Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

אנו אסירי תודה לד ר דניאל קרריק (חטיבת בקרת סרטן ומדעי האוכלוסין, המכון הלאומי לסרטן) לעזרה מתמשכת, במיוחד לייזום מחקר זה, מתן לנו דגימות, ולהצעות מועילות במהלך ניתוח נתונים. אנו מודים בכנות לכל חברי מתקן הרצף CCR במעבדה הלאומית פרדריק לחקר הסרטן לעזרתם במהלך ההכנה לדוגמה ורצף, במיוחד ברנדה הו לקבלת סיוע במדגם QC, אוקסנה גרמנית עבור הספריה QC, טטיאנה סמירנוף עבור הפעלת הנצנצים. אנחנו גם רוצים להודות Tsai-שן וויי אשלי וולטון ברצף מתקן ביואינפורמטיקה קבוצה לעזרה עם ניתוח נתונים ו-RNA-seq צינור היישום. אנו מודים גם CCBR ו-NCBR לקבלת סיוע עם צינור ניתוח RNaseq ופיתוח שיטות עבודה מומלצות.

1. כמות RNA ואיכות הערכה
<ol><li>בחר את דגימות FFPE על פי קריטריונים מוגדרים מראש ולחלץ RNA באמצעות שיטה מתאימה (g., ערכת הפקת חומצות הגרעין של FFPE, טבלת חומרים). הערה: ישנן מספר שיטות שונות הזמינות עבור מיצוי ffpe-RNA, כולל שיטות מיקרו לחיתוך חדש שיכול לעבוד עם רקמות מעט מאוד לחלץ באיכות טובה RNA<...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

השיטה המתוארת כאן מתארת את הצעדים העיקריים הנדרשים לקבלת נתוני רצף טובים מדגימות FFPE-RNA. הנקודות העיקריות לשקול עם שיטה זו הם: (1) ודא כי ה-RNA נשמר הטוב ביותר ככל האפשר לאחר החילוץ על ידי מזעור הטיפול לדוגמה, הקפאת והפשרה מחזורים. הפרדת מסדר QC מסייעת רבות. (2) השתמש במדד QC שהוא הטוב ביותר עבור ערכ...

השימוש בגישות הדור הבא איפשר לנו ללקט שפע של מידע מסוגים שונים של דגימות. עם זאת, מדגמים ישנים ומשומרים שנשמרו אינם מעשיים עבור השיטות הנפוצות של יצירת נתוני רצף ולעיתים קרובות דורשות שינויים בפרוטוקולים מבוססים היטב. רקמות ffpe לייצג סוג כזה מדגם כי כבר מנוצל נרחב עבור דגימות קליניות1,2,3. בעוד שימור FFPE שומר מורפולוגיה רקמות, חומצות גרעין ברקמות FFPE בדרך כלל מוצג מגוון רחב של נזק והשפלה, מה שמקשה לאחזר את המידע גנומית שעשוי להוביל תובנות חשובות על מנגנונים מולקולריים בבסיס הפרעות שונות.
ביטוי גנים נתונים שנוצרו על-ידי רצפי RNA הוא לעתים קרובות אינסטרומנטלי בלימוד מחלות ומנגנוני התנגדות ומשלים ניתוח מוטציה DNA. עם זאת, RNA הוא פגיע יותר השפלה, מה שהופך אותו מאתגר יותר להפיק נתונים ביטוי גנים מדויקים מרקמות FFPE. יתרה מזאת, מכיוון שהזמינות הרחבה והזולה של רצפי הרצף התבצעה לאחרונה, דגימות ישנות יותר לא אוחסנו לעתים קרובות בתנאים הנדרשים לשמירה על שלמות ה-RNA. חלק מהנושאים של דגימות FFPE כוללים השפלה של RNA עקב הטבעה של פרפין, שינוי כימי של RNA המוביל פיצול או refractoriness לתהליכים אנזימטיים הנדרש לרצף, ואובדן של זנבות פולי, הגבלת הישימות של oligo-dT כמו פריימר עבור היפוך טראנסקריפט4. אתגר נוסף הוא טיפול/אחסון של דגימות ffpe תחת תנאים מיטביים, אשר עשוי להוביל לירידה נוספת של מולקולות יציב משך כגון RNA ברקמות5. זה רלוונטי במיוחד עבור דגימות ישנות שייתכן שנאספו בזמן כאשר ניתוח ביטוי גנטי על ידי רצפי RNA לא ציפינו לדגימות. כל אלה להוביל לירידה באיכות וכמות של RNA שחולצו זמין ליצירת נתונים רצף שימושי. ההסתברות הנמוכה של הצלחה, בשילוב עם עלות גבוהה של רצף, יש הניאך חוקרים רבים מלנסות ליצור ולנתח את הנתונים ביטוי גנים מדגימות FFPE שימושי פוטנציאלי. כמה מחקרים בשנים האחרונות הפגינו שימושיות של רקמות ffpe עבור ניתוח ביטוי גנטי2,6,7,8,9, אם כי עבור פחות ו/או יותר דוגמאות לאחרונה.
כמחקר היתכנות, השתמשנו RNA שחולצו מתוך דגימות מרקמת הגידול FFPE של שלושה מאגרים רקמת שיורית מ מעקב, אפידמיולוגיה, ותוצאות סוף (הנביא) סרטן הרישומים עבור רצפי RNA וביטוי גנטי ניתוח10. הושגו ממעבדות פתולוגיה קלינית, רקמות ffpe של השחלות הגבוהה נסיובי אדנוקרצינומות אוחסנו מ 7 – 32 שנים בתנאים משתנים לפני החילוץ RNA. כי ברוב המקרים בלוקים אלה אוחסנו באתרים שונים במשך שנים ללא ציפייה של כל ניתוח גנטי רגיש בעתיד, לא הרבה טיפול נלקח כדי לשמר את חומצות גרעין. כך, רוב הדגימות הציגו RNA באיכות ירודה, עם חלק גדול של דגימות מזוהם עם חיידקים. עם זאת, הצלחנו לבצע כימות גנים, למדוד את האחידות ואת ההמשכיות של כיסוי גנים, ולבצע את ניתוח מתאם פירסון בין משכפל ביולוגי כדי למדוד את התוכנות. מבוסס על קבוצה של מפתח חתימה הפאנל הגן, השוונו את הדגימות במחקר שלנו עם הגנום של סרטן אטלס (TCGA) הנתונים ואישר כי כ 60% של דגימות היה ביטוי גנים דומה פרופילים11. בהתבסס על הקורלציה בין תוצאות QC שונות ומטא-נתונים לדוגמה, זיהינו מדדי QC מרכזיים בעלי ערך ניבוי טוב לזיהוי דגימות שסבירות גבוהה יותר להפקת נתונים רצף שמישים11.
כאן נתאר את המתודולוגיה המשמשת להערכת איכות של FFPE-RNA, יצירת ספריות ברצף החל מדגימות RNA שחולצו, וניתוח ביולוגי של נתוני הרצף.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

ביטוי גנטי ניתוח על-ידי רצפי RNA (RNA-seq) מאפשר תובנות ייחודיות לתוך דגימות קליניות שעלולות להוביל להבנת המנגנון של הבסיס למחלות שונות, כמו גם התנגדות ו/או מנגנוני הרגישות. עם זאת, רקמות FFPE, המייצגים את השיטה הנפוצה ביותר לשימור מורפולוגיה של רקמות בדגימות קליניות, אינן המקורות הטובים ביותר לניתוח ביטוי גנטי בפרופיל. ה-RNA שהושג מדגימות כאלה הוא מפורק לעתים קרובות, מפוצל, ושונה כימית, אשר מוביל לספריות רצפי משנה מיטביות. בתורו, אלה ליצור נתוני רצף באיכות ירודה שאינם אמינים עבור ניתוח ביטוי גנים גילוי מוטציה. כדי לעשות את המרב מדגימות FFPE ולהשיג את הנתונים הטובים ביותר האפשריים מדגימות באיכות נמוכה, חשוב לנקוט אמצעי זהירות מסוימים תוך תכנון תכנון ניסיוני, הכנת ספריות ברצף ובמהלך ניתוח נתונים. הדבר כולל את השימוש במדדים המתאימים לבקרת איכות מדויקת (QC), המזהה את השיטות הטובות ביותר לשלבים שונים במהלך יצירת הספריות ברצף, והקפד על הספרייה QC. בנוסף, החלת כלי תוכנה נכונה ופרמטרים עבור ניתוח נתונים רצף הוא קריטי על מנת לזהות פריטים בנתוני RNA-seq, לסנן את הזיהום באיכות נמוכה קורא, להעריך אחידות של כיסוי גנים, ולמדוד את הגישה המתוכנת של פרופילי ביטוי גנים בין משכפל ביולוגי. שלבים אלה יכולים להבטיח דיוק גבוה ומהווה התוכסות ליצירת פרופיל של דגימות RNA הטרוגנית מאוד. כאן אנו מתארים את השלבים השונים עבור מדגם QC, הכנה לספרייה ו-QC, רצף וניתוח נתונים שיכולים לסייע להגדיל את כמות הנתונים השימושיים שהתקבלו מ-RNA באיכות נמוכה, כגון זה שהתקבל מרקמות FFPE-RNA.

המתודולוגיה שתוארה לעיל הוחלה על 67 FFPE דגימות שאוחסנו תחת מגוון של תנאים שונים עבור 7 – 32 שנים (המדגם החציוני זמן אחסון היה 17.5 שנים). תוצאות ערכת הנתונים והניתוח שהוצגו כאן תוארו בעבר ופורסמו בז ואח '11. על בדיקת איכות המדגם כמתואר קודם (כלומר, עקבות למשל באיור 2), DV<...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

שיטה זו מתארת את השלבים כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני הרצף שניתן להשיג באמצעות דגימות RNA מוטבעות (FFPE) קבועות של שעווה מוטבעת של formalin. אנו מתארים את המתודולוגיה להעריך יותר במדויק את האיכות של הדגימות FFPE-RNA, להכין ספריות ברצף, ולנתח את הנתונים מ FFPE-RNA דגימות.

אופטימיזציה לרצף וניתוח של הירידה FFPE-בדיקות RNA

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

ניתן להשתמש בפרוטוקול שלנו כדי לשפר את האיכות והכמות של נתוני ביטוי גנים הנוצרים מדגימות RNA שמקורן ב- FFPE, במיוחד בדגימות איכות תת-אופטימליות. טכניקה זו מעריכה את איכות ה- RNA בדגימות רקמת FFPE ומאפשרת אופטימיזציה של העיבוד במורד הזרם שלהם כדי לשפר את הכמות והאיכות של נתוני רצף הדגימה. שיטה זו מאפשרת אפיון מקיף של תעתיק בדגימה ביולוגית וקלינית ועשויה לספק תובנה לגבי אלמנטים תפקודיים של הגנום בהתפתחות ומחלות.השפלת FFPE-RNA ובחירת השיטות עבור QC לדוגמה, הכנת ספריה, וניתוח נתונים יכול להיות כל מאוד מסובך. הקפד לבחור את השיטות הנכונות ואת הפקדים המתאימים. הדגמה חזותית מאפשרת לצופים להתבונן בשינויים ואמצעי הזהירות העדינים הקטנים הדרושים במהלך התכנון, ההערכה ותהליך רצף במיוחד עבור דגימות FFPE שהשתמרו בצורה גרועה.כדי לבדוק את האיכות של מדגם RNA, להפעיל את המדגם על מערכת QC RNA על פי הוראות היצרן ולהשתמש בתוכנת bioanalysis המתאימה כדי לנתח את ההפצה של שברי RNA בתוך המדגם כדי לחשב את שיעור שברים יותר מ 100 ו 200 נוקלאוטידים. בהתבסס על מדדי QC, זהה את הדגימות עם פחות מ- 40% מהקטעים שאורךם יותר מ- 100 נוקלאוטידים כדי לאפשר אי-הכללה של דגימות אלה לעיבוד. לריקד, מפשירים את ערכות הרווקות המתאימות לפי פרמטרי הריצה באמבט מים בטמפרטורת החדר ומנחים את מגש הרייטנס בארבע מעלות צלזיוס לאחר הפשרה.מניחים את חבילת תא הזרימה בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. בזמן שהחבילה מתחממת, פתחו את היישום Illumina Experiment Manager ובחרו 'צור גיליון לדוגמה'. בחר את הרצף בו יש להשתמש ולחץ על הבא.הזן את ברקוד ערכת הריג'נט ואת הפרמטרים המתאימים האחרים של זרימת העבודה. לאחר מכן העלה גיליון לדוגמה שנוצר בהתאם לקריטריוני הרצף של אילומינה. כדי להכין את הספרייה לדוגמה ואת ספריית הבקרה PhiX, denature ולדלל את הספריות לריכוזים המתאימים ולערבב את המדגם ואת ספריות הבקרה PhiX כדי לקבל יחס נפח בקרה 5%PhiX.כאשר תאי הזרימה מוכנים, להסיר את העטיפה, לנקות את משטח הזכוכית עם לנגב אלכוהול ללא מוך, ולייבש את הזכוכית עם רקמת מעבדה מוך נמוך. הסר את מחסנית הריג'נט מאחסון של ארבע מעלות צלזיוס והפוך את המחסנית חמש פעמים כדי לערבב את הראוגנטים. הקישו בעדינות על המחסנית על הספסל כדי להפחית את בועות האוויר ולדעון את הדגימה המדולללת והמדולרת לתוך מחסנית הריג'נט במאגר המיועד.טען את תא הזרימה, מחסנית המאגר ומחסנית הריג'נט למערכת. לאחר מכן בצע בדיקה אוטומטית וסקור את הפלט כדי להבטיח ש הפרמטרים של ההפעלה יעברו את בדיקת המערכת. לאחר השלמת הסימון האוטומטי, בחר התחל כדי להתחיל את הפעלת הריצוף.כדי להמחיש את תוצאות QC קדם-עיבוד ו- QC לאחר יישור, הפעל מרובה QC כדי ליצור דוח מצטבר בתבנית HTML. כדי לקבוע אפקטי אצווה ולהעריך את מפת האיכות של ערכת הנתונים הנתנה, השתמש בקובץ Script של R כדי להפעיל ניתוח רכיבים ראשי. לאחר מכן ניתן לבצע ניתוח מתאם לדוגמה באמצעות מתאם פירסון בין דגימות שונות.הערכת שיעור שברים ארוכים מ-100 נוקלאוטידים שימושית יותר מהערכת הקטעים שמשך זמן רב יותר מ-200 נוקלאוטידים, משום שהיא רגישה יותר למדידה מדויקת של שיעור גדלי שברים קטנים יותר עבור דגימות RNA מושפלות מאוד. בהתחשב ברמה הגבוהה של השפלה בקבוצה מדגם, שיטת הכנה הכוללת ספריית RNA מומלץ. לדוגמה, כאן מוצגות ספריות רצף שהוכנו מארבע דוגמאות שונות.כאן מוצגות סקירות של איכות רצף קבצים גולמי של FastQ ותוכן מתאם לדוגמה. סינון FastQC יכול לעזור לזהות זיהום כגון זיהום חיידקי או עכבר בתוך הדגימות. ניתן להשתמש ביישור STAR כדי לקבוע את שיעור הקריאות הממופות לגנום הייחוס, את אחוז ההפניות הממופות באופן ייחודי לגנום הייחוס ואת שיעור ההפניות שלא מופו, או ש מופו ללוצ'י מרובים.ניתן להשתמש בסטטיסטיקות הכרטיס וה- RSeQC כדי לקבוע את אחוז ה- RNAs של השליחים, הבסיסים האסטרוניים והבין-גניים הקיימים בקריאה הממופה. עבור ניתוחים מייצגים אלה, כמה ספריות מושפלות היו שלוש הטיה עיקרית שבה קריאות יותר מופו קרוב יותר לשלושה פריים מאשר לסוף חמשת הפריים. בנוסף, ניתוח רכיבים עיקריים יכול להתבצע כדי לקבוע את אחוז הווריאציה הכוללת שנלכדה על ידי הרכיבים העיקריים עבור השכפולים הביולוגיים של כל מדגם.יש לדאוג כדי למנוע השפלה מדגם, להכין שכפולים ומעילים מרובים עבור כל מדגם, להשתמש במדדים המתאימים כדי להעריך את איכות המדגם, ולהשתמש בשיטת הכנת הספרייה הנכונה. באמצעות מתודולוגיה זו, מחקרי NGS גדולים יותר יכולים להתבצע עם דגימות FFPE שלא היו שמיש בעבר עם זמני אחסון ותנאי אחסון משתנים כדי לקבל תובנות על מגוון מצבי מחלה שונים. טכניקה זו סללה את הדרך לחוקרים לחקור ארכיונים גדולים קיימים של מדגם FFPE עם מידע קליני עשיר והוא יכול לשפר מאוד מחקרי סרטן מבוססי אוכלוסייה.

optimization-for-sequencing-and-analysis-of-degraded-ffpe-rna-samples

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically comprise less than 1% of the tumor mass. Material derived from bulk tumor contains tumor content at a concentration insufficient for characterization. Therefore, fluorescence activated cell sorting using eight antibodies, as well as side- and forward-scatter, is described here as a method of rapidly separating and concentrating with high purity thousands of HRS cells from the tumor for subsequent study. At the same time, because standard protocols for exome sequencing typically require 100-1,000 ng of input DNA, which is often too high, even with flow sorting, we also provide an optimized, low-input library construction protocol capable of producing high-quality data from as little as 10 ng of input DNA. This combination is capable of producing next-generation libraries suitable for hybridization capture of whole-exome baits or more focused targeted panels, as desired. Exome sequencing of the HRS cells, when compared against healthy intratumor T or B cells, can identify somatic alterations, including mutations, insertions and deletions, and copy number alterations. These findings elucidate the molecular biology of HRS cells and may reveal avenues for targeted drug treatments.

Here, we describe a combined flow cytometric cell sorting and low-input, next-generation library construction protocol designed to produce high-quality, whole-exome data from the Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) cells of classical Hodgkin lymphoma (CHL).

זרימה מיון ו Exome רצף של תאים ריד סטרנברג של לימפומה קלאסית הודג&#39;קין

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic fragments. Organellar genomes also exist in admixtures within a given cell or tissue type (heteroplasmy), and an abundance of subtypes may change throughout development or when under stress (sub-stoichiometric shifting). Next-generation sequencing (NGS) technologies are required to obtain deeper understanding of organellar genome structure and function. Traditional sequencing studies use several methods to obtain organellar DNA: (1) If a large amount of starting tissue is used, it is homogenized and subjected to differential centrifugation and/or gradient purification. (2) If a smaller amount of tissue is used (i.e., if seeds, material, or space is limited), the same process is performed as in (1), followed by whole-genome amplification to obtain sufficient DNA. (3) Bioinformatics analysis can be used to sequence the total genomic DNA and to parse out organellar reads. All these methods have inherent challenges and tradeoffs. In (1), it may be difficult to obtain such a large amount of starting tissue; in (2), whole-genome amplification could introduce a sequencing bias; and in (3), homology between nuclear and organellar genomes could interfere with assembly and analysis. In plants with large nuclear genomes, it is advantageous to enrich for organellar DNA to reduce sequencing costs and sequence complexity for bioinformatics analyses. Here, we compare a traditional differential centrifugation method with a fourth method, an adapted CpG-methyl pulldown approach, to separate the total genomic DNA into nuclear and organellar fractions. Both methods yield sufficient DNA for NGS, DNA that is highly enriched for organellar sequences, albeit at different ratios in mitochondria and chloroplasts. We present the optimization of these methods for wheat leaf tissue and discuss major advantages and disadvantages of each approach in the context of sample input, protocol ease, and downstream application.

The comparison and optimization of two plant organellar DNA enrichment methods are presented: traditional differential centrifugation and fractionation of the total gDNA based on methylation status. We assess the resulting DNA quantity and quality, demonstrate performance in short-read next-generation sequencing, and discuss the potential for use in long-read single-molecule sequencing.

מיטוב וניתוח השוואתי של הצמח DNA Organnelar העשרה שיטות מתאים עבור הדור הבא רצף

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution based analysis methodology (nucleosome density ChIP-seq; ndChIP-seq) that enables the generation of combined measurements of micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification genome-wide. Nucleosome position and local density, and the posttranslational modification of their histone subunits, act in concert to regulate local transcription states. Combinatorial measurements of nucleosome accessibility with histone modification generated by ndChIP-seq allows for the simultaneous interrogation of these features. The ndChIP-seq methodology is applicable to small numbers of primary cells inaccessible to cross-linking based ChIP-seq protocols. Taken together, ndChIP-seq enables the measurement of histone modification in combination with local nucleosome density to obtain new insights into shared mechanisms that regulate RNA transcription within rare primary cell populations.

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) methodology for the generation of sequence datasets suitable for a nucleosome density ChIP-seq analytical framework integrating micrococcal nuclease (MNase) accessibility with histone modification measurements.

דור של כרומטין יליד Immunoprecipitation רצף ספריות לניתוח צפיפות נוקלאוזום

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

כרומטין פרוטוקול Immunoprecipitation (ChIP) עבור דגימות עובריים נמוך-שפע

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with a number of challenges including sample preservation quality, degraded DNA, and destructive sampling of rare specimens. In order to more effectively use herbarium material in large sequencing projects, a dependable and scalable method of DNA isolation and library preparation is needed. This paper demonstrates a robust, beginning-to-end protocol for DNA isolation and high-throughput library construction from herbarium specimens that does not require modification for individual samples. This protocol is tailored for low quality dried plant material and takes advantage of existing methods by optimizing tissue grinding, modifying library size selection, and introducing an optional reamplification step for low yield libraries. Reamplification of low yield DNA libraries can rescue samples derived from irreplaceable and potentially valuable herbarium specimens, negating the need for additional destructive sampling and without introducing discernible sequencing bias for common phylogenetic applications. The protocol has been tested on hundreds of grass species, but is expected to be adaptable for use in other plant lineages after verification. This protocol can be limited by extremely degraded DNA, where fragments do not exist in the desired size range, and by secondary metabolites present in some plant material that inhibit clean DNA isolation. Overall, this protocol introduces a fast and comprehensive method that allows for DNA isolation and library preparation of 24 samples in less than 13 h, with only 8 h of active hands-on time with minimal modifications.

This article demonstrates a detailed protocol for DNA isolation and high-throughput sequencing library construction from herbarium material including rescue of exceptionally poor-quality DNA.

DNA חזקים בידוד ובנייה ספריית רצף תפוקה גבוהה עבור דגימות עשבייה

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

אירוע נדיר איתור שגיאות DNA ו RNA רצף

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near full-length (intact and defective), HIV-1 proviruses. FLIPS allows determination of the genetic composition of integrated HIV-1 within a cell population. Through identifying defects within HIV-1 proviral sequences that arise during reverse transcription, such as large internal deletions, deleterious stop codons/hypermutation, frameshift mutations, and mutations/deletions in cis acting elements required for virion maturation, FLIPS can identify integrated proviruses incapable of replication. The FLIPS assay can be utilized to identify HIV-1 proviruses that lack these defects and are&#160;therefore potentially replication-competent. The FLIPS protocol involves: lysis of HIV-1 infected cells, nested PCR of near full-length HIV-1 proviruses (using primers targeted to the HIV-1 5&#39; and 3&#39; LTR), DNA purification and quantification, library preparation for Next-generation Sequencing (NGS), NGS, de novo assembly of proviral contigs, and a simple process of elimination for identifying replication-competent proviruses. FLIPS provides advantages over traditional methods designed to sequence integrated HIV-1 proviruses, such as single-proviral sequencing. FLIPS amplifies and sequences near full-length proviruses enabling replication competency to be determined, and also uses fewer amplification primers, preventing the consequences of primer mismatches. FLIPS is a useful tool for understanding the genetic landscape of integrated HIV-1 proviruses, especially within the latent reservoir, however, its utilization can extend to any application in which the genetic composition of integrated HIV-1 is required.

Full-length individual proviral sequencing (FLIPS) provides an efficient and high-throughput method for the amplification and sequencing of single, near full-length (intact and defective) HIV-1 proviruses and allows for determination of their potential replication-competency. FLIPS overcomes limitations of previous assays designed to sequence the latent HIV-1 reservoir.

הגברה של יד באורך מלא הפרו-וירוס HIV-1 עבור הדור הבא רצפי

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented in human embryos. Preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) is a genetic test that significantly improves reproductive outcomes by detecting chromosomal abnormalities of embryos. Next-generation sequencing (NGS) provides a high-throughput and cost-effective approach for genetic analysis and has shown clinical applicability in PGT-A. Here, we present a rapid and low-cost semiconductor sequencing-based NGS method for screening of aneuploidy in embryos. The first step of the workflow is whole genome amplification (WGA) of the biopsied embryo specimen, followed by construction of sequencing library, and subsequent sequencing on the semiconductor sequencing system. Generally, for a PGT-A application, 24 samples can be loaded and sequenced on each chip generating 60&#8722;80 million reads at an average read length of 150 base pairs. The method provides a refined protocol for performing template amplification and enrichment of sequencing library, making the PGT-A detection reproducible, high-throughput, cost-efficient, and timesaving. The running time of this semiconductor sequencer is only 2&#8722;4 hours, shortening the turnaround time from receiving samples to issuing reports into 5 days. All these advantages make this assay an ideal method to detect chromosomal aneuploidies from embryos and thus, facilitate its wide application in PGT-A.

Here, we introduce a semiconductor sequencing method for preimplantation genetic testing for aneuploidy (PGT-A) with the advantages of short turnaround time, low cost, and high throughput.

רצפי מוליכים למחצה עבור השרשה בדיקה גנטית עבור אנאפלואידיה

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, and was deployed to West Africa during the recent Ebola virus epidemic, highlighting this possibility. In addition to its practical advantages (low cost, ease of equipment transport and use), this technology also provides fundamental advantages over second-generation sequencing approaches, particularly the very long read length, ability to directly sequence RNA, and real-time availability of data. Raw read accuracy is lower than with other sequencing platforms, which represents the main limitation of this technology; however, this can be partially mitigated by the high read depth generated. Here, we present a field-compatible protocol for sequencing of the mRNAs encoding for Niemann-Pick C1, which is the cellular receptor for ebolaviruses. This protocol encompasses extraction of RNA from animal blood samples, followed by RT-PCR for target enrichment, barcoding, library preparation, and the sequencing run itself, and can be easily adapted for use with other DNA or RNA targets.

Nanopore sequencing is a novel technology that allows cost-effective sequencing in remote locations and resource-poor settings. Here, we present a protocol for sequencing of mRNAs from whole blood that is compatible with such conditions.

רצף של mRNA מתוך דם שלם באמצעות רצפי Nanopore

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...