Für die Maus Gehirnlysate, verwenden Sie ein bis 20 Mikrogramm pro 25 Mikroliter LysePuffer.Für das HDF-Lysat 0,25 zu einem Mikrogramm pro 25 Mikroliter Lysepuffer hinzufügen. Nachdem die 96-Well-Platte 90 Minuten lang inkubiert wurde, entfernen Sie die Sperrlösung aus den Brunnen, indem Sie sie in einen Abfallbehälter schieben. Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen.Dann waschen Sie den Teller dreimal mit 150 Mikroliter Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Fügen Sie 25 Mikroliter Standards und Proben in die Brunnen der 96-Well-Platte. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie weitere vier Stunden bei Raumtemperatur mit konstanten 800 RPM Schütteln.Den unbeschrifteten Detektionsantikörper, polyklonales Kaninchen Anti-MeCP2, auf Eis auftauen. Mit Assay-Verdünnungslösung den Antikörper im Verhältnis eins zu 6 000 verdünnen. Wenn die 96-Well-Platte auf dem Shaker inkubiert ist, entfernen Sie die Standards und Proben, indem Sie die Platte in einen Abfallbehälter schieben.Tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch, um die verbleibende Lösung zu entfernen. Waschen Sie die Platte dreimal mit 150 Mikroliter Waschlösung, indem Sie die Waschlösung hinzufügen und sofort entfernen. Fügen Sie mit dem Mehrkanal-Pipetter 25 Mikroliter unbeschrifteter Detektions-Antikörperlösung zu jedem Brunnen hinzu.Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute. Erhalten Sie den spezifischen sekundären Antikörper aus dem Kühlschrank und legen Sie ihn ein Eis. Den Sekundärkörper in assay verdünnungsmitteler Lösung verdünnen und sanft mischen.Um den freien unbeschrifteten Detektionsantikörper aus der 96-Well-Platte zu entfernen, blättern Sie in den Abfallbehälter und tippen Sie dann auf die Platte auf ein Papiertuch. Nach dem Waschen der Platte dreimal wie pervily beschrieben, fügen Sie 25 Mikroliter Sekundärantikörper zu jedem Brunnen mit dem Mehrkanal-Pipetter. Versiegeln Sie die Platte und inkubieren Sie sie für eine Stunde bei Raumtemperatur mit konstantem Schütteln bei 800 Umdrehungen pro Minute.Entfernen Sie den freien Sekundärantikörper, indem Sie in den Abfallbehälter einsteigen und die Platte auf ein Papiertuch klopfen, und waschen Sie die Platte dann, wie zuvor beschrieben, dreimal. Zu jedem Brunnen der Platte, fügen Sie 150 Mikroliter 1X Tris Basis Gold Read Buffer mit Tensid, enthält Tripropylamin als Coreactant für die Lichterzeugung. Um luftblasen zu vermeiden, verwenden Sie Reverse Pipetting-Techniken.Platzieren Sie die 96-Well-Platte auf der Mikroplattenplattform mit Elektrochemilumineszenz-Detektionssystem. Mit der eingebauten CCD-Kamera beginnen Sie sofort mit der Datenerfassung. Aufzeichnungssignalzählungen, die relativen Lichteinheiten entsprechen und direkt proportional zur Lichtintensität sind.MeCP2-Standardkurven wurden aus menschlichem MeCP2 in mehreren Messungen erzeugt. Die ECLIA kann rekombinantes menschliches MeCP2 über einen Bereich von einem Nanogramm pro Milliliter bis 1800 Nanogramm pro Milliliter genau quantifizieren. Mit ECLIA wurden MeCP2-Proteinspiegel in Kernlysaten im Gehirn von heterozygoten und weiblichen Wildtypmäusen und von einer MeCP2-Knockout-Maus gemessen.ECLIA wurde an Zelllysaten aus einer gesunden Kontrolle und aus der ca. 806delG Zelllinie als Modell für das Rett-Syndrom verwendet durchgeführt. Kein MeCP2-Protein wurde in den mutierten Zelllinien durch ECLIA oder durch Immunfluoreszenz nachgewiesen.ECLIA wurde auch verwendet, um die Aufnahme von Tat-MeCP2 durch die MeCP2 mangelhafte Zelllinie Überstunden zu untersuchen. Die Inter- und Intra-Assay-Präzision von ECLIA wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen ermittelt. Für zukünftige Proteinersatztherapien kann die MeCP2-Bereitstellung nach der Proteinstandbewertung durch die ECLIA wiederholt optimiert werden.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Forschung

Biochemie

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Enveloped viruses such as coronaviruses or influenza virus require proteolytic cleavage of their fusion protein to be able to infect the host cell. Often ...

Evaluation of Protein&#8211;Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Evaluation of ProteinÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â‚¬Å“Protein Interactions using an On-Membrane Digestion Technique

Bewertung von Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer On-Membrane-Verdauungstechnik

Numerous intracellular proteins physically interact in accordance with their intracellular and extracellular circumstances. Indeed, cellular functions ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Erstellen hochspezifischer chemisch induzierter Proteindimerisierungssysteme durch schrittweise Phage-Auswahl einer kombinatorischen Single-Domain-Antikörperbibliothek

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Deciphering Molecular Mechanism of Histone Assembly by DNA Curtain Technique

Chromatin is a higher-order structure that packages eukaryotic DNA. Chromatin undergoes dynamic alterations according to the cell cycle phase and in ...

An Integrated Workflow of Identification and Quantification on FDR Control-Based Untargeted Metabolome

Ein integrierter Workflow zur Identifizierung und Quantifizierung von FDR-Kontroll-basierten, ungezielten Metabolomen

Untargeted metabolomics techniques are being widely used in recent years. However, the rapidly increasing throughput and number of samples create an ...