Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
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Wir danken Dr. Danielle Carrick (Abteilung für Krebsbekämpfung und Bevölkerungswissenschaften, National Cancer Institute) für die weitere Hilfe, insbesondere für die Einleitung dieser Studie, die Bereitstellung der Proben und für hilfreiche Vorschläge bei der Datenanalyse. Wir danken allen Mitgliedern der CCR-Sequenzierungsanlage am Frederick National Laboratory for Cancer Research für ihre Hilfe bei der Probenvorbereitung und -sequenzierung, insbesondere Brenda Ho für die Unterstützung in der Probe QC, Oksana German für die Bibliothek QC, Tatyana Smirnova für die Durchführung der Sequenzer. Wir danken auch Tsai-wei Shen und Ashley Walton von der Sequencing Facility Bioinformatics Group für ihre Unterstützung bei der Datenanalyse und der Implementierung von RNA-seq-Pipelines. Wir danken auch CCBR und NCBR für die Unterstützung bei der RNaseq-Analysepipeline und der Entwicklung von Best Practices.

1. RNA-Quantitäts- und Qualitätsbewertung
<ol><li>Wählen Sie die FFPE-Proben nach vordefinierten Kriterien aus und extrahieren Sie RNA nach einer geeigneten Methode (z.B. FFPE-Kernsäureextraktionskit, Tabelle der Materialien). HINWEIS: Es gibt verschiedene Methoden für die FFPE-RNA-Extraktion, einschließlich der neueren Mikrodissektionsmethoden, die mit sehr wenig Gewebe arbeiten und gute RNA12,,13,,14</sup...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

Die hier beschriebene Methode beschreibt die wichtigsten Schritte, die erforderlich sind, um gute Sequenzdaten aus FFPE-RNA-Proben zu erhalten. Die wichtigsten Punkte, die bei dieser Methode zu berücksichtigen sind: (1) Stellen Sie sicher, dass die RNA nach der Extraktion so gut wie möglich erhalten bleibt, indem Sie die Probenhandhabung und die Gefrier- und Auftauzyklen minimieren. Separate QC-Aliquots sind sehr hilfreich. (2) Verwenden Sie eine QC-Metrik, die für den angegebenen Stichprobensatz am besten geeignet is...

Die Verwendung von Sequenzierungsansätzen der nächsten Generation hat es uns ermöglicht, eine Fülle von Informationen aus verschiedenen Arten von Stichproben zu erhalten. Alte und schlecht erhaltene Beispiele sind jedoch für die häufig verwendeten Methoden zur Generierung von Sequenzdaten nach wie vor nicht praktikabel und erfordern häufig Änderungen an etablierten Protokollen. FFPE-Gewebe stellen einen solchen Probentyp dar, der für klinische Proben1,2,3weit verbreitet ist. Während die FFPE-Konservierung die Gewebemorphologie aufrechterhält, weisen die Nukleinsäuren in FFPE-Geweben in der Regel eine breite Palette von Schäden und Abbau auf, was es schwierig macht, die genomischen Informationen abzurufen, die zu wichtigen Erkenntnissen über molekulare Mechanismen führen können, die verschiedenen Störungen zugrunde liegen.
Genexpressionsdaten, die durch RNA-Sequenzierung generiert werden, sind oft entscheidend für die Untersuchung von Krankheits- und Resistenzmechanismen und ergänzen die DNA-Mutationsanalyse. Die RNA ist jedoch anfälliger für Degradation, was es schwieriger macht, genaue Genexpressionsdaten aus FFPE-Geweben zu generieren. Da die große Verfügbarkeit und Erschwinglichkeit der Sequenzierung relativ jung ist, wurden ältere Proben oft nicht unter Bedingungen gelagert, die zur Erhaltung der RNA-Integrität erforderlich sind. Einige der Probleme für FFPE-Proben sind der Abbau der RNA durch einbetten in Paraffin, die chemische Modifikation von RNA, die zu Fragmentierung oder Refraktorik zu enzymatischen Prozessen führt, die für die Sequenzierung erforderlich sind, und der Verlust der Poly-A-Schwänze, wodurch die Anwendbarkeit von Oligo-dT als Primer für die Reverse-Transkriptase4begrenzt wird. Eine weitere Herausforderung ist die Handhabung/Lagerung von FFPE-Proben unter suboptimalen Bedingungen, was zu einem weiteren Abbau von labilen Molekülen wie RNA in den Geweben führen kann5. Dies ist besonders relevant für ältere Proben, die zu einer Zeit gesammelt wurden, als eine Genexpressionsanalyse durch RNA-Sequenzierung für die Proben nicht erwartet wurde. All dies führt zu einer verminderten Qualität und Quantität der extrahierten RNA, die für die Generierung nützlicher Sequenzdaten zur Verfügung steht. Die geringe Erfolgswahrscheinlichkeit in Verbindung mit den hohen Kosten der Sequenzierung hat viele Forscher davon abgebracht, Genexpressionsdaten aus potenziell nützlichen FFPE-Proben zu generieren und zu analysieren. Einige Studien in den letzten Jahren haben die Nutzbarkeit von FFPE-Geweben für die Genexpressionsanalyse2,6,7,8,9, wenn auch für weniger und/oder neuere Proben gezeigt.
Als Machbarkeitsstudie verwendeten wir RNA, die aus FFPE-Tumorgewebeproben aus drei Residual Tissue Repositories aus Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) Krebsregisterfürarbeitung für RNA-Sequenzierung und Genexpressionsanalyse extrahiert wurde10. Die FFPE-Gewebe aus hochgradigen ovarischen serösen Adenokarzinomen wurden von 7 bis 32 Jahren unter unterschiedlichen Bedingungen vor der RNA-Extraktion gelagert. Da diese Blöcke in den meisten Fällen jahrelang an verschiedenen Stellen gelagert worden waren, ohne dass in Zukunft eine sensible genetische Analyse erwartet wurde, wurde nicht viel darauf geachtet, die Nukleinsäuren zu erhalten. So zeigten die meisten Proben eine qualitativ minderwertige RNA, wobei ein großer Teil der Proben mit Bakterien kontaminiert war. Nichtsdestotrotz konnten wir genquantifiziert, die Homogenität und Kontinuität der Genabdeckung messen und die Pearson-Korrelationsanalyse zwischen biologischen Replikationen durchführen, um die Reproduzierbarkeit zu messen. Basierend auf einer Reihe von Schlüssel-Signatur-Gen-Panel, verglichen wir die Proben in unserer Studie mit The Cancer Genome Atlas (TCGA) Daten und bestätigte, dass etwa 60% der Proben hatten vergleichbare Genexpressionsprofile11. Basierend auf der Korrelation zwischen verschiedenen QC-Ergebnissen und Beispielmetadaten identifizierten wir wichtige QC-Metriken, die einen guten Vorhersagewert für die Identifizierung von Stichproben haben, die eher verwendbare Sequenzdaten generieren11.
Hier beschreiben wir die Methodik für die FFPE-RNA-Qualitätsbewertung, die Generierung von Sequenzierungsbibliotheken ausgehend von extrahierten RNA-Proben und die bioinformatische Analyse der Sequenzierungsdaten.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

Die Genexpressionsanalyse durch RNA-Sequenzierung (RNA-Seq) ermöglicht einzigartige Einblicke in klinische Proben, die potenziell zu einem mechanistischen Verständnis der Grundlagen verschiedener Krankheiten sowie Resistenz- und/oder Anfälligkeitsmechanismen führen können. FFPE-Gewebe, die die häufigste Methode zur Erhaltung der Gewebemorphologie in klinischen Proben darstellen, sind jedoch nicht die besten Quellen für die Genexpressionsprofilanalyse. Die aus solchen Proben gewonnene RNA wird oft abgebaut, fragmentiert und chemisch modifiziert, was zu suboptimalen Sequenzierungsbibliotheken führt. Diese wiederum erzeugen Sequenzdaten schlechter Qualität, die für die Genexpressionsanalyse und Mutationsermittlung möglicherweise nicht zuverlässig sind. Um das Beste aus FFPE-Proben zu machen und die bestmöglichen Daten aus minderwertigen Proben zu erhalten, ist es wichtig, bestimmte Vorsichtsmaßnahmen zu treffen, während der Planung des experimentellen Entwurfs, der Vorbereitung von Sequenzierungsbibliotheken und bei der Datenanalyse. Dazu gehören die Verwendung geeigneter Metriken für die präzise Stichprobenqualitätskontrolle (QC), die Ermittlung der besten Methoden für verschiedene Schritte während der Generierung der Sequenzierungsbibliothek und die sorgfältige Bibliothek QC. Darüber hinaus ist die Anwendung korrekter Software-Tools und Parameter für die Sequenzdatenanalyse von entscheidender Bedeutung, um Artefakte in RNA-seq-Daten zu identifizieren, Kontaminationen und Lesewerte niedriger Qualität herauszufiltern, die Homogenität der Genabdeckung zu bewerten und die Reproduzierbarkeit von Genexpressionsprofilen zwischen biologischen Replikationen zu messen. Diese Schritte können eine hohe Genauigkeit und Reproduzierbarkeit für die Profilierung sehr heterogener RNA-Proben gewährleisten. Hier beschreiben wir die verschiedenen Schritte für Die Probe QC, Bibliotheksvorbereitung und QC, Sequenzierung und Datenanalyse, die dazu beitragen können, die Menge an nützlichen Daten aus minderwertiger RNA zu erhöhen, wie die aus FFPE-RNA-Geweben.

Die oben beschriebene Methode wurde auf 67 FFPE-Proben angewendet, die 7–32 Jahre lang unter verschiedenen Bedingungen gelagert worden waren (die mediane Probenlagerzeit betrug 17,5 Jahre). Die hier vorgestellten Datenundanalyseergebnisse wurden zuvor in Zhao et al.11beschrieben und veröffentlicht. Bei der Überprüfung der Probenqualität, wie sie zuvor beschrieben wurde (d. h. Beispielspuren in Abbildung 2), erwies sich DV100 als nützlicher als DV<sub...

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Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Diese Methode beschreibt die Schritte zur Verbesserung der Qualität und Quantität der Sequenzdaten, die aus formal in-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) RNA-Proben gewonnen werden können. Wir beschreiben die Methodik zur genaueren Bewertung der Qualität von FFPE-RNA-Proben, bereiten Sequenzierungsbibliotheken vor und analysieren die Daten aus FFPE-RNA-Proben.

Optimierung zur Sequenzierung und Analyse degradierter FFPE-RNA-Proben

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Unser Protokoll kann verwendet werden, um die Qualität und Quantität der Genexpressionsdaten zu verbessern, die aus FFPE-abgeleiteten RNA-Proben, insbesondere in suboptimalen Qualitätsproben, generiert werden. Diese Technik bewertet die RNA-Qualität in FFPE-Gewebeproben und ermöglicht die Optimierung ihrer nachgelagerten Verarbeitung, um die Quantität und Qualität der Probensequenzierungsdaten zu verbessern. Diese Methode ermöglicht die umfassende Charakterisierung eines Transkripts in biologischen und klinischen Proben und kann Einblicke in funktionelle Elemente des Genoms in Entwicklung und Krankheit geben.Der FFPE-RNA-Abbau und die Auswahl der Methoden für Die Proben-QC, die Bibliotheksvorbereitung und die Datenanalyse können sehr schwierig sein. Seien Sie bei der Auswahl der richtigen Methoden und geeigneten Kontrollen akribisch. Visuelle Demonstration ermöglicht es den Betrachtern, die kleinen subtilen Änderungen und Vorsichtsmaßnahmen zu beobachten, die während der Planung, Bewertung und des Sequenzierungsprozesses erforderlich sind, insbesondere für schlecht erhaltene FFPE-Proben.Um die Qualität der RNA-Probe zu überprüfen, führen Sie die Probe auf einem RNA-QC-System gemäß den Anweisungen des Herstellers aus und verwenden Sie die entsprechende Bioanalyse-Software, um die Verteilung der RNA-Fragmente innerhalb der Probe zu analysieren und den Anteil der Fragmente zu berechnen, die länger als 100 und 200 Nukleotide sind. Identifizieren Sie auf der Grundlage der QC-Metriken die Proben mit weniger als 40 % der Fragmente, die länger als 100 Nukleotide sind, um den Ausschluss dieser Proben von der Verarbeitung zu ermöglichen. Für die Sequenzierung die entsprechenden Sequenzierungsreagenz-Kits entsprechend den Laufparametern in einem Raumtemperatur-Wasserbad auftauen und das Reagenzfach nach dem Auftauen auf vier Grad Celsius legen.Legen Sie das Flow-Zell-Paket 30 Minuten bei Raumtemperatur. Während sich das Paket erwärmt, öffnen Sie die Illumina Experiment Manager-Anwendung, und wählen Sie Beispielblatt erstellen aus. Wählen Sie den zu verwendenden Sequenzer aus, und klicken Sie auf Weiter.Geben Sie den Reagenz-Kit-Barcode und die anderen geeigneten Workflow-Parameter ein. Laden Sie dann ein Beispielblatt hoch, das nach den Kriterien der Illumina-Sequenz erstellt wurde. Um die Beispielbibliothek und die Steuerungsbibliothek PhiX vorzubereiten, denaturiert und verdünnt die Bibliotheken auf die entsprechenden Konzentrationen, und mischen Sie die Sample- und PhiX-Steuerbibliotheken, um ein Volumenverhältnis von 5% PhiX zu erhalten.Wenn die Durchflusszellen bereit sind, entfernen Sie die Umhüllung, reinigen Sie die Glasoberfläche mit einem fusselfreien Alkoholwisch und trocknen Sie das Glas mit einem niedrigen Fussellaborgewebe. Entfernen Sie die Reagenzpatrone aus der Vier-Grad-Celsius-Lagerung und invertieren Sie die Patrone fünfmal, um die Reagenzien zu mischen. Tippen Sie vorsichtig auf die Patrone auf der Bank, um Luftblasen zu reduzieren und laden Sie die denaturierte und verdünnte Probe in die Reagenzpatrone im dafür vorgesehenen Reservoir.Laden Sie die Durchflusszelle, die Pufferpatrone und die Reagenzkassette auf das System. Führen Sie dann eine automatisierte Überprüfung durch, und überprüfen Sie die Ausgabe, um sicherzustellen, dass die Ausführungsparameter die Systemprüfung bestehen. Wenn die automatisierte Prüfung abgeschlossen ist, wählen Sie Start aus, um mit der Sequenzierung zu beginnen.Um die QC-Ergebnisse vor der Verarbeitung von QC und QC nach der Ausrichtung zu visualisieren, führen Sie multi-QC aus, um einen aggregierten Bericht im HTML-Format zu generieren. Um Batcheffekte zu bestimmen und die Qualitätszuordnung des angegebenen Datasets zu bewerten, verwenden Sie ein R-Skript, um eine Hauptkomponentenanalyse auszuführen. Die Stichprobenkorrelationsanalyse kann dann mit der Pearson-Korrelation zwischen verschiedenen Proben durchgeführt werden.Die Schätzung des Anteils von Fragmenten, die länger als 100 Nukleotide sind, ist nützlicher als eine Schätzung der Fragmente, die länger als 200 Nukleotide sind, da sie empfindlicher ist, um den Anteil kleinerer Fragmentgrößen für stark degradierte RNA-Proben genau zu messen. Angesichts des hohen Abbaugrads im Probensatz wird eine Methode zur Vorbereitung der RNA-Bibliothek insgesamt empfohlen. Hier werden z. B. Sequenzierungsbibliotheken angezeigt, die aus vier verschiedenen Beispielen erstellt wurden.Hier werden Übersichten über die Qualität der RawQ-Dateisequenzierung und den Inhalt von Beispieladaptern angezeigt. FastQC-Screening kann dabei helfen, Verunreinigungen wie bakterielle oder Mauskontaminationen in den Proben zu erkennen. Die STAR-Ausrichtung kann verwendet werden, um den Anteil der Lesevorgänge zu bestimmen, die dem Referenzgenom zugeordnet sind, den Prozentsatz der Lesevorgänge, die dem Referenzgenom eindeutig zugeordnet sind, und den Anteil der Lesevorgänge, die nicht zugeordnet wurden oder die mehreren Loci zugeordnet wurden.Die Karten- und RSeQC-Statistiken können verwendet werden, um den Prozentsatz der Messenger-RNAs, intronischen und intergenen Basen zu bestimmen, die in den zugeordneten Lesevorgängen vorhanden sind. Für diese repräsentativen Analysen hatten einige degradierte Bibliotheken eine drei Primierungsverzerrung, in der mehr Lesevorgänge näher an den drei Primierungen als an den fünf Primierungszielen abgebildet wurden. Darüber hinaus kann eine Hauptkomponentenanalyse durchgeführt werden, um den Prozentsatz der Gesamtvariation zu bestimmen, die von den Hauptkomponenten für die biologischen Replikationen jeder Probe erfasst wird.Achten Sie darauf, Probendegradation zu vermeiden, Replikationen und mehrere Schichten für jede Probe vorzubereiten, die entsprechenden Metriken zu verwenden, um die Probenqualität zu bewerten, und die richtige Bibliotheksvorbereitungsmethode zu verwenden. Mit dieser Methode können größere NGS-Studien mit bisher unbrauchbaren FFPE-Proben mit unterschiedlichen Lagerzeiten und Bedingungen durchgeführt werden, um Einblicke in eine Vielzahl unterschiedlicher Krankheitszustände zu gewinnen. Diese Technik ebnete den Forschern den Weg, bestehende große Archive von FFPE-Proben mit umfangreichen klinischen Informationen zu untersuchen und kann bevölkerungsbasierte Krebsstudien erheblich verbessern.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-Sortierung und Exome Sequenzierung der Reed-Sternberg-Zellen des klassischen Hodgkin-Lymphoms

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Forschung

Genetik

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Der Nachweis von Copy Number Änderungen Single Cell-Sequenzierung

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimierung und Vergleichsanalyse von pflanzlichen organellaren DNA-Anreicherungsmethoden Geeignet für die Sequenzierung der nächsten Generation

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Erzeugung von nativen Chromatin Immunopräzipitation Sequenzierung Bibliotheken für Nukleosom Dichteanalyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunopräzipitation (ChIP) Protokoll für Low-Fülle embryonalen Proben

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robuste DNA-Isolierung und Hochdurchsatz-Sequenzierung Bibliotheksbau für Herbar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Seltenes Ereigniserkennung mit Fehler korrigiert DNA und RNA Sequenzierung

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Verstärkung des in der Nähe von Full-Length HIV-1 Proviruses für Next Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halbleitersequenzierung für Präimplantationsgenetische Tests für Aneuploidie

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequenzierung von mRNA aus Vollblut mit Nanopore-Sequenzierung

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...