Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

We zijn dr. Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) dankbaar voor voortdurende hulp, vooral voor het initiëren van deze studie, ons te voorzien van de monsters, en voor nuttige suggesties tijdens data-analyse. Wij danken alle leden van de CCR Sequencing Facility van het Frederick National Laboratory for Cancer Research voor hun hulp tijdens de voorbereiding van de steekproef en sequencing, vooral Brenda Ho voor hulp in monster QC, Oksana Duits voor bibliotheek QC, Tatyana Smirnova voor het runnen van de sequencers. We willen ook Tsai-wei Shen en Ashley Walton van Sequencing Facility Bioinformatics Group bedanken voor hun hulp bij data-analyse en RNA-seq pipeline implementation. We danken ccbr en NCBR ook voor hulp bij de analysepijplijn van RNaseq en de ontwikkeling van best practices.

1. RNA-kwantiteit en kwaliteitsbeoordeling
<ol><li>Selecteer de FFPE-monsters op basis van vooraf gedefinieerde criteria en extraheer RNA met behulp van een geschikte methode (bijvoorbeeld FFPE-nuclei zuur extractiekit, tabel van materialen). OPMERKING: Er zijn verschillende methoden beschikbaar voor FFPE-RNA extractie, waaronder de nieuwere microdissection methoden die kunnen werken met zeer weinig weefsel en extract goede kwaliteit RNA12,13</sup...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

De hier beschreven methode schetst de belangrijkste stappen die nodig zijn om goede sequentiegegevens te verkrijgen van FFPE-RNA-monsters. De belangrijkste punten om met deze methode rekening mee te houden zijn: (1) Zorg ervoor dat het RNA na extractie zo goed mogelijk wordt bewaard door de behandeling van het monster en het bevriezen en ontdooien van cycli te minimaliseren. Aparte QC aliquots zijn zeer nuttig. (2) Gebruik een QC-statistiek die het beste is voor de gegeven sampleset. RIN-waarden en DV200 zijn ...

Het gebruik van de volgende generatie sequencing benaderingen heeft ons in staat gesteld om een schat aan informatie uit verschillende soorten monsters te verzamelen. Oude en slecht bewaarde monsters blijven echter onwerkbaar voor de veelgebruikte methoden voor het genereren van sequentiegegevens en vereisen vaak wijzigingen in gevestigde protocollen. FFPE-weefsels vertegenwoordigen een dergelijk monstertype dat op grote schaal is gebruikt voor klinische specimens1,2,3. Terwijl FFPE behoud onderhoudt weefselmorfologie, de nucleïnezuren in FFPE weefsels vertonen meestal een breed scala van schade en afbraak, waardoor het moeilijk is om de genomische informatie die kan leiden tot belangrijke inzichten over moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan verschillende aandoeningen op te halen.
Genexpressiegegevens gegenereerd door RNA-sequencing zijn vaak instrumenteel bij het bestuderen van ziekte- en resistentiemechanismen en vormen een aanvulling op de dna-mutatieanalyse. RNA is echter gevoeliger voor afbraak, waardoor het moeilijker wordt om nauwkeurige genexpressiegegevens uit FFPE-weefsels te genereren. Bovendien, omdat de brede beschikbaarheid en betaalbaarheid van sequencing relatief recent is, werden oudere exemplaren vaak niet opgeslagen in omstandigheden die nodig zijn om de RNA-integriteit te behouden. Enkele van de problemen voor FFPE monsters omvatten afbraak van RNA als gevolg van inbedding in paraffine, chemische modificatie van RNA leidt tot fragmentatie of refractoriness tot enzymatische processen die nodig zijn voor sequencing, en verlies van de poly-A staarten, het beperken van de toepasbaarheid van oligo-dT als een inleiding voor reverse transcripte4. Een andere uitdaging is de behandeling/opslag van FFPE-monsters onder suboptimale omstandigheden, wat kan leiden tot verdere afbraak van labiele moleculen zoals RNA in de weefsels5. Dit is vooral relevant voor oudere monsters die kunnen zijn verzameld op een moment dat genexpressie analyse door RNA sequencing niet werd verwacht voor de monsters. Al deze leiden tot verminderde kwaliteit en kwantiteit van het geëxtraheerde RNA beschikbaar voor het genereren van nuttige sequentiegegevens. De lage kans op succes, gecombineerd met de hoge kosten van sequencing, heeft veel onderzoekers ervan weerhouden om genexpressiegegevens te genereren en te analyseren uit potentieel nuttige FFPE-monsters. Sommige studies in de afgelopen jaren hebben aangetoond dat de bruikbaarheid van FFPE weefsels voor genexpressie analyse2,6,7,8,9, zij het voor minder en / of meer recente monsters.
Als haalbaarheidsstudie gebruikten we RNA uit FFPE-tumorweefselmonsters uit drie Residual Tissue Repositories van Surveillance, Epidemiologie en End Results (SEER) kankerregisters voor RNA-sequencing en genexpressieanalyse10. De FFPE-weefsels van hoogwaardige eierstokkanker werden van 7-32 jaar onder wisselende omstandigheden opgeslagen voor RNA-extractie. Omdat in de meeste gevallen deze blokken jarenlang op verschillende locaties waren opgeslagen zonder de verwachting van een gevoelige genetische analyse in de toekomst, was er niet veel zorg genomen om de nucleïnezuren te behouden. Zo, de meeste van de monsters tentoongesteld slechte kwaliteit RNA, met een groot deel van de monsters besmet met bacteriën. Niettemin waren we in staat om genkwantificering uit te voeren, de uniformiteit en continuïteit van gendekking te meten en de Pearson correlatieanalyse uit te voeren tussen biologische replica's om reproduceerbaarheid te meten. Op basis van een set van de belangrijkste handtekening genpaneel, vergeleken we de monsters in onze studie met The Cancer Genome Atlas (TCGA) gegevens en bevestigd dat ongeveer 60% van de monsters had vergelijkbare genexpressie profielen11. Op basis van de correlatie tussen verschillende QC-resultaten en voorbeeldmetadata, hebben we belangrijke QC-statistieken geïdentificeerd die een goede voorspellende waarde hebben voor het identificeren van monsters die eerder bruikbare sequentiegegevens genereren11.
Hier beschrijven we de methodologie die wordt gebruikt voor ffpe-RNA kwaliteitsbeoordeling, het genereren van sequencing bibliotheken vanaf geëxtraheerde RNA monsters, en bio-informatica analyse van de sequencing gegevens.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

Genexpressieanalyse door RNA-sequencing (RNA-seq) maakt unieke inzichten mogelijk in klinische monsters die mogelijk kunnen leiden tot mechanistisch begrip van de basis van verschillende ziekten, resistentie en/of gevoeligheidsmechanismen. FFPE-weefsels, die de meest voorkomende methode vormen voor het behoud van weefselmorfologie in klinische specimens, zijn echter niet de beste bronnen voor genexpressieprofileringsanalyse. Het RNA verkregen uit dergelijke monsters wordt vaak afgebroken, gefragmenteerd en chemisch gewijzigd, wat leidt tot suboptimale sequencing bibliotheken. Deze genereren op hun beurt gegevens van slechte kwaliteit sequentie die mogelijk niet betrouwbaar zijn voor genexpressieanalyse en mutatiedetectie. Om optimaal gebruik te maken van FFPE-monsters en de best mogelijke gegevens te verkrijgen uit monsters van lage kwaliteit, is het belangrijk om bepaalde voorzorgsmaatregelen te nemen tijdens het plannen van experimenteel ontwerp, het voorbereiden van sequencing bibliotheken en tijdens data-analyse. Dit omvat het gebruik van geschikte statistieken voor nauwkeurige steekproefkwaliteitscontrole (QC), het identificeren van de beste methoden voor verschillende stappen tijdens het genereren van sequencing-bibliotheek en zorgvuldige bibliotheek QC. Daarnaast is het toepassen van de juiste softwaretools en parameters voor sequentiegegevensanalyse van cruciaal belang om artefacten in RNA-seq-gegevens te identificeren, besmetting en lage kwaliteit te lezen, uniformiteit van gendekking te beoordelen en de reproduceerbaarheid van genexpressieprofielen onder biologische replicaties te meten. Deze stappen kunnen zorgen voor een hoge nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid voor profilering van zeer heterogene RNA-monsters. Hier beschrijven we de verschillende stappen voor voorbeeld QC, bibliotheekvoorbereiding en QC, sequencing en gegevensanalyse die kunnen helpen om de hoeveelheid nuttige gegevens verkregen uit RNA van lage kwaliteit te verhogen, zoals die verkregen uit FFPE-RNA-weefsels.

De hierboven beschreven methode werd toegepast op 67 FFPE-monsters die gedurende 7-32 jaar onder verschillende omstandigheden waren opgeslagen (de mediane opslagtijd van monsters was 17,5 jaar). De hier gepresenteerde dataset- en analyseresultaten werden eerder beschreven en gepubliceerd in Zhao et al.11. Bij het controleren van de monsterkwaliteit zoals eerder beschreven (d.w.z. voorbeeldsporen in figuur 2)bleek DV100 nuttiger te zijn dan DV200 ...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Deze methode beschrijft de stappen om de kwaliteit en kwantiteit van sequentiegegevens te verbeteren die kunnen worden verkregen uit formeel vaste paraffine-embedded (FFPE) RNA-monsters. We beschrijven de methodologie om de kwaliteit van FFPE-RNA-monsters nauwkeuriger te beoordelen, sequencingbibliotheken voor te bereiden en de gegevens van FFPE-RNA-monsters te analyseren.

Optimalisatie voor sequencing en analyse van gedegradeerde FFPE-RNA Samples

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Ons protocol kan worden gebruikt om de kwaliteit en kwantiteit van genexpressiegegevens gegenereerd uit FFPE-afgeleide RNA-monsters te verbeteren, vooral in suboptimale kwaliteitsmonsters. Deze techniek beoordeelt de RNA-kwaliteit binnen FFPE-weefselmonsters en maakt optimalisatie van hun downstream verwerking mogelijk om de kwantiteit en kwaliteit van de monstersequencinggegevens te verbeteren. Deze methode maakt het mogelijk om een transcriptie in biologisch en klinisch monster volledig te karakteriseren en kan inzicht geven in functionele elementen van het genoom bij ontwikkeling en ziekte.De FFPE-RNA afbraak en selectie van de methoden voor monster QC, bibliotheek voorbereiding, en data-analyse kan allemaal erg lastig. Wees zorgvuldig bij het selecteren van de juiste methoden en de juiste controles. Visuele demonstratie stelt kijkers in staat om de kleine subtiele wijzigingen en voorzorgsmaatregelen die nodig zijn tijdens de planning, beoordeling en het sequencing proces te observeren, vooral voor slecht bewaard gebleven FFPE-monsters.Om de kwaliteit van het RNA-monster te controleren, voert u het monster uit op een RNA QC-systeem volgens de instructies van de fabrikant en gebruikt u de juiste bioanalysesoftware om de verspreiding van de RNA-fragmenten in het monster te analyseren en het aandeel fragmenten langer dan 100 en 200 nucleotiden te berekenen. Op basis van de QC-statistieken, identificeer de monsters met minder dan 40% van de fragmenten langer dan 100 nucleotiden om uitsluiting van deze monsters van verwerking mogelijk te maken. Ontdooi voor sequencing de juiste sequencing reagensets volgens de runparameters in een waterbad op kamertemperatuur en plaats de reagenslade op vier graden Celsius na het ontdooien.Plaats het stroomcelpakket gedurende 30 minuten op kamertemperatuur. Terwijl het pakket aan het opwarmen is, opent u de toepassing Illumina Experiment Manager en selecteert u Voorbeeldblad maken. Selecteer de sequencer die moet worden gebruikt en klik op Volgende.Voer de streepjescode van de reagenskit en de andere geschikte werkstroomparameters in. Upload vervolgens een voorbeeldblad dat is gemaakt op basis van de Illumina-sequentiecriteria. Om de voorbeeldbibliotheek en de besturingsbibliotheek PhiX voor te bereiden, de bibliotheken aan de juiste concentraties te ontleden en te verdunnen en de steekproef- en PhiX-besturingsbibliotheken te mengen om een volumeverhouding van 5%PhiX-controle te verkrijgen.Wanneer de stroomcellen klaar zijn, verwijder de verpakking, maak het glasoppervlak schoon met een pluisvrij alcoholdoekje en droog het glas met een laag pluisje laboratoriumweefsel. Haal de reagenscartridge uit de opslag van vier graden Celsius en keer de cartridge vijf keer om om de reagentia te mengen. Tik voorzichtig op de cartridge op de bank om luchtbellen te verminderen en laad het gedenatureerde en verdunde monster in de reagenscartridge in het aangewezen reservoir.Laad de stroomcel, buffercartridge en de reagentcartridge op het systeem. Voer vervolgens een geautomatiseerde controle uit en controleer de uitvoer om ervoor te zorgen dat de runparameters de systeemcontrole doorstaan. Wanneer de automatische controle is voltooid, selecteert u beginnen om te beginnen met de sequencing run.Als u de QC-resultaten voor verwerking en qc-uitlijning na uitlijning wilt visualiseren, voert u multi-QC uit om een geaggregeerd rapport in HTML-indeling te genereren. Als u batcheffecten wilt bepalen en de kwaliteitskaart van de opgegeven gegevensset wilt beoordelen, gebruikt u een R-script om een hoofdcomponentanalyse uit te voeren. Monstercorrelatieanalyse kan vervolgens worden uitgevoerd met behulp van de Pearson correlatie tussen verschillende monsters.De schatting van het aandeel fragmenten langer dan 100 nucleotiden is nuttiger dan een schatting van de fragmenten langer dan 200 nucleotiden omdat het gevoeliger is voor het nauwkeurig meten van het aandeel kleinere fragmentgroottes voor sterk gedegradeerde RNA-monsters. Gezien de hoge mate van afbraak in de sampleset wordt een totale RNA-bibliotheekvoorbereidingsmethode aanbevolen. Hier worden bijvoorbeeld sequencingbibliotheken getoond die uit vier verschillende voorbeelden zijn opgesteld.Hier worden overzichten weergegeven van de ruwe FastQ-bestandssequencingkwaliteit en de inhoud van de voorbeeldadapter. FastQC-screening kan helpen bij het detecteren van besmetting, zoals bacteriële of muizenverontreiniging in de monsters. STAR-uitlijning kan worden gebruikt om het percentage reads in kaart gebracht aan het referentiegenoom te bepalen, het percentage reads dat uniek is toegewezen aan het referentiegenoom en het percentage reads dat niet in kaart is gebracht, of dat in kaart zijn gebracht op meerdere loci.De kaart- en RSeQC-statistieken kunnen worden gebruikt om het percentage messenger RNAs, intronic en intergene bases in de in kaart gebrachte leest te bepalen. Voor deze representatieve analyses, sommige gedegradeerde bibliotheken hadden een drie prime bias waarin meer leest werden in kaart gebracht dichter bij de drie prime dan aan de vijf prime end. Bovendien kan de hoofdcomponentanalyse worden uitgevoerd om het percentage van de totale variatie te bepalen dat door de belangrijkste componenten voor de biologische replicaties van elk monster wordt gevangen.Zorg ervoor dat monsters afbraak te voorkomen, replica's en meerdere lagen voor elk monster voor te bereiden, gebruik maken van de juiste statistieken om de kwaliteit van het monster te beoordelen, en gebruik de juiste bibliotheek voorbereidingsmethode. Met behulp van deze methode kunnen grotere NGS-studies worden uitgevoerd met voorheen onbruikbare FFPE-monsters met verschillende opslagtijden en -omstandigheden om inzicht te krijgen in een verscheidenheid aan verschillende ziektetoestanden. Deze techniek maakte de weg vrij voor onderzoekers om bestaande grote archieven van FFPE-steekproef te bestuderen met rijke klinische informatie en kan de op de bevolking gebaseerde kankerstudies sterk verbeteren.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering en Exome Sequencing van de Reed-Sternberg Cellen van Klassieke Hodgkin Lymfoom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detectie van Copy Number Wijzigingen met behulp van Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisatie en Vergelijkende Analyse van Plant Organellaire DNA Verrijkingsmethoden Geschikt voor Volgend Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generatie van inheemse chromatine Immunoprecipitation Sequencing bibliotheken nucleosoom dichtheid p.a.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatine Immunoprecipitation (ChIP) Protocol voor lage-overvloed embryonale monsters

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuuste DNA isolatie en High-throughput Sequencing bibliotheek bouw voor Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Zeldzame gebeurtenis detectie met behulp van fout-gecorrigeerd DNA en RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Versterking van in de buurt van Full-length HIV-1 Proviruses voor Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halfgeleider sequencing voor pre-implantatie genetische tests voor aneuploïdie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Het rangschikken van mRNA van geheel bloed gebruikend Nanogaatje het rangschikken

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...