Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Vi er takknemlige til Dr. Danielle Carrick (Division of Cancer Control and Population Sciences, National Cancer Institute) for fortsatt hjelp, spesielt for å initiere denne studien, gi oss prøvene, og for nyttige forslag under dataanalyse. Vi takker oppriktig alle medlemmer av CCR Sequencing Facility ved Frederick National Laboratory for Cancer Research for deres hjelp under prøveforberedelse og sekvensering, spesielt Brenda Ho for hjelp i prøve QC, Oksana tysk for bibliotek QC, Tatyana Smirnova for å kjøre sequencers. Vi vil også takke Tsai-wei Shen og Ashley Walton i Sequencing Facility Bioinformatics Group for å ha hjulpet til med dataanalyse og implementering av RNA-seq-rørledninger. Vi takker også CCBR og NCBR for hjelp med RNaseq analyserørledning og beste praksisutvikling.

1. RNA kvantitet og kvalitetsvurdering
<ol><li>Velg FFPE-prøvene i henhold til forhåndsdefinerte kriterier og trekk ut RNA ved hjelp av en passende metode (f.eks. FFPE-nukleisyreavsugssett, Tabell over materialer). MERK: Det finnes flere forskjellige metoder tilgjengelig for FFPE-RNA-ekstraksjon, inkludert de nyere mikrodisseksjonsmetodene som kan fungere med svært lite vev og trekke ut god kvalitet RNA12,,13,,<sup class="xref"...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

Metoden som er beskrevet her skisserer de viktigste trinnene som kreves for å få gode sekvensdata fra FFPE-RNA-prøver. Hovedpoengene å vurdere med denne metoden er: (1) Sørg for at RNA er bevart så godt som mulig etter ekstraksjon ved å minimere prøvehåndtering og frysing og tining sykluser. Separate QC aliquots er svært nyttig. (2) Bruk en QC-beregning som er best for det angitte eksempelsettet. RIN-verdier og DV200 er ofte ikke nyttige for forringede prøver, og DV100 kan være den foret...

Bruk av neste generasjons sekvenseringsmetoder har gjort oss i stand til å hente et vell av informasjon fra ulike typer prøver. Imidlertid forblir gamle og dårlig bevarte prøver ubrukelige for de vanlige metodene for å generere sekvensdata og krever ofte endringer i veletablerte protokoller. FFPE vev representerer en slik prøvetype som har blitt mye brukt for kliniske prøver1,,2,3. Mens FFPE bevaring opprettholder vevmorfologi, viser nukleinsyrene i FFPE-vev vanligvis et bredt spekter av skade og nedbrytning, noe som gjør det vanskelig å hente den genomiske informasjonen som kan føre til viktig innsikt om molekylære mekanismer som ligger til grunn for ulike lidelser.
Genuttrykksdata generert av RNA-sekvensering er ofte medvirkende til å studere sykdoms- og resistensmekanismer og utfyller DNA-mutasjonsanalyse. RNA er imidlertid mer utsatt for nedbrytning, noe som gjør det mer utfordrende å generere nøyaktige genuttrykksdata fra FFPE-vev. Videre, fordi den brede tilgjengeligheten og rimeligheten av sekvensering er relativt nylig, ble eldre prøver ofte ikke lagret under forhold som kreves for å bevare RNA integritet. Noen av problemene for FFPE prøver inkluderer nedbrytning av RNA på grunn av innebygging i parafin, kjemisk modifikasjon av RNA fører til fragmentering eller refractoriness til enzymatiske prosesser som kreves for sekvensering, og tap av poly-A haler, begrense anvendelsen av oligo-dT som en primer for omvendt transkripsjonase4. En annen utfordring er håndtering/lagring av FFPE-prøver under suboptimale forhold, noe som kan føre til ytterligere nedbrytning av labilemolekyler som RNA i vevene5. Dette er spesielt relevant for eldre prøver som kan ha blitt samlet inn i en tid da genuttrykksanalyse ved RNA-sekvensering ikke var forventet for prøvene. Alle disse fører til redusert kvalitet og kvantitet av den ekstraherte RNA tilgjengelig for generering av nyttige sekvensdata. Den lave sannsynligheten for suksess, kombinert med de høye kostnadene ved sekvensering, har frarådet mange forskere fra å prøve å generere og analysere genuttrykksdata fra potensielt nyttige FFPE-prøver. Noen studier de siste årene har vist brukervennlighet av FFPE vev for genuttrykk analyse2,6,7,8,9, om enn for færre og / eller nyere prøver.
Som en mulighetsstudie brukte vi RNA ekstrahert fra FFPE tumorvevsprøver fra tre gjenværende vevsrepositorier fra Surveillance, Epidemiology, and End Results (SEER) kreftregistre for RNA sekvensering og genuttrykkanalyse10. Anskaffet fra kliniske patologi laboratorier, FFPE vev fra høyverdig ovarie serøse adenokarsinomer ble lagret fra 7-32 år under varierende forhold før RNA utvinning. Fordi i de fleste tilfeller disse blokkene hadde blitt lagret på forskjellige steder i årevis uten forventning om noen sensitiv genetisk analyse i fremtiden, ikke mye omsorg hadde blitt tatt for å bevare nukleinsyrer. Dermed viste de fleste prøvene dårlig kvalitet RNA, med en stor andel av prøvene forurenset med bakterier. Likevel var vi i stand til å utføre genkvantifisering, måle ensartethet og kontinuitet i gendekningen, og utføre Pearson-korrelasjonsanalysen blant biologiske replikasjoner for å måle reproduserbarhet. Basert på et sett med nøkkelsignaturgenpanel sammenlignet vi prøvene i vår studie med The Cancer Genome Atlas (TCGA) data og bekreftet at omtrent 60% av prøvene hadde sammenlignbare genuttrykksprofiler11. Basert på korrelasjonen mellom ulike QC-resultater og eksempelmetadata, identifiserte vi viktige QC-beregninger som har god prediktiv verdi for å identifisere prøver som er mer sannsynlig å generere brukbare sekvensdata11.
Her beskriver vi metodikken som brukes for kvalitetsvurdering av FFPE-RNA, generering av sekvenseringsbiblioteker fra utvunnet RNA-prøver og bioinformatikkanalyse av sekvenseringsdataene.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

Genuttrykksanalyse ved RNA-sekvensering (RNA-seq) muliggjør unik innsikt i kliniske prøver som potensielt kan føre til mekanistisk forståelse av grunnlaget for ulike sykdommer, samt resistens- og/eller mottakelighetsmekanismer. FFPE-vev, som representerer den vanligste metoden for å bevare vevmorfologi i kliniske prøver, er imidlertid ikke de beste kildene til genuttrykkprofileringsanalyse. RNA hentet fra slike prøver er ofte degradert, fragmentert, og kjemisk modifisert, noe som fører til suboptimale sekvensering biblioteker. I sin tur genererer disse sekvensdata av dårlig kvalitet som kanskje ikke er pålitelige for genuttrykksanalyse og mutasjonsoppdagelse. For å få mest mulig ut av FFPE-prøver og få best mulig data fra prøver av lav kvalitet, er det viktig å ta visse forholdsregler mens du planlegger eksperimentell design, forbereder sekvenseringsbiblioteker og under dataanalyse. Dette inkluderer bruk av passende beregninger for nøyaktig prøvekvalitetskontroll (QC), identifisere de beste metodene for ulike trinn under sekvenseringsbibliotekgenerering, og forsiktig bibliotek QC. I tillegg er bruk av riktige programvareverktøy og parametere for sekvensdataanalyse avgjørende for å identifisere artefakter i RNA-seq-data, filtrere ut forurensning og lav kvalitet, vurdere ensartethet av gendekning og måle reproduserbarheten til genuttrykksprofiler blant biologiske replikere. Disse trinnene kan sikre høy nøyaktighet og reproduserbarhet for profilering av svært heterogene RNA-prøver. Her beskriver vi de ulike trinnene for prøve QC, bibliotekforberedelse og QC, sekvensering og dataanalyse som kan bidra til å øke mengden nyttige data hentet fra lav kvalitet RNA, slik som det er hentet fra FFPE-RNA vev.

Metodikken som er beskrevet ovenfor, ble brukt på 67 FFPE-prøver som hadde blitt lagret under en rekke forskjellige forhold i 7–32 år (median lagringstid for prøvene var 17,5 år). Datasettet og analyseresultatene som presenteres her, ble tidligere beskrevet og publisert i Zhao et al.11. Ved kontroll av prøvekvaliteten som beskrevet tidligere (dvs. eksempelspor i figur 2),ble DV100 funnet å være mer nyttig enn DV200 fordi det er mer føl...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Denne metoden beskriver fremgangsmåten for å forbedre kvaliteten og antallet sekvensdata som kan hentes fra formalin-faste parafin-innebygde (FFPE) RNA-prøver. Vi beskriver metodikken for å mer nøyaktig vurdere kvaliteten på FFPE-RNA-prøver, utarbeide sekvenseringsbiblioteker og analysere dataene fra FFPE-RNA-prøver.

Optimalisering for sekvensering og analyse av degraderte FFPE-RNA-prøver

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Vår protokoll kan brukes til å forbedre kvaliteten og mengden av genuttrykksdata generert fra FFPE-avledede RNA-prøver, spesielt i suboptimale kvalitetsprøver. Denne teknikken vurderer RNA-kvaliteten i FFPE-vevsprøver og muliggjør optimalisering av nedstrømsbehandlingen for å forbedre mengden og kvaliteten på prøvesekvenseringsdataene. Denne metoden tillater omfattende karakterisering av en transkripsjon i biologisk og klinisk prøve og kan gi innsikt i funksjonelle elementer av genomet i utvikling og sykdom.FFPE-RNA-nedbrytningen og utvelgelsen av metodene for eksempel qc, bibliotekforberedelse og dataanalyse kan alle være svært vanskelig. Vær omhyggelig når du velger de riktige metodene og passende kontroller. Visuell demonstrasjon gjør det mulig for seerne å observere de små subtile endringene og forholdsreglene som trengs under planleggingen, vurderingen og sekvenseringsprosessen, spesielt for dårlig bevarte FFPE-prøver.For å sjekke kvaliteten på RNA-prøven, kjør prøven på et RNA QC-system i henhold til produsentens instruksjoner og bruk riktig bioanalyseprogramvare for å analysere fordelingen av RNA-fragmentene i prøven og for å beregne andelen fragmenter som er lengre enn 100 og 200 nukleotider. Basert på QC-beregningene kan du identifisere prøvene med færre enn 40 % av fragmentene som er lengre enn 100 nukleotider for å tillate utelukkelse av disse prøvene fra behandling. For sekvensering, tin de riktige sekvensering reagenssettene i henhold til løpeparametrene i et romtemperaturvannbad og plasser reagensbrettet på fire grader Celsius etter tining.Plasser strømningscellepakken ved romtemperatur i 30 minutter. Mens pakken varmes opp, åpner du Programmet Illumina Experiment Manager og velger Opprett eksempelark. Velg sequenceren som skal brukes, og klikk Neste.Angi strekkoden for reagenssettet og de andre aktuelle arbeidsflytparameterne. Last deretter opp et eksempelark som er opprettet i henhold til Illumina-sekvenskriteriene. For å klargjøre eksempelbiblioteket og kontrollbiblioteket PhiX, denaturere og fortynne bibliotekene til de riktige konsentrasjonene og blande eksempel- og PhiX-kontrollbibliotekene for å oppnå et volumforhold på 5 %PhiX-kontroll.Når strømningscellene er klare, fjern innpakningen, rengjør glassoverflaten med en lofri alkoholsletting og tørk glasset med lavt lolaboratorivev. Fjern reagenskassetten fra fire grader Celsius-lagring og inverter sylinderampullen fem ganger for å blande reagensene. Bank patronen forsiktig på benken for å redusere luftbobler og legg denaturerte og fortynnede prøven inn i reagenskassetten i det angitte reservoaret.Legg strømningscellen, bufferkassetten og reagenskassetten på systemet. Utfør deretter en automatisk kontroll og se gjennom utdataene for å sikre at kjøreparametrene passerer systemkontrollen. Når den automatiske kontrollen er fullført, velger du start for å starte sekvenseringskjøringen.Hvis du vil visualisere resultatene for QC før behandling og etter justering, kjører du multi-QC for å generere en aggregert rapport i HTML-format. Hvis du vil fastslå satsvise effekter og vurdere kvalitetstilordningen for det angitte datasettet, bruker du et R-skript til å kjøre en hovedkomponentanalyse. Eksempelkorrelasjonsanalyse kan deretter utføres ved hjelp av Pearson-korrelasjonen mellom ulike prøver.Estimeringen av andelen fragmenter som er lengre enn 100 nukleotider er mer nyttig enn en estimering av fragmentene som er lengre enn 200 nukleotider fordi det er mer følsomt for nøyaktig måling av andelen mindre fragmentstørrelser for svært nedbrutte RNA-prøver. Gitt den høye graden av nedbrytning i prøvesettet, anbefales en total RNA-bibliotekforberedelsesmetode. Her vises for eksempel sekvenseringsbiblioteker utarbeidet fra fire forskjellige eksempler.Her vises oversikter over rå FastQ-filsekvenseringskvalitet og eksempelkortinnhold. FastQC screening kan bidra til å oppdage forurensning som bakteriell eller mus forurensning i prøvene. STAR-justering kan brukes til å bestemme andelen av lesinger som er tilordnet referansegenomet, prosentandelen av leser unikt tilordnet referansegenomet, og andelen lesinger som ikke var tilordnet, eller som ble tilordnet til flere loci.Kortet og RSeQC-statistikken kan brukes til å bestemme prosentandelen av messenger RNA-er, intronic- og intergene baser som finnes i de tilordnede lysene. For disse representative analysene hadde noen degraderte biblioteker en tre hovedbias der flere lesere ble kartlagt nærmere de tre prime enn til de fem prime end. I tillegg kan hovedkomponentanalyse utføres for å bestemme prosentandelen av den totale variasjonen som fanges opp av hovedkomponentene for de biologiske replikeringene i hvert utvalg.Vær forsiktig med å unngå forringelse av prøver, klargjør repliker og flere strøk for hvert utvalg, bruk de riktige beregningene til å vurdere utvalgskvaliteten og bruke riktig bibliotekforberedelsesmetode. Ved hjelp av denne metodikken kan større NGS-studier utføres med tidligere ubrukelige FFPE-prøver med varierende lagringstider og forhold for å få innsikt i en rekke forskjellige sykdomstilstander. Denne teknikken banet vei for forskere å studere eksisterende store arkiver av FFPE utvalg med rik klinisk informasjon og kan i stor grad forbedre populasjonsbaserte kreftstudier.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flow-sortering og Exome Sequencing av Reed-Sternberg-cellene av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Påvisning av Kopier nummer Endringer Bruke enkelt celle Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimalisering og sammenligningsanalyse av organellar DNA-berigelsesmetoder som er egnet for neste generasjons sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generasjon av innfødte Chromatin Immunoprecipitation sekvensering biblioteker til Nucleosome tetthet analyse

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokollen for lav-overflod embryonale prøver

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolasjon og høy gjennomstrømming sekvensering biblioteket konstruksjon for Herbarium prøver

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Sjelden hendelse gjenkjenning feil-korrigert DNA og RNA sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Forsterkning av nær full lengde HIV-1-Proviruses for neste generasjons sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Semiconductor sekvensering for Preimplantation genetisk testing for avvik

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA fra hele Blood bruke Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...