Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

نحن ممتنون للدكتورة دانييل كاريك (قسم مكافحة السرطان وعلوم السكان، المعهد الوطني للسرطان) للحصول على مساعدة مستمرة، وخاصة لبدء هذه الدراسة، وتزويدنا بالعينات، وللاقتراحات المفيدة أثناء تحليل البيانات. نشكر بإخلاص جميع أعضاء مرفق تسلسل CCR في مختبر فريدريك الوطني لأبحاث السرطان لمساعدتهم أثناء إعداد العينة وتسلسلها ، وخاصة بريندا هو للمساعدة في عينة QC ، أوكسانا الألمانية لمكتبة QC ، تاتيانا سميرنوفا لتشغيل المنظمين. كما نود أن نشكر تساي وي شين وآشلي والتون في مجموعة المعلوماتية الحيوية لمرفق التسلسل للمساعدة في تحليل البيانات وتنفيذ خط أنابيب RNA-seq. كما نشكر CCBR وNCBR على المساعدة في خط أنابيب تحليل RNaseq وأفضل الممارسات.

1. تقييم كمية ونوعية الحمض النووي الريبي
<ol><li>حدد عينات FFPE وفقًا لمعايير محددة مسبقًا واستخراج الحمض النووي الريبي باستخدام طريقة مناسبة (على سبيل المثال ، مجموعة استخراج الحمض النووي FFPE ، جدول المواد). ملاحظة: هناك العديد من الطرق المختلفة المتاحة لاستخراج FFPE-RNA، بما في ذلك أحد?...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

وتوضح الطريقة الموصوفة هنا الخطوات الرئيسية المطلوبة للحصول على بيانات تسلسل جيدة من عينات FFPE-RNA. النقاط الرئيسية للنظر مع هذه الطريقة هي: (1) ضمان الحفاظ على الحمض النووي الريبي على أفضل وجه ممكن بعد الاستخراج عن طريق تقليل مناولة العينة وتجميدها وذوبان دوراتها. الaliquots مراقبة الجودة منفصل...

وقد مكننا استخدام الجيل التالي من نهج التسلسل من جمع ثروة من المعلومات من أنواع مختلفة من العينات. غير أن العينات القديمة والمحفوظة بشكل سيئ لا تزال غير قابلة للتطبيق بالنسبة للأساليب الشائعة الاستخدام لتوليد بيانات التسلسل وكثيرا ً ما تتطلب تعديلات على البروتوكولات الراسخة. الأنسجة FFPE تمثل مثل هذا النوع عينة التي تم استخدامها على نطاق واسع للعينات السريرية1،,2،,3. في حين يحافظ الحفاظ على الأنسجة في الحفاظ على الأنسجة، فإن الأحماض النووية في أنسجة FFPE عادة ما تظهر مجموعة واسعة من الضرر والتدهور، مما يجعل من الصعب استرداد المعلومات الجينومية التي قد تؤدي إلى رؤى مهمة حول الآليات الجزيئية الكامنة وراء الاضطرابات المختلفة.
غالبًا ما تكون بيانات التعبير الجيني الناتجة عن تسلسل الحمض النووي الريبي مفيدة في دراسة آليات المرض والمقاومة وتكمل تحليل طفرة الحمض النووي. ومع ذلك ، فإن الحمض النووي الريبي أكثر عرضة للتدهور ، مما يجعل من الصعب توليد بيانات دقيقة للتعبير الجيني من أنسجة FFPE. وعلاوة على ذلك، ونظراً لأن توافر التسلسل والقدرة على تحمل تكلفته على نطاق واسع حديثان نسبياً، فإن العينات القديمة كثيراً ما لا تخزن في ظروف لازمة للحفاظ على سلامة الحمض النووي الريبي. بعض القضايا لعينات FFPE تشمل تدهور الحمض النووي الريبي بسبب التضمين في البارافين، والتعديل الكيميائي من الحمض النووي الريبي مما يؤدي إلى تجزئة أو الانكسار إلى العمليات الأنزيمية المطلوبة لتسلسل، وفقدان ذيول بولي ألف، والحد من انطباق oligo-dT كدليل لtranscriptase العكسي4. وثمة تحد آخر هو مناولة/ تخزين عينات FFPE في ظل ظروف دون المستوى الأمثل، مما قد يؤدي إلى مزيد من التدهور من جزيئات اللابيل مثل الحمض النووي الريبي في الأنسجة5. وينطبق ذلك بصفة خاصة على العينات القديمة التي ربما تكون قد جُمعت في وقت لم يكن من المتوقع إجراء تحليل للبيانات الجينية من جانب تسلسل الحمض النووي الريبي للعينات. كل هذه تؤدي إلى انخفاض نوعية وكمية الحمض النووي الريبي المستخرج ة المتاحة لتوليد بيانات تسلسل مفيدة. وقد ثنى انخفاض احتمال النجاح، إلى جانب ارتفاع تكلفة التسلسل، العديد من الباحثين عن محاولة توليد وتحليل بيانات التعبير الجيني من عينات FFPE مفيدة محتملة. وقد أظهرت بعض الدراسات في السنوات الأخيرة قابلية استخدام أنسجة FFPE لتحليل التعبير الجيني22،6،,7،,8،,9،وإن كان لعدد أقل و / أو عينات أكثر حداثة.
كدراسة جدوى، استخدمنا الحمض النووي الريبي المستخرج من عينات أنسجة ورم FFPE من ثلاثة مستودعات الأنسجة المتبقية من المراقبة، وعلم الأوبئة، ونتائج النهاية (SEER) سجلات السرطان لتسلسل الحمض النووي الريبي وتحليل التعبير الجيني10. تم تخزين أنسجة FFPE من الأورام الغدية السُحّمة عالية الجودة من الأورام الرضّية السُمية الرضّحة من 7-32 سنة في ظروف مختلفة قبل استخراج الحمض النووي الريبي. لأنه في معظم الحالات تم تخزين هذه الكتل في مواقع مختلفة لسنوات دون توقع أي تحليل وراثي حساس في المستقبل ، لم يتم توخي الكثير من الحذر للحفاظ على الأحماض النووية. وهكذا، أظهرت معظم العينات الحمض النووي الريبي سيئة الجودة، مع نسبة كبيرة من العينات الملوثة بالبكتيريا. ومع ذلك، تمكنا من إجراء قياس كمي للجينات، وقياس اتساق واستمرارية التغطية الجينية، وإجراء تحليل ارتباط بيرسون بين النسخ البيولوجية لقياس قابلية التكاثر. استنادا إلى مجموعة من لوحة الجينات التوقيع الرئيسي، قارنا العينات في دراستنا مع بيانات أطلس الجينوم السرطان (TCGA) وأكد أن ما يقرب من 60٪ من العينات لديها ملامح التعبير الجيني مماثلة11. استناداً إلى العلاقة بين مختلف نتائج مراقبة الجودة وبيانات التعريف عينة، حددنا مقاييس مراقبة الجودة الرئيسية التي لها قيمة تنبؤية جيدة لتحديد العينات التي من المرجح أن تولد بيانات تسلسل قابلة للاستخدام11.
هنا نحن وصف المنهجية المستخدمة لتقييم جودة FFPE-RNA، وتوليد المكتبات تسلسل بدءا من عينات الحمض النووي الريبي المستخرج، وتحليل المعلوماتية الحيوية للبيانات التسلسل.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

يتيح تحليل التعبير الجيني من قبل تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) رؤى فريدة في العينات السريرية التي يمكن أن تؤدي إلى فهم ميكانيكي لأساس الأمراض المختلفة وكذلك آليات المقاومة و / أو قابلية التأثر. ومع ذلك ، فإن أنسجة FFPE ، التي تمثل الطريقة الأكثر شيوعًا للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة في العينات السريرية ، ليست أفضل المصادر لتحليل تنميط التعبير الجيني. غالبًا ما يكون الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه من هذه العينات متدهورًا ومجزأً ومعدلًا كيميائيًا ، مما يؤدي إلى مكتبات تسلسل دون المستوى الأمثل. وفي المقابل، تولد هذه البيانات بيانات تسلسل رديئة الجودة قد لا تكون موثوقة لتحليل التعبير الجيني واكتشاف الطفرات. من أجل الاستفادة القصوى من عينات FFPE والحصول على أفضل البيانات الممكنة من عينات ذات جودة منخفضة ، من المهم اتخاذ بعض الاحتياطات أثناء التخطيط للتصميم التجريبي ، وإعداد مكتبات التسلسل ، وأثناء تحليل البيانات. وهذا يشمل استخدام المقاييس المناسبة لمراقبة جودة العينة الدقيقة (QC)، وتحديد أفضل الطرق لمختلف الخطوات أثناء إنشاء مكتبة التسلسل، ومراقبة الجودة مكتبة دقيقة. بالإضافة إلى ذلك ، يعد تطبيق أدوات برمجية ومعلمات صحيحة لتحليل بيانات التسلسل أمرًا بالغ الأهمية من أجل تحديد القطع الأثرية في بيانات RNA-seq ، وتصفية التلوث والقراءات منخفضة الجودة ، وتقييم توحيد التغطية الجينية ، وقياس قابلية استنساخ ملامح التعبير الجيني بين النسخ البيولوجية. يمكن أن تضمن هذه الخطوات دقة عالية وقابلية استنساخ لتنميط عينات الحمض النووي الريبي غير متجانسة للغاية. هنا نحن وصف الخطوات المختلفة لعينة مراقبة الجودة، وإعداد المكتبة ومراقبة الجودة، والتسلسل، وتحليل البيانات التي يمكن أن تساعد على زيادة كمية البيانات المفيدة التي تم الحصول عليها من الحمض النووي الريبي منخفضة الجودة، مثل تلك التي تم الحصول عليها من أنسجة FFPE-RNA.

وطبقت المنهجية المذكورة أعلاه على 67 عينة من عينات FFPE التي تم تخزينها في ظل مجموعة متنوعة من الظروف المختلفة لمدة 7-32 سنة (كان متوسط وقت تخزين العينة 17.5 سنة). وقد سبق وصف مجموعة البيانات ونتائج التحليل المعروضة هنا ونشرها في تشاو وآخرون11. عند التحقق من جودة العينة كما هو موضح ساب?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

تصف هذه الطريقة الخطوات لتحسين جودة وكمية بيانات التسلسل التي يمكن الحصول عليها من عينات الحمض النووي الريبي (FFPE) المدمجة (FFPE) ذات البارافين. نحن نصف المنهجية لتقييم جودة عينات FFPE-RNA بدقة أكبر ، وإعداد مكتبات التسلسل ، وتحليل البيانات من عينات FFPE-RNA.

الأمثل لتسلسل وتحليل العينات FFPE-RNA المتدهورة

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

يمكن استخدام بروتوكولنا لتحسين نوعية وكمية بيانات التعبير الجيني الناتجة عن عينات الحمض النووي الريبي المستمدة من FFPE، وخاصة في عينات الجودة دون الأمثل. هذه التقنية تقيم نوعية الحمض النووي الريبي داخل عينات أنسجة FFPE وتمكن من تحسين معالجة المصب لتحسين كمية ونوعية بيانات تسلسل العينة. وتسمح هذه الطريقة بالتوصيف الشامل للنصوص في العينة البيولوجية والسريرية، وقد توفر نظرة ثاقبة على العناصر الوظيفية للجينوم في مجال التنمية والمرض.10- ويمكن أن يكون تدهور رنا FFPE واختيار الأساليب الخاصة بـ QC العينة وإعداد المكتبة وتحليل البيانات جميعها صعبة للغاية. كن دقيقا عند اختيار الطرق الصحيحة والضوابط المناسبة. عرض مرئي يسمح للمشاهدين لمراقبة التعديلات الدقيقة الصغيرة والاحتياطات اللازمة أثناء التخطيط والتقييم وعملية التسلسل خاصة بالنسبة للعينات FFPE المحفوظة بشكل سيئ.للتحقق من جودة عينة الحمض النووي الريبي، قم بتشغيل العينة على نظام مراقبة الجودة الريبي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة واستخدام برنامج التحليل الحيوي المناسب لتحليل توزيع شظايا الحمض النووي الريبي داخل العينة وحساب نسبة الشظايا التي أطول من 100 و 200 نوكليوتيدات. استناداً إلى مقاييس مراقبة الجودة، حدد العينات التي بها أقل من 40٪ من الشظايا التي تزيد عن 100 نوكليوتيدات للسماح باستبعاد هذه العينات من المعالجة. لتسلسل، ذوبان مجموعات الكواشف التسلسل المناسبة وفقا لالمعلمات تشغيل في حمام الماء درجة حرارة الغرفة ووضع علبة الكاشف في أربع درجات مئوية بعد ذوبان الجليد.ضع حزمة خلية التدفق في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. أثناء احترار الحزمة، افتح تطبيق إدارة تجارب Illumina وحدد إنشاء ورقة عينة. حدد المنظم ليتم استخدامه ثم انقر فوق التالي.أدخل الباركود مجموعة الكاشف ومعلمات سير العمل المناسبة الأخرى. ثم قم بتحميل ورقة عينة تم إنشاؤها وفقًا لمعايير تسلسل Illumina. لإعداد مكتبة العينة ومكتبة التحكم PhiX ، قم بتكفير المكتبات وتمييعها إلى التركيزات المناسبة ومزج العينة ومكتبات التحكم في PhiX للحصول على نسبة حجم التحكم PhiX 5٪.عندما تكون خلايا التدفق جاهزة، قم بإزالة الالتفاف، نظف السطح الزجاجي بمسحة كحولية خالية من الوبر، وجفف الزجاج بأنسجة مختبرية منخفضة الوبر. قم بإزالة خرطوشة الكاشف من التخزين أربع درجات مئوية وعكس الكارتريدج خمس مرات لخلط الكواشف. اضغط بلطف على الخراطيش على مقاعد البدلاء لتقليل فقاعات الهواء وتحميل العينة المشوهة والمخففة في خرطوشة الكاشف في الخزان المعين.قم بتحميل خلية التدفق وخراطيش المخزن المؤقت وخراطيش الكاشف على النظام. ثم قم بإجراء فحص تلقائي ومراجعة الإخراج للتأكد من أن معلمات التشغيل تمرير تحقق النظام. عند اكتمال الفحص التلقائي، حدد البدء لبدء تشغيل التسلسل.لتصور ما قبل معالجة QC وما بعد المحاذاة QC النتائج، تشغيل مراقبة الجودة متعددة لإنشاء تقرير مجمعة في تنسيق HTML. لتحديد تأثيرات الدُفعة ولتقييم خريطة الجودة لمجموعة البيانات المعطاة، استخدم برنامج نصي R لتشغيل تحليل مكون رئيسي. ويمكن بعد ذلك تحليل الارتباط عينة يمكن أن تنفذ باستخدام ارتباط بيرسون بين عينات مختلفة.وتقدير نسبة الشظايا التي تزيد عن 100 نيوكليوتيدات أكثر فائدة من تقدير الشظايا التي تزيد عن 200 نيوكليوتيدات لأنها أكثر حساسية لقياس نسبة الأحجام الأصغر للأجزاء الدقيقة لعينات الحمض النووي الريبي الشديدة التحلل. نظراً لدرجة عالية من التدهور في مجموعة العينات، يوصى مجموع RNA طريقة إعداد مكتبة. على سبيل المثال، يتم عرض مكتبات تسلسلية تم إعدادها من أربع عينات مختلفة.هنا، يتم عرض نظرة عامة على جودة تسلسل الملفات الأولية FastQ ومحتوى محول العينة. يمكن أن يساعد فحص FastQC في اكتشاف التلوث مثل التلوث البكتيري أو الماوس داخل العينات. يمكن استخدام محاذاة STAR لتحديد نسبة القراءات التي تم تعيينها إلى الجينوم المرجعي، ونسبة عمليات القراءة التي تم تعيينها بشكل فريد إلى الجينوم المرجعي، ونسبة عمليات القراءة التي لم يتم تعيينها، أو التي تم تعيينها إلى عدة loci.يمكن استخدام إحصائيات البطاقة و RSeQC لتحديد النسبة المئوية من MESSENGER RNAs ، قواعد intronic و intergenic الموجودة في القراءات المعينة. بالنسبة لهذه التحليلات التمثيلية، كان لدى بعض المكتبات المتدهورة ثلاثة تحيز رئيسي تم فيه تعيين عدد أكبر من القراءات أقرب إلى الثلاثة الرئيسية أكثر من نهايتها الخمسة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إجراء تحليل المكونات الرئيسية لتحديد النسبة المئوية للتباين الكلي الذي تم التقاطه بواسطة المكونات الرئيسية للتكاثر البيولوجي لكل عينة.الحرص على تجنب تدهور العينة، وإعداد النسخ المتماثلة والمعاطف متعددة لكل عينة، واستخدام المقاييس المناسبة لتقييم نوعية العينة، واستخدام طريقة إعداد مكتبة الحق. باستخدام هذه المنهجية، يمكن إجراء دراسات أكبر NGS مع عينات FFPE غير صالحة للاستعمال من قبل مع أوقات وظروف تخزين متفاوتة للحصول على رؤى في مجموعة متنوعة من حالات المرض المختلفة. مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين لدراسة المحفوظات الكبيرة القائمة لعينة FFPE مع معلومات سريرية غنية ويمكن أن تعزز إلى حد كبير دراسات السرطان القائمة على السكان.

optimization-for-sequencing-and-analysis-of-degraded-ffpe-rna-samples

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically comprise less than 1% of the tumor mass. Material derived from bulk tumor contains tumor content at a concentration insufficient for characterization. Therefore, fluorescence activated cell sorting using eight antibodies, as well as side- and forward-scatter, is described here as a method of rapidly separating and concentrating with high purity thousands of HRS cells from the tumor for subsequent study. At the same time, because standard protocols for exome sequencing typically require 100-1,000 ng of input DNA, which is often too high, even with flow sorting, we also provide an optimized, low-input library construction protocol capable of producing high-quality data from as little as 10 ng of input DNA. This combination is capable of producing next-generation libraries suitable for hybridization capture of whole-exome baits or more focused targeted panels, as desired. Exome sequencing of the HRS cells, when compared against healthy intratumor T or B cells, can identify somatic alterations, including mutations, insertions and deletions, and copy number alterations. These findings elucidate the molecular biology of HRS cells and may reveal avenues for targeted drug treatments.

Here, we describe a combined flow cytometric cell sorting and low-input, next-generation library construction protocol designed to produce high-quality, whole-exome data from the Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin lymphoma (CHL).

تدفق الفرز وإكسوم التسلسل من خلايا ريد-ستيرنبرغ من الليمفاوية الكلاسيكي هودجكين

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

الكشف عن نسخة عدد التعديلات عن طريق التسلسل خلية واحدة

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

الأمثل والتحليل المقارن لطرق التخصيب الحمض النووي النباتي أورغانيلار مناسبة للجيل القادم التسلسل

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

جيل من الكروماتين الأصلية إيمونوبريسيبيتيشن تسلسل المكتبات لتحليل كثافة نوكليوسومي

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

عزل الحمض النووي قوية وبناء مكتبة التسلسل الفائق للعينات دار النباتات

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

الكشف عن حالة نادرة باستخدام الحمض النووي لتصحيح الخطأ وتسلسل الحمض النووي الريبي

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

التضخيم من القرب من كامل طول فيروس نقص المناعة البشرية-1 بروفيروسيس للجيل التالي التسلسل

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

تسلسل أشباه الموصلات للاختبار الوراثي قبل الزرع للأنوبلويدي

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

تسلسل mRNA من الدم الكامل باستخدام التسلسل نانو

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...