Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
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우리는 다니엘 캐릭 박사에게 감사드립니다 (암 통제 및 인구 과학의 부, 국립 암 연구소) 지속적인 도움, 특히이 연구를 시작하고, 샘플을 제공하고, 데이터 분석 중에 유용한 제안을 위해. 우리는 진심으로 샘플 준비 및 시퀀싱 동안 자신의 도움을 위해 암 연구를위한 프레드릭 국립 연구소의 CCR 시퀀싱 시설의 모든 구성원에게 감사드립니다, 샘플 QC에 도움을 특히 브렌다 호, 도서관 QC에 대한 옥사나 독일어, 시퀀서를 실행하기위한 타티아나 스미르노바. 우리는 또한 데이터 분석 및 RNA-seq 파이프라인 구현을 돕는 시퀀싱 시설 생물 정보학 그룹의 Tsai-wei Shen및 애슐리 월튼에게 감사드립니다. 또한 RNaseq 분석 파이프라인 및 모범 사례 개발에 대한 지원을 위해 CCBR 및 NCBR에 감사드립니다.

1. RNA 수량 및 품질 평가
<ol><li>미리 정의된 기준에 따라 FFPE 샘플을 선택하고 적절한 방법(예를 들어, FFPE-핵산 추출 키트, 재료 표)을사용하여 RNA를 추출한다. 참고 : FFPE-RNA 추출에 사용할 수있는 몇 가지 다른 방법이 있으며, 아주 적은 조직으로 작동하고 양질의 RNA12,13,,14를추출 할 수있는 새로운 미세 해부 방?...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. 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Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

여기에 설명된 방법은 FFPE-RNA 샘플에서 양호한 서열 데이터를 얻는 데 필요한 주요 단계를 간략하게 설명합니다. 이 방법으로 고려해야 할 주요 사항은 다음과 같습니다: (1) 샘플 취급 및 동결 및 해동 주기를 최소화하여 추출 후 RNA가 가능한 한 잘 보존되도록 하십시오. 별도의 QC aliquots는 매우 유용합니다. (2) 지정된 샘플 세트에 가장 적합한 QC 메트릭을 사용합니다. RIN 값 및 DV200은 종종 ...

차세대 염기서열 분석 방식을 사용하여 다양한 유형의 샘플에서 풍부한 정보를 얻을 수 있었습니다. 그러나 오래되고 잘 보존되지 않은 샘플은 시퀀스 데이터를 생성하는 일반적으로 사용되는 방법에 대해 작동하지 않으며 종종 잘 설정된 프로토콜을 수정해야 합니다. FFPE 조직은 임상 시편1,2,3에,3널리 활용되어 온 이러한 샘플 유형을 나타낸다. FFPE 보존은 조직 형태를 유지하는 동안, FFPE 조직에 있는 핵산은 일반적으로 각종 무질서의 밑에 분자 기계장치에 관하여 중요한 통찰력으로 이끌어 낼 수 있는 게놈 정보를 검색하는 것을 어렵게 만드는 손상 및 분해의 넓은 범위를 전시합니다.
RNA 염기서열 분석에 의해 생성된 유전자 발현 데이터는 종종 질병 및 저항 메커니즘을 연구하는 데 중요한 역할을 하며 DNA 돌연변이 분석을 보완합니다. 그러나, RNA는 FFPE 조직에서 정확한 유전자 발현 데이터를 생성하는 것이 더 도전적이기 때문에 분해에 더 취약합니다. 더욱이, 시퀀싱의 광범위한 가용성 및 경제성이 비교적 최근이기 때문에, 오래된 표본은 종종 RNA 무결성을 보존하는 데 필요한 조건에서 저장되지 않았다. FFPE 견본을 위한 문제점의 몇몇은 파라핀에 포함하기 때문에 RNA의 분해, 시퀀싱에 요구되는 효소 프로세스에 단편화 또는 불응성으로 이끌어 내는 RNA의 화학적 수정, 및 폴리 A 꼬리의 손실을 포함합니다, 역전사제4를위한 프라이머로 올리고-dT의 적용성을 제한하는. 또 다른 과제는 조직에 있는 RNA와 같은 불안정한 분자의 추가 저하로 이끌어 낼 수 있는 최적이 아닌 조건의 FFPE 견본의 취급/저장입니다5. 이것은 RNA 염기서열 분석에 의한 유전자 발현 분석이 견본을 위해 예상되지 않았을 때 한 번에 집합되었을 수 있는 오래된 견본을 위해 특히 관련이 있습니다. 이러한 모든 경우 유용한 서열 데이터를 생성하는데 사용할 수 있는 추출된 RNA의 품질 및 양이 감소합니다. 성공 확률이 낮고, 시퀀싱 비용이 높기 때문에 많은 연구자들이 잠재적으로 유용한 FFPE 샘플에서 유전자 발현 데이터를 생성하고 분석하지 못하게 되었습니다. 최근 몇 년 동안 의 몇몇 연구 결과는 더 적은 및/또는 더 최근 견본을 위한 이기는 하지만 유전자 발현 분석2,,6,,7,,8,,9를위한 FFPE 조직의 유용성을 설명했습니다.
타당성 조사로서, 우리는 RNA 시퀀싱 및 유전자 발현 분석을 위한 감시, 역학 및 최종 결과(SEER) 암 레지스트리로부터 3개의 잔류 조직 저장소로부터 FFPE 종양 조직 표본으로부터 추출된 RNA를 사용하였다10. 임상 병리학 실험실에서 조달, 고급 난소 장액 선암에서 FFPE 조직은 RNA 추출 하기 전에 다양 한 조건 하에서 7-32 년에서 저장 되었다. 대부분의 경우에 이 블록은 미래에 어떤 민감한 유전 분석든지의 기대 없이 년 동안 다른 사이트에 저장되었기 때문에, 핵산을 보존하기 위하여 많은 주의를 취하지 않았습니다. 따라서, 대부분의 견본은 박테리아로 오염된 견본의 큰 비율로, 나쁜 질 RNA를 전시했습니다. 그럼에도 불구하고, 우리는 유전자 정량화를 수행하고, 유전자 커버리지의 균일성 및 연속성을 측정하고, 재현성을 측정하기 위해 생물학적 복제중 Pearson 상관 분석을 수행할 수 있었습니다. 주요 서명 유전자 패널의 세트에 기초하여, 우리는 암 게놈 아틀라스 (TCGA) 데이터와 우리의 연구 결과에 있는 견본을 비교하고 견본의 대략 60%가 비교한 유전자 발현 단면도11가있었다는 것을 확인했습니다. 다양한 QC 결과와 샘플 메타데이터 간의 상관관계를 바탕으로, 사용 가능한 시퀀스 데이터를 생성할 가능성이 높은 샘플을 식별하기 위한 예측 값이 좋은 주요 QC 메트릭을확인했습니다 11.
여기에서는 FFPE-RNA 품질 평가, 추출된 RNA 샘플에서 시작되는 시퀀싱 라이브러리 생성 및 시퀀싱 데이터의 생물 정보 분석에 사용되는 방법론을 설명합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

RNA 시퀀싱(RNA-seq)에 의한 유전자 발현 분석은 잠재적으로 저항 및/또는 감수성 메커니즘뿐만 아니라 다양한 질병의 기초에 대한 기계적 이해로 이어질 수 있는 임상 샘플에 대한 고유한 통찰력을 가능하게 합니다. 그러나, 임상 견본에 있는 조직 형태를 보존하기 위한 일반적인 방법을 나타내는 FFPE 조직은, 유전자 발현 프로파일링 분석을 위한 제일 근원이 아닙니다. 이러한 샘플에서 얻은 RNA는 종종 분해, 단편화 및 화학적으로 변형되어 최적이 아닌 시퀀싱 라이브러리로 이어집니다. 차례로, 이들은 유전자 발현 분석 및 돌연변이 발견을 위해 믿을 수 없을 지도 모르다 나쁜 질 순서 데이터를 생성합니다. FFPE 샘플을 최대한 활용하고 품질이 낮은 샘플에서 최상의 데이터를 얻으려면 실험 설계를 계획하고 시퀀싱 라이브러리를 준비하며 데이터 분석 중에 특정 예방 조치를 취하는 것이 중요합니다. 여기에는 정밀한 시료 품질 관리(QC)에 적합한 메트릭의 사용, 시퀀싱 라이브러리 생성 동안 다양한 단계에 가장 적합한 방법 식별, 신중한 라이브러리 QC 등이 포함됩니다. 또한 RNA-seq 데이터에서 아티팩트를 식별하고, 오염 및 낮은 품질 판독을 필터링하고, 유전자 커버리지의 균일성을 평가하고, 생물학적 복제물 중 유전자 발현 프로필의 재현성을 측정하기 위해서는 서열 데이터 분석을 위한 올바른 소프트웨어 도구 및 매개 변수를 적용하는 것이 중요합니다. 이러한 단계는 매우 이질적인 RNA 샘플의 프로파일링을 위한 높은 정확도와 재현성을 보장할 수 있습니다. 여기에서 우리는 FFPE RNA 조직에서 얻은 것과 같은 낮은 품질의 RNA로부터 얻은 유용한 데이터의 양을 증가시키는 데 도움이 될 수 있는 샘플 QC, 라이브러리 준비 및 QC, 시퀀싱 및 데이터 분석을 위한 다양한 단계를 설명합니다.

위에서 설명한 방법론은 7-32년 동안 다양한 조건하에서 저장된 67개의 FFPE 샘플에 적용하였다(중앙값 시료 저장 시간은 17.5년이었다). 여기에 제시된 데이터 집합 및 분석 결과는 Zhao 등11에이전에 기술되고 출판되었습니다. 앞에서 설명한 바와 같이 샘플 품질을 검사할 때(즉, 도 2의예시 트레이스), DV100은 고열RNA 샘플에 대한 더 작은 단편 크기의 비...

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Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

이 방법은 포르말린 고정 파라핀 임베디드(FFPE) RNA 샘플로부터 얻을 수 있는 서열 데이터의 질 및 양을 개선하는 단계를 설명한다. 우리는 FFPE-RNA 샘플의 품질을 보다 정확하게 평가하고, 시퀀싱 라이브러리를 준비하고, FFPE-RNA 샘플의 데이터를 분석하는 방법론을 설명합니다.

저하된 FFPE-RNA 시료의 시퀀싱 및 분석을 위한 최적화

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

우리의 프로토콜은 FFPE 유래 RNA 샘플, 특히 최적이 아닌 품질 샘플에서 생성된 유전자 발현 데이터의 품질과 양을 개선하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 FFPE 조직 샘플 내의 RNA 품질을 평가하고 다운스트림 처리를 최적화하여 샘플 시퀀싱 데이터의 양과 품질을 향상시킬 수 있습니다. 이 방법은 생물학적 및 임상 샘플에서 성적증명서의 포괄적인 특성화를 허용하고 개발 및 질병에서 게놈의 기능적 요소에 대한 통찰력을 제공할 수 있다.샘플 QC, 라이브러리 준비 및 데이터 분석을 위한 방법의 FFPE-RNA 분해 및 선택은 모두 매우 까다로울 수 있다. 올바른 방법과 적절한 컨트롤을 선택할 때 세심한 주의를 기울여야 합니다. 시각적 데모를 사용하면 시청자가 계획, 평가 및 시퀀싱 프로세스, 특히 제대로 보존되지 않은 FFPE 샘플에 필요한 작은 미묘한 수정 및 예방 조치를 관찰할 수 있습니다.RNA 샘플의 품질을 확인하기 위해 제조업체의 지침에 따라 RNA QC 시스템에서 샘플을 실행하고 적절한 생체 분석 소프트웨어를 사용하여 샘플 내의 RNA 단편의 분포를 분석하고 100 및 200 뉴클레오티드보다 긴 단편의 비율을 계산한다. QC 메트릭에 기초하여, 100뉴클레오티드보다 더 긴 단편의 40% 미만으로 샘플을 식별하여 이러한 샘플을 처리에서 배제할 수 있도록 한다. 시퀀싱을 위해 실온 수조에서 실행 매개 변수에 따라 적절한 시퀀싱 시약 키트를 해동하고 해동 후 시약 트레이를 섭씨 4도로 놓습니다.유동 셀 패키지를 실온에 30분 간 놓습니다. 패키지가 온난화되는 동안 일루미나 실험 관리자 응용 프로그램을 열고 샘플 시트 만들기를 선택합니다. 사용할 시퀀서를 선택하고 다음을 클릭합니다.시약 키트 바코드 및 기타 적절한 워크플로 매개 변수를 입력합니다. 그런 다음 일루미나 시퀀스 기준에 따라 생성된 샘플 시트를 업로드합니다. 샘플 라이브러리 및 제어 라이브러리 PhiX를 준비하려면 라이브러리를 적절한 농도로 분해하고 희석하고 샘플 및 PhiX 제어 라이브러리를 혼합하여 5% PhiX 제어 부피 비율을 얻습니다.유동 세포가 준비되면 랩핑을 제거하고, 보풀이 없는 알코올 닦아로 유리 표면을 청소하고, 낮은 보풀 실험실 조직으로 유리를 건조시다. 시약 카트리지를 섭씨 4도에서 제거하고 카트리지를 5번 반전하여 시약을 혼합합니다. 벤치의 카트리지를 부드럽게 탭하여 기포를 줄이고 디네이처및 희석된 샘플을 지정된 저수지의 시약 카트리지에 적재합니다.유량 셀, 버퍼 카트리지 및 시약 카트리지를 시스템에 로드합니다. 그런 다음 자동 검사를 수행하고 출력을 검토하여 실행 매개 변수가 시스템 검사를 통과할 수 있도록 합니다. 자동 검사가 완료되면 시퀀싱 실행을 시작하도록 선택합니다.사전 처리 QC 및 정렬 후 QC 결과를 시각화하려면 멀티 QC를 실행하여 HTML 형식으로 집계된 보고서를 생성합니다. 배치 효과를 결정하고 지정된 데이터 집합의 품질 맵을 평가하기 위해 R 스크립트를 사용하여 주 구성 요소 분석을 실행합니다. 그런 다음 샘플 상관 관계 분석은 다른 샘플 간의 Pearson 상관 관계를 사용하여 수행될 수 있습니다.100개 이상의 뉴클레오티드 보다 긴 단편의 비율의 추정은 고분해된 RNA 시료에 대한 작은 단편 크기의 비율을 정확하게 측정하기 위해 더 민감하기 때문에 200뉴클레오티드보다 긴 단편의 추정보다 더 유용하다. 샘플 세트에서 높은 수준의 분해를 감안할 때, 총 RNA 라이브러리 준비 방법이 권장됩니다. 예를 들어, 여기에 네 가지 샘플에서 준비된 시퀀싱 라이브러리가 표시됩니다.여기서는 원시 FastQ 파일 시퀀싱 품질 및 샘플 어댑터 콘텐츠에 대한 개요가 표시됩니다. FastQC 스크리닝은 샘플 내의 세균 또는 마우스 오염과 같은 오염을 감지하는 데 도움이 될 수 있습니다. STAR 정렬은 참조 게놈에 매핑된 판독의 비율, 참조 게놈에 고유하게 매핑된 판독의 비율 및 매핑되지 않은 읽기의 비율 또는 여러 loci로 매핑된 읽기의 비율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다.카드 및 RSeQC 통계는 매핑된 판독값에 존재하는 메신저 RNA, 내성 및 상호 간 기지의 백분율을 결정하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 대표적인 분석에서 일부 저격된 라이브러리에는 5개의 프라임 엔드보다 더 많은 읽기가 3개의 프라임에 더 가깝게 매핑되는 세 가지 주요 편향이 있었습니다. 또한, 주 성분 분석은 각 시료의 생물학적 복제를 위해 주성분에 의해 포획된 총 변이의 백분율을 결정하기 위해 수행될 수 있다.샘플 분해를 방지하고, 각 샘플에 대한 복제 및 여러 코트를 준비하고, 적절한 메트릭을 사용하여 샘플 품질을 평가하고, 올바른 라이브러리 준비 방법을 사용하십시오. 이 방법론을 사용하여, 더 큰 NGS 연구는 다양한 저장 시간 및 조건에 이전에 사용할 수 없는 FFPE 견본으로 수행될 수 있습니다 다양한 질병 상태에 통찰력을 얻기 위하여. 이 기술은 연구원이 풍부한 임상 정보를 가진 FFPE 견본의 기존 큰 기록보관소를 연구하고 인구 기지를 둔 암 연구 결과를 크게 향상할 수 있는 쪽을 포장했습니다.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

고전적인 Hodgkin 림프종의 Reed-Sternberg 세포의 흐름 정렬 및 Exome 시퀀싱

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

연구

유전학

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

단일 셀 시퀀싱을 사용하여 복사 번호 수선의 검출

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

차세대 시퀀싱에 적합한 식물성 세포질 DNA 농축 방법의 최적화 및 비교 분석

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

네이티브 Chromatin Immunoprecipitation Nucleosome 밀도 분석을 위한 라이브러리를 시퀀싱의 세대

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

낮은 풍부 배아 샘플 chromatin Immunoprecipitation (칩) 프로토콜

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

강력한 DNA 고립과 표 본관 표본에 대 한 높은 처리량 시퀀싱 도서관 건축

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

드문 이벤트 감지 오류 수정 DNA와 RNA 시퀀싱을 사용 하 여

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

다음-세대 시퀀싱에 대 한 전체 길이 HIV-1 Proviruses 근처의 증폭

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

이류성 에 대한 착상 전 유전자 검사를위한 반도체 시퀀싱

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

나노 포어 시퀀싱을 사용 하 여 전 혈에서 mRNA의 시퀀싱

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...