Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
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Siamo grati alla Dott.ssa Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) per l'aiuto continuo, in particolare per l'introduzione di questo studio, fornendoci i campioni e per suggerimenti utili durante l'analisi dei dati. Ringraziamo sinceramente tutti i membri del CCR Sequencing Facility presso il Frederick National Laboratory for Cancer Research per il loro aiuto durante la preparazione del campione e il sequenziamento, in particolare Brenda Ho per l'assistenza nel campione QC, Oksana German per la biblioteca QC, Tatyana Smirnova per l'esecuzione dei sequencer. Vorremmo anche ringraziare Tsai-wei Shen e Ashley Walton presso Sequencing Facility Bioinformatics Group per aver contribuito con l'analisi dei dati e l'implementazione della pipeline RNA-seq. Ringraziamo anche CCBR e NCBR per assistenza con la pipeline di analisi RNaseq e lo sviluppo di best practice.

1. Quantità di RNA e valutazione della qualità
<ol><li>Selezionare i campioni FFPE in base a criteri predefiniti ed estrarre l'RNA utilizzando un metodo appropriato (ad esempio, kit di estrazione acido FFPE-nuclei, tabella dei materiali). NOTA: Ci sono diversi metodi disponibili per l'estrazione FFPE-RNA, tra cui i metodi di microdissezione più recenti che possono funzionare con pochissimi tessuti ed estrarre RNA di buona qualità12,13<su...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

Il metodo descritto qui descrive i passaggi principali necessari per ottenere buoni dati di sequenza da campioni di FFPE-RNA. I punti principali da considerare con questo metodo sono: (1) Assicurarsi che l'RNA sia preservato al meglio dopo l'estrazione riducendo al minimo la manipolazione del campione e il congelamento e lo scongelamento dei cicli. Aliquote QC separate sono molto utili. (2) Utilizzare una metrica QC che è migliore per il set di campioni specificato. I valori RIN e DV200 spesso non sono utili ...

L'uso di approcci di sequenziamento di nuova generazione ci ha permesso di ottenere una grande quantità di informazioni da vari tipi di campioni. Tuttavia, i campioni vecchi e mal conservati rimangono inutilizzabili per i metodi comunemente utilizzati per generare dati di sequenza e spesso richiedono modifiche a protocolli consolidati. I tessuti FFPE rappresentano un tale tipo di campione che è stato ampiamente utilizzato per i campioni clinici1,2,3. Mentre la conservazione FFPE mantiene la morfologia dei tessuti, gli acidi nucleici nei tessuti FFPE di solito presentano una vasta gamma di danni e degradazione, rendendo difficile recuperare le informazioni genomiche che possono portare a importanti intuizioni sui meccanismi molecolari alla base di vari disturbi.
I dati sull'espressione genica generati dal sequenziamento dell'RNA sono spesso fondamentali per studiare i meccanismi di malattia e resistenza e integrano l'analisi della mutazione del DNA. Tuttavia, l'RNA è più suscettibile alla degradazione, il che rende più difficile generare dati accurati sull'espressione genica dai tessuti FFPE. Inoltre, poiché l'ampia disponibilità e convenienza del sequenziamento è relativamente recente, gli esemplari più vecchi spesso non sono stati immagazzinati nelle condizioni necessarie per preservare l'integrità dell'RNA. Alcuni dei problemi per i campioni di FFPE includono la degradazione dell'RNA a causa dell'incorporamento in paraffina, la modifica chimica dell'RNA che porta alla frammentazione o alla refrattanza ai processi enzimatici necessari per il sequenziamento e la perdita delle code poli-A, limitando l'applicabilità dell'oligo-dT come primer per la tranciatura inversa4. Un'altra sfida è la manipolazione/archiviazione di campioni di FFPE in condizioni non ottimali, che può portare a un'ulteriore degradazione delle molecole labili come l'RNA nei tessuti5. Ciò è particolarmente rilevante per i campioni più vecchi che potrebbero essere stati raccolti in un momento in cui l'analisi dell'espressione genica mediante il sequenziamento dell'RNA non era prevista per i campioni. Tutto ciò porta a una diminuzione della qualità e della quantità dell'RNA estratto disponibili per la generazione di dati di sequenza utili. La bassa probabilità di successo, combinata con l'alto costo del sequenziamento, ha dissuaso molti ricercatori dal cercare di generare e analizzare i dati dell'espressione genica da campioni FFPE potenzialmente utili. Alcuni studi negli ultimi anni hanno dimostrato l'usabilità dei tessuti FFPE per l'analisi dell'espressione genica2,6,7,8,9, anche se per meno campioni e/o più recenti.
Come studio di fattibilità, abbiamo utilizzato l'RNA estratto da campioni di tessuto tumorale FFPE da tre repository di tessuti residui da registri di sorveglianza, epidemiologia e risultati finali (SEER) per il sequenziamento dell'RNA e l'analisi dell'espressione genica10. Procurati da laboratori di patologia clinica, i tessuti FFPE da adenocarcinomi sigillanti ovarici di alta qualità sono stati conservati da 7 a 32 anni in condizioni variabili prima dell'estrazione dell'RNA. Poiché nella maggior parte dei casi questi blocchi erano stati immagazzinati in siti diversi per anni senza l'aspettativa di alcuna analisi genetica sensibile in futuro, non era stata prestata molta attenzione per preservare gli acidi nucleici. Così, la maggior parte dei campioni esibivano RNA di scarsa qualità, con una grande percentuale di campioni contaminati da batteri. Tuttavia, siamo stati in grado di eseguire la quantificazione genica, misurare l'uniformità e la continuità della copertura genica ed eseguire l'analisi della correlazione di Pearson tra repliche biologiche per misurare la riproducibilità. Sulla base di una serie di pannelli genetici chiave, abbiamo confrontato i campioni nel nostro studio con i dati di The Cancer Genome Atlas (TCGA) e abbiamo confermato che circa il 60% dei campioni aveva profili di espressione genica comparabili11. In base alla correlazione tra vari risultati QC e metadati di esempio, abbiamo identificato le metriche chiave di Controllo qualità che hanno un buon valore predittivo per identificare i campioni che hanno maggiori probabilità di generare dati di sequenza utilizzabili11.
Qui descriviamo la metodologia utilizzata per la valutazione della qualità FFPE-RNA, la generazione di librerie di sequenziamento a partire da campioni di RNA estratti e l'analisi bioinformatica dei dati di sequenziamento.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

L'analisi dell'espressione genica mediante il sequenziamento dell'RNA (RNA-seq) consente informazioni uniche su campioni clinici che possono potenzialmente portare a una comprensione meccanicistica della base di varie malattie, nonché ai meccanismi di resistenza e/o suscettibilità. Tuttavia, i tessuti FFPE, che rappresentano il metodo più comune per preservare la morfologia dei tessuti nei campioni clinici, non sono le migliori fonti per l'analisi della profilazione dell'espressione genica. L'RNA ottenuto da tali campioni è spesso degradato, frammentato e modificato chimicamente, il che porta a librerie di sequenziamento non ottimali. A loro volta, questi generano dati di sequenza di scarsa qualità che potrebbero non essere affidabili per l'analisi dell'espressione genica e la scoperta della mutazione. Al fine di sfruttare al meglio i campioni FFPE e ottenere i migliori dati possibili da campioni di bassa qualità, è importante prendere alcune precauzioni durante la pianificazione della progettazione sperimentale, la preparazione delle librerie di sequenziamento e durante l'analisi dei dati. Ciò include l'uso di metriche appropriate per un controllo qualità di esempio preciso (QC), l'identificazione dei metodi migliori per i vari passaggi durante la generazione della libreria di sequenziamento e un'attenta libreria QC. Inoltre, l'applicazione di strumenti software e parametri corretti per l'analisi dei dati di sequenza è fondamentale per identificare gli artefatti nei dati RNA-seq, filtrare la contaminazione e leggere di bassa qualità, valutare l'uniformità della copertura genica e misurare la riproducibilità dei profili di espressione genica tra le repliche biologiche. Questi passaggi possono garantire un'elevata precisione e riproducibilità per la profilazione di campioni di RNA molto eterogenei. Qui descriviamo i vari passaggi per il QC di esempio, la preparazione della libreria e il QC, il sequenziamento e l'analisi dei dati che possono contribuire ad aumentare la quantità di dati utili ottenuti da RNA di bassa qualità, come quello ottenuto dai tessuti FFPE-RNA.

La metodologia descritta in precedenza è stata applicata a 67 campioni di FFPE che erano stati conservati in una varietà di condizioni diverse per 7-32 anni (il tempo di conservazione dei campioni mediani era di 17,5 anni). I dati del set di dati e dell'analisi qui presentati sono stati descritti in precedenza e pubblicati in. Per controllare la qualità del campione come descritto in precedenza (ad esempio, le tracce di esempio nella figura 2),DV100 è r...

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Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Questo metodo descrive i passaggi per migliorare la qualità e la quantità dei dati di sequenza che possono essere ottenuti da campioni di RNA incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE). Descriviamo la metodologia per valutare in modo più accurato la qualità dei campioni di FFPE-RNA, preparare le librerie di sequenziamento e analizzare i dati provenienti da campioni DI FFPE-RNA.

Ottimizzazione per il sequenziamento e l'analisi di campioni FFPE-RNA degradati

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Il nostro protocollo può essere utilizzato per migliorare la qualità e la quantità dei dati di espressione genica generati da campioni di RNA derivati da FFPE, specialmente in campioni di qualità non ottimale. Questa tecnica valuta la qualità dell'RNA all'interno dei campioni di tessuto FFPE e consente l'ottimizzazione della loro elaborazione a valle per migliorare la quantità e la qualità dei dati di sequenziamento del campione. Questo metodo consente la caratterizzazione completa di una trascrizione in campione biologico e clinico e può fornire informazioni su elementi funzionali del genoma nello sviluppo e nella malattia.La degradazione dell'FFPE-RNA e la selezione dei metodi per il QC del campione, la preparazione della libreria e l'analisi dei dati possono essere tutti molto difficili. Sii meticoloso quando selezioni i metodi giusti e i controlli appropriati. La dimostrazione visiva consente agli spettatori di osservare le piccole modifiche sottili e le precauzioni necessarie durante la pianificazione, la valutazione e il processo di sequenziamento, in particolare per campioni FFPE mal conservati.Per verificare la qualità del campione di RNA, eseguire il campione su un sistema RNA QC secondo le istruzioni del produttore e utilizzare l'appropriato software di bioanalisi per analizzare la distribuzione dei frammenti di RNA all'interno del campione e calcolare la proporzione di frammenti più lunghi di 100 e 200 nucleotidi. In base alle metriche QC, identificare i campioni con meno del 40% dei frammenti più lunghi di 100 nucleotidi per consentire l'esclusione di questi campioni dall'elaborazione. Per il sequenziamento, scongelare i kit di reagenti di sequenziamento appropriati in base ai parametri di corsa in un bagno d'acqua a temperatura ambiente e posizionare il vassoio del reagente a quattro gradi Celsius dopo lo scongelamento.Posizionare il pacchetto cella di flusso a temperatura ambiente per 30 minuti. Durante il riscaldamento del pacchetto, aprire l'applicazione Illumina Experiment Manager e selezionare Crea foglio di esempio. Selezionate il sequencer da utilizzare e fate clic su Avanti (Next).Immettere il codice a barre del kit di reagenti e gli altri parametri appropriati del flusso di lavoro. Quindi caricare un foglio di esempio creato in base ai criteri della sequenza Illumina. Per preparare la libreria di esempio e la libreria di controlli PhiX, denaturare e diluire le librerie alle concentrazioni appropriate e mescolare le librerie di controllo sample e PhiX per ottenere un rapporto volume di controllo PhiX del 5%.PhiX.Quando le celle di flusso sono pronte, rimuovere l'involucro, pulire la superficie del vetro con una salvietta alcolica priva di pelucchi e asciugare il vetro con un tessuto da laboratorio a bassa pelucchi. Rimuovere la cartuccia del reagente dallo stoccaggio di quattro gradi Celsius e invertire la cartuccia cinque volte per mescolare i reagenti. Toccare delicatamente la cartuccia sul banco per ridurre le bolle d'aria e caricare il campione denaturato e diluito nella cartuccia del reagente nel serbatoio designato.Caricare la cella di flusso, la cartuccia tampone e la cartuccia del reagente nel sistema. Quindi eseguire un controllo automatico ed esaminare l'output per assicurarsi che i parametri di esecuzione superino il controllo del sistema. Al termine del controllo automatico, selezionare Inizia per iniziare l'esecuzione del sequenziamento.Per visualizzare i risultati qc di pre-elaborazione e qc post-allineamento, eseguire multi-QC per generare un report aggregato in formato HTML. Per determinare gli effetti batch e valutare la mappa di qualità del set di dati specificato, utilizzare uno script R per eseguire un'analisi dei componenti principali. L'analisi di correlazione del campione può quindi essere effettuata utilizzando la correlazione di Pearson tra campioni diversi.La stima della proporzione di frammenti più lunghi di 100 nucleotidi è più utile di una stima dei frammenti più lunghi di 200 nucleotidi perché è più sensibile per misurare con precisione la proporzione di frammenti più piccoli per campioni di RNA altamente degradati. Dato l'alto grado di degradazione nel set di campioni, si consiglia un metodo di preparazione totale della libreria di RNA. Ad esempio, qui vengono mostrate librerie di sequenziamento preparate da quattro diversi campioni.Qui vengono visualizzate le panoramiche della qualità di sequenziamento dei file FastQ non elaborati e del contenuto dell'adattatore di esempio. Lo screening FastQC può aiutare a rilevare contaminazioni come la contaminazione batterica o del topo all'interno dei campioni. L'allineamento STAR può essere utilizzato per determinare la proporzione di letture mappate al genoma di riferimento, la percentuale di letture mappate in modo univoco al genoma di riferimento e la proporzione di letture che non sono state mappate o che sono state mappate a più loci.Le statistiche della scheda e della RSeQC possono essere utilizzate per determinare la percentuale di RRNA messaggero, basi introniche e intergeniche presenti nelle letture mappate. Per queste analisi rappresentative, alcune librerie degradate avevano un tre pregiudizio primo in cui più letture erano mappate più vicino ai tre primi che ai cinque primi. Inoltre, l'analisi dei componenti principali può essere eseguita per determinare la percentuale della variazione totale catturata dai componenti principali per le repliche biologiche di ciascun campione.Fare attenzione a evitare la degradazione del campione, preparare repliche e più mani per ogni campione, utilizzare le metriche appropriate per valutare la qualità del campione e utilizzare il metodo di preparazione della libreria corretto. Utilizzando questa metodologia, studi NGS più grandi possono essere eseguiti con campioni FFPE precedentemente inutilizzabili con tempi e condizioni di conservazione variabili per ottenere informazioni dettagliate su una varietà di stati di malattia diversi. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per studiare i grandi archivi esistenti del campione FFPE con ricche informazioni cliniche e può migliorare notevolmente gli studi sul cancro basati sulla popolazione.

Research

JoVE Journal

Genetics

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Selezione del flusso e sequenza di Exome delle cellule Reed-Sternberg del linfoma classico di Hodgkin

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Ricerca

Genetica

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