Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Мы благодарны доктору Даниэль Кэррик (Отдел по борьбе с раком и наук о народонаселении, Национальный институт рака) за постоянную помощь, особенно за инициирование этого исследования, предоставляя нам образцы, и за полезные предложения во время анализа данных. Мы искренне благодарим всех членов CCR секвенирования фонда в Фредерик Ской Национальной лаборатории онкологических исследований за их помощь во время подготовки образцов и последовательности, особенно Бренда Хо за помощь в образце КК, Оксана Герман для библиотеки КК, Татьяна Смирнова для запуска секвенсоров. Мы также хотели бы поблагодарить Цай-вэй Шэня и Эшли Уолтон из Sequencing Facility Bioinformatics Group за помощь в анализе данных и внедрении трубопровода РНК-сек. Мы также благодарим CCBR и NCBR за помощь в разработке анализа RNaseq и разработке передового опыта.

1. Оценка количества и качества РНК
<ol><li>Выберите образцы FFPE в соответствии с заранее определенными критериями и извлеките РНК с помощью соответствующего метода (например, комплект для извлечения кислоты FFPE,, Таблица материалов). ПРИМЕЧАНИЕ: Есть несколько различных методов,...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

Описанный здесь метод определяет основные шаги, необходимые для получения хороших данных о последовательности из образцов FFPE-РНК. Основными моментами, которые следует учитывать с помощью этого метода, являются: (1) Обеспечить, чтобы РНК сохранилась как можно лучше после извлечения путе...

Использование подходов к секвенированию следующего поколения позволило нам получить большой объем информации из различных типов образцов. Однако старые и плохо сохранившиеся образцы остаются неработоспособными для широко используемых методов генерации данных о последовательности и часто требуют внесения изменений в устоявшиеся протоколы. Ткани FFPE представляют собой такой тип образца, который был широко использован для клинических образцов1,,2,,3. В то время как сохранение FFPE поддерживает морфологию тканей, нуклеиновые кислоты в тканях FFPE обычно обладают широким спектром повреждений и деградации, что затрудняет получение геномной информации, которая может привести к важным представлениям о молекулярных механизмах, лежащих в основе различных расстройств.
Данные экспрессии генов, генерируемые секвенированием РНК, часто играют важную роль в изучении механизмов болезни и резистентности и дополняют анализ мутаций ДНК. Тем не менее, РНК более восприимчива к деградации, что делает его более сложным для получения точных данных экспрессии генов из тканей FFPE. Кроме того, поскольку широкая доступность и доступность секвенирования относительно недавняя, старые образцы часто не хранились в условиях, необходимых для сохранения целостности РНК. Некоторые из вопросов для образцов FFPE включают деградацию РНК из-за встраивания в парафина, химическая модификация РНК, приводящая к фрагментации или огнеупорности к ферментативным процессам, необходимым для секвенирования, и потеря поли-хвостов, ограничение применимости олиго-дТ в качестве грунтовки для обратной транскриптазы4. Еще одной проблемой является обработка/хранение образцов FFPE в неоптимальных условиях, что может привести к дальнейшей деградации молекул лабиля, таких как РНК в тканях5. Это особенно актуально для старых образцов, которые, возможно, были собраны в то время, когда анализ экспрессии генов путем секвенирования РНК не ожидался для образцов. Все это приводит к снижению качества и количества извлеченной РНК, доступных для генерации полезных данных последовательности. Низкая вероятность успеха, в сочетании с высокой стоимостью секвенирования, отговорила многих исследователей от попыток генерировать и анализировать данные экспрессии генов из потенциально полезных образцов FFPE. Некоторые исследования в последние годы продемонстрировали удобство использования тканей FFPE9для анализа экспрессии генов2,,6,,77,9,хотя и для меньшего количества и/ или более поздних образцов.
В качестве технико-экономического обоснования, мы использовали РНК, извлеченные из образцов ткани опухоли FFPE из трех остаточных хранилищ ткани от наблюдения, эпидемиологии и конечных результатов (SEER) раковых регистров для секвенирования РНК и анализа экспрессиигенов 10. Закупленные в клинических патологических лабораториях, ткани FFPE из высококачественных серозных аденокарциномы яичников хранились от 7-32 лет в различных условиях до извлечения РНК. Поскольку в большинстве случаев эти блоки хранились в разных местах в течение многих лет, не ожидая какого-либо чувствительного генетического анализа в будущем, не было принято большого вуза для сохранения нуклеиновой кислоты. Таким образом, большинство образцов продемонстрировали низкое качество РНК, при этом большая доля образцов была загрязнена бактериями. Тем не менее, мы смогли выполнить генную количественную оценку, измерить единообразие и непрерывность генного покрытия, а также выполнить анализ корреляции Пирсона среди биологических репликантов для измерения воспроизводимости. Основываясь на наборе ключевой панели генов подписи, мы сравнили образцы в нашем исследовании с данными Атлас агеногов рака (TCGA) и подтвердили, что примерно 60% образцов имели сопоставимые профили экспрессии генов11. Основываясь на корреляции между различными результатами КК и метаданными выборки, мы определили ключевые метрики КК, которые имеют хорошее прогностическое значение для определения образцов, которые с большей вероятностью генерируют пригодные для использования данные последовательности11.
Здесь мы описываем методологию, используемую для оценки качества FFPE-РНК, генерацию библиотек секвенирования, начиная с извлеченных образцов РНК, и биоинформатический анализ данных секвенирования.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

Анализ экспрессии генов с помощью секвенирования РНК (РНК-сек) позволяет получить уникальную информацию о клинических образцах, которые потенциально могут привести к механистическое понимание основы различных заболеваний, а также механизмов резистентности и/или восприимчивости. Тем не менее, ткани FFPE, которые представляют собой наиболее распространенный метод сохранения морфологии тканей в клинических образцах, не являются лучшими источниками для анализа экспрессии генов. РНК, полученная из таких образцов, часто деградирует, фрагментируется и химически модифицируется, что приводит к неоптимальному секвенированию библиотек. В свою очередь, они генерируют данные о низкой последовательности качества, которые могут быть ненадежными для анализа экспрессии генов и обнаружения мутаций. Для того чтобы максимально получить максимальную отдачу от образцов FFPE и получить наилучшие данные из образцов низкого качества, важно принять определенные меры предосторожности при планировании экспериментального проектирования, подготовке библиотек секвенирования и при анализе данных. Это включает в себя использование соответствующих метрик для точного контроля качества выборки (КК), определение лучших методов для различных шагов во время генерации библиотеки последовательности, и тщательной библиотеки КК. Кроме того, применение правильных программных средств и параметров для анализа последовательности данных имеет решающее значение для выявления артефактов в данных RNA-seq, фильтрации загрязнения и низкого качества считывания, оценки единообразия генного покрытия и измерения воспроизводимости профилей экспрессии генов среди биологических репликаций. Эти шаги могут обеспечить высокую точность и воспроизводимость для профилирования очень неоднородных образцов РНК. Здесь мы описываем различные шаги для образца КК, подготовки библиотеки и КК, секвенирования и анализа данных, которые могут помочь увеличить объем полезных данных, полученных из низкокачественной РНК, таких как полученные из тканей FFPE-РНК.

Упомянутая выше методология была применена к 67 пробам FFPE, которые хранились в различных условиях в течение 7–32 лет (средний срок хранения выборки составлял 17,5 лет). Данные и результаты анализа, представленные здесь, были ранее описаны и опубликованы в Чжао и др.11. При провер?...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Этот метод описывает шаги по улучшению качества и количества последовательности данных, которые могут быть получены из формалина фиксированной парафин-встроенных (FFPE) РНК образцов. Мы описываем методологию для более точной оценки качества образцов FFPE-РНК, подготовки библиотек секвенирования и анализа данных из образцов FFPE-РНК.

Оптимизация для секвенирования и анализа деградированных образцов FFPE-РНК

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Наш протокол может быть использован для улучшения качества и количества данных экспрессии генов, полученных из образцов РНК, полученных FFPE, особенно в неоптимальных образцах качества. Этот метод оценивает качество РНК в образцах тканей FFPE и позволяет оптимизацию их обработки вниз по течению для улучшения количества и качества данных секвенирования выборки. Этот метод позволяет получить всеобъемлющую характеристику стенограммы в биологическом и клиническом образце и может дать представление о функциональных элементах генома в развитии и болезни.Деградация FFPE-РНК и выборка методов отбора проб КК, подготовки библиотек и анализа данных могут быть очень сложными. Будьте дотошны при выборе правильных методов и соответствующих элементов управления. Визуальная демонстрация позволяет зрителям наблюдать за небольшими тонкими изменениями и мерами предосторожности, необходимыми при планировании, оценке и процессе секвенирования, особенно для плохо сохранившихся образцов FFPE.Чтобы проверить качество образца РНК, запустите образец по системе РНК КК в соответствии с инструкциями производителя и используйте соответствующее программное обеспечение биоанализа для анализа распределения фрагментов РНК в образце и расчета доли фрагментов более 100 и 200 нуклеотидов. Основываясь на метриках КК, идентифицировать образцы с менее чем 40% фрагментов длиннее 100 нуклеотидов, чтобы исключить эти образцы из обработки. Для секвенирования оттаивать соответствующие наборы секвенирования реагентов в соответствии с параметрами пробега в ванне с водой комнатной температуры и поместить реагент лоток при четырех градусах Цельсия после оттаивания.Поместите пакет ячейки потока при комнатной температуре в течение 30 минут. Пока пакет нагревается, откройте приложение Illumina Experiment Manager и выберите лист Create Sample. Выберите секвенсор для использования и нажмите Далее.Введите штрих-код комплекта реагентов и другие соответствующие параметры рабочего процесса. Затем загрузите образец листа, созданного в соответствии с критериями последовательности Illumina. Чтобы подготовить библиотеку образцов и библиотеку управления PhiX, денатурировать и разбавить библиотеки до соответствующих концентраций и смешать библиотеки управления образцом и PhiX, чтобы получить соотношение громкости контроля 5%PhiX.Когда клетки потока будут готовы, удалите обертку, очистите стеклянную поверхность без ворсинок спиртом и высушите стекло с низкой лабораторной тканью ворса. Удалите реагент картридж из четырех градусов по Цельсию хранения и инвертировать картридж пять раз, чтобы смешать реагенты. Аккуратно коснитесь картриджа на скамейке, чтобы уменьшить пузырьки воздуха и загрузить денатурированный и разбавленный образец в реагент картриджа в назначенном резервуаре.Загрузите ячейку потока, буферный картридж и картридж реагента на систему. Затем выполните автоматизированную проверку и просмотрите выход, чтобы убедиться, что параметры запуска проходят проверку системы. Когда автоматизированная проверка будет завершена, выберите начало запуска секвенирования.Чтобы визуализировать результаты кк и после выравнивания, запустите мульти-КК для создания агрегированного отчета в формате HTML. Для определения эффектов пакетов и оценки качества карты данного набора данных используйте R-скрипт для работать с основным анализом компонентов. Анализ корреляции выборки может быть проведен с использованием корреляции Пирсон между различными образцами.Оценка доли фрагментов, более 100 нуклеотидов, более полезна, чем оценка фрагментов длиной более 200 нуклеотидов, поскольку она более чувствительна для точного измерения доли меньших размеров фрагментов для сильно деградированных образцов РНК. Учитывая высокую степень деградации набора выборки, рекомендуется общий метод подготовки библиотеки РНК. Например, здесь показаны библиотеки секвенирования, подготовленные из четырех различных образцов.Здесь показаны обзоры качества секвенирования необработанных файлов Fast и содержимого адаптера образца. Быстрый скрининг может помочь обнаружить загрязнение, такое как бактериальное или мышиное загрязнение в образцах. Выравнивание STAR может быть использовано для определения доли считывалось на эталонный геном, процент считывался однозначно отображенный на эталонный геном, и доля считывалась, которые не были отображены, или которые были отображены на несколько локусов.Статистика карты и РСЕЦ может быть использована для определения процентов РНК мессенджера, нетронных и интергенных оснований, присутствующих в картографических считывах. Для этих репрезентативных анализов некоторые деградированные библиотеки имели три основных смещения, в которых больше читает были отображены ближе к трем премьер, чем к пяти премьер-конец. Кроме того, можно провести анализ основных компонентов для определения процента от общего объема вариаций, захваченных основными компонентами для биологических репликаций каждого образца.Позаботьтесь, чтобы избежать деградации выборки, подготовить репликации и несколько слоев для каждого образца, использовать соответствующие метрики для оценки качества выборки, и использовать правильный метод подготовки библиотеки. Используя эту методологию, более крупные исследования NGS могут быть выполнены с ранее непригодными для использования образцами FFPE с различным временем хранения и условиями, чтобы получить представление о различных состояниях болезни. Этот метод проложил путь для исследователей для изучения существующих больших архивов образца FFPE с богатой клинической информацией и может значительно повысить популяционых исследований рака.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Поток-сортировка и экзомерная секвенирование клеток Рида-Штернберга классической лимфомы Ходжкина

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Обнаружение Copy Number Изменений Использование Single Cell Секвенирование

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Оптимизация и сравнительный анализ методов обогащения органической ДНК растений, подходящих для последующей последовательности следующего поколения

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Поколения родной Chromatin иммунопреципитации секвенирования библиотек для анализа плотности нуклеосома

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Протокол иммунопреципитации (чип) Chromatin для Low изобилие эмбриональных образцов

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Обнаружение редких событий, с помощью Исправлена ошибка ДНК и РНК последовательности

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Усиление возле полнометражного ВИЧ-1 Proviruses для виртуализации нового поколения

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Полупроводниковое секвенирование для предимплантационного генетического тестирования на анеуплоидию

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Секвенирование мРНК из цельной крови с использованием секвенирования Наноруды

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...