Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
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Estamos agradecidos a la Dra. Danielle Carrick (División de Control del Cáncer y Ciencias de la Población, Instituto Nacional del Cáncer) por su ayuda continua, especialmente para iniciar este estudio, proporcionarnos las muestras, y por sugerencias útiles durante el análisis de datos. Agradecemos sinceramente a todos los miembros del Centro de Secuenciación de CCR en el Laboratorio Nacional Frederick para la Investigación del Cáncer por su ayuda durante la preparación y secuenciación de muestras, especialmente a Brenda Ho por su ayuda en la muestra de control de calidad, Oksana Alemán para la biblioteca QC, Tatyana Smirnova para ejecutar los secuenciadores. También nos gustaría agradecer a Tsai-wei Shen y Ashley Walton en Sequencing Facility Bioinformatics Group por ayudar con el análisis de datos y la implementación del oleoducto RNA-seq. También agradecemos a CCBR y NCBR por la asistencia con el desarrollo de la canalización de análisis de RNaseq y las mejores prácticas.

1. Evaluación de la cantidad y calidad del ARN
<ol><li>Seleccione las muestras FFPE según criterios predefinidos y extraiga el ARN utilizando un método adecuado (por ejemplo, kit de extracción de ácido FFPE-nuclei, Tabla de materiales). NOTA: Hay varios métodos diferentes disponibles para la extracción de ARN FFPE, incluyendo los nuevos métodos de microdisección que pueden trabajar con muy poco tejido y extraer ARN12,13,,<sup class=...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

El método descrito aquí describe los pasos principales necesarios para obtener buenos datos de secuencia de muestras de ARN FFPE. Los principales puntos a tener en cuenta con este método son: (1) Asegúrese de que el ARN se conserva lo mejor posible después de la extracción minimizando el manejo de la muestra y los ciclos de congelación y descongelación. Las alícuotas de control de calidad separadas son muy útiles. (2) Utilice una métrica de control de calidad que sea mejor para el conjunto de muestras dado. Lo...

El uso de enfoques de secuenciación de próxima generación nos ha permitido obtener una gran cantidad de información de varios tipos de muestras. Sin embargo, las muestras antiguas y mal conservadas siguen siendo inviables para los métodos de uso común para generar datos de secuencia y a menudo requieren modificaciones en protocolos bien establecidos. Los tejidos FFPE representan un tipo de muestra que ha sido ampliamente utilizado para muestras clínicas1,2,3. Mientras que la preservación de FFPE mantiene la morfología tisular, los ácidos nucleicos en los tejidos FFPE generalmente exhiben una amplia gama de daño y degradación, lo que dificulta la recuperación de la información genómica que puede conducir a información importante sobre los mecanismos moleculares subyacentes a diversos trastornos.
Los datos de expresión génica generados por la secuenciación de ARN a menudo son fundamentales para estudiar los mecanismos de enfermedad y resistencia y complementan el análisis de mutaciones del ADN. Sin embargo, el ARN es más susceptible a la degradación, lo que hace más difícil generar datos precisos de expresión génica a partir de tejidos FFPE. Además, debido a que la amplia disponibilidad y asequibilidad de la secuenciación es relativamente reciente, los especímenes más antiguos a menudo no se almacenaban en condiciones necesarias para preservar la integridad del ARN. Algunos de los problemas de las muestras de FFPE incluyen la degradación del ARN debido a la incrustación en la parafina, la modificación química del ARN que conduce a la fragmentación o refractoridad a los procesos enzimáticos necesarios para la secuenciación, y la pérdida de las colas de poli-A, limitando la aplicabilidad del oligo-dT como imprimación para la transcriptasa inversa4. Otro desafío es la manipulación/almacenamiento de muestras de FFPE en condiciones subóptimas, lo que puede conducir a una mayor degradación de moléculas lábiles como el ARN en los tejidos5. Esto es especialmente relevante para muestras más antiguas que pueden haber sido recogidas en un momento en que no se anticipó el análisis de expresión génica mediante secuenciación de ARN para las muestras. Todo esto conduce a una menor calidad y cantidad del ARN extraído disponible para generar datos de secuencia útiles. La baja probabilidad de éxito, combinada con el alto costo de secuenciación, ha disuadido a muchos investigadores de tratar de generar y analizar datos de expresión génica a partir de muestras de FFPE potencialmente útiles. Algunos estudios realizados en los últimos años han demostrado la usabilidad de los tejidos FFPE para el análisis de expresión génica2,6,7,8,9, aunque para menos y / o muestras más recientes.
Como estudio de viabilidad, utilizamos ARN extraído de muestras de tejido tumoral FFPE de tres repositorios de tejidos residuales de registros de cáncer de vigilancia, epidemiología y resultados finales (SEER) para la secuenciación de ARN y el análisis de expresión génica10. Adquiridos en laboratorios de patología clínica, los tejidos FFPE de adenocarcinomas monovariesos ováricos de alto grado se almacenaron de 7 a 32 años en condiciones variables antes de la extracción de ARN. Debido a que en la mayoría de los casos estos bloques se habían almacenado en diferentes sitios durante años sin la expectativa de ningún análisis genético sensible en el futuro, no se había tenido mucho cuidado para preservar los ácidos nucleicos. Por lo tanto, la mayoría de las muestras exhibieron ARN de mala calidad, con una gran proporción de muestras contaminadas con bacterias. Sin embargo, pudimos realizar la cuantificación genética, medir la uniformidad y continuidad de la cobertura génica, y realizar el análisis de correlación de Pearson entre réplicas biológicas para medir la reproducibilidad. Basándonos en un conjunto de paneles genéticos de firma clave, comparamos las muestras de nuestro estudio con los datos de The Cancer Genome Atlas (TCGA) y confirmamos que aproximadamente el 60% de las muestras tenían perfiles de expresión génicacomparables 11. Basándonos en la correlación entre varios resultados de control de calidad y metadatos de ejemplo, identificamos métricas clave de control de calidad que tienen un buen valor predictivo para identificar muestras que son más propensas a generar datos de secuencia utilizables11.
Aquí describimos la metodología utilizada para la evaluación de la calidad del FFPE-ARN, la generación de bibliotecas de secuenciación a partir de muestras de ARN extraídos y el análisis bioinformático de los datos de secuenciación.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

El análisis de la expresión génica mediante la secuenciación de ARN (RNA-seq) permite obtener información única sobre muestras clínicas que pueden conducir potencialmente a una comprensión mecanicista de la base de diversas enfermedades, así como mecanismos de resistencia y/o susceptibilidad. Sin embargo, los tejidos FFPE, que representan el método más común para preservar la morfología tisular en muestras clínicas, no son las mejores fuentes para el análisis de perfiles de expresión génica. El ARN obtenido de tales muestras a menudo se degrada, fragmenta y se modifica químicamente, lo que conduce a bibliotecas de secuenciación subóptimas. A su vez, estos generan datos de secuencia de mala calidad que pueden no ser confiables para el análisis de expresión génica y el descubrimiento de mutaciones. Con el fin de aprovechar al máximo las muestras de FFPE y obtener los mejores datos posibles de muestras de baja calidad, es importante tomar ciertas precauciones mientras se planifica el diseño experimental, se preparan bibliotecas de secuenciación y durante el análisis de datos. Esto incluye el uso de métricas adecuadas para un control preciso de la calidad de la muestra (QC), la identificación de los mejores métodos para varios pasos durante la generación de la biblioteca de secuenciación y el control de calidad cuidadoso de la biblioteca. Además, la aplicación de herramientas y parámetros de software correctos para el análisis de datos de secuencia es fundamental para identificar artefactos en los datos de ARN-seq, filtrar la contaminación y lecturas de baja calidad, evaluar la uniformidad de la cobertura génica y medir la reproducibilidad de los perfiles de expresión génica entre réplicas biológicas. Estos pasos pueden garantizar una alta precisión y reproducibilidad para el perfilado de muestras de ARN muy heterogéneas. Aquí describimos los diversos pasos para el control de calidad de la muestra, la preparación de la biblioteca y el control de calidad, la secuenciación y el análisis de datos que pueden ayudar a aumentar la cantidad de datos útiles obtenidos de ARN de baja calidad, como el obtenido de los tejidos FFPE-RNA.

La metodología descrita anteriormente se aplicó a 67 muestras de FFPE que se habían almacenado en una variedad de condiciones diferentes durante 7 a 32 años (la mediana de tiempo de almacenamiento de muestras fue de 17,5 años). Los resultados del conjunto de datos y el análisis presentados aquí fueron descritos y publicados previamente en Zhao et al.11. Al comprobar la calidad de la muestra como se describió anteriormente (es decir, los seguimientos de ejemplo en la Fi...

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Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Este método describe los pasos para mejorar la calidad y la cantidad de datos de secuencia que se pueden obtener a partir de muestras de ARN incrustadas de parafina fija de formalina (FFPE). Describimos la metodología para evaluar con mayor precisión la calidad de las muestras de FFPE-RNA, preparar bibliotecas de secuenciación y analizar los datos de muestras de ARN FFPE.

Optimización para la secuenciación y el análisis de muestras de FFPE-ARN degradadas

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Nuestro protocolo se puede utilizar para mejorar la calidad y la cantidad de datos de expresión génica generados a partir de muestras de ARN derivadas de FFPE, especialmente en muestras de calidad subóptima. Esta técnica evalúa la calidad del ARN dentro de las muestras de tejido FFPE y permite optimizar su procesamiento posterior para mejorar la cantidad y la calidad de los datos de secuenciación de muestras. Este método permite la caracterización completa de una transcripción en la muestra biológica y clínica y puede proporcionar información sobre los elementos funcionales del genoma en el desarrollo y la enfermedad.La degradación de FFPE-RNA y la selección de los métodos para el control de calidad de la muestra, la preparación de la biblioteca y el análisis de datos pueden ser muy complicados. Sea meticuloso al seleccionar los métodos adecuados y los controles adecuados. La demostración visual permite a los espectadores observar las pequeñas modificaciones sutiles y precauciones necesarias durante la planificación, la evaluación y el proceso de secuenciación, especialmente para muestras de FFPE mal conservadas.Para comprobar la calidad de la muestra de ARN, ejecute la muestra en un sistema de CONTROL de ARN de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilice el software de bioanálisis adecuado para analizar la distribución de los fragmentos de ARN dentro de la muestra y para calcular la proporción de fragmentos de más de 100 y 200 nucleótidos. Sobre la base de las métricas de control de calidad, identifique las muestras con menos del 40% de los fragmentos de más de 100 nucleótidos para permitir la exclusión de estas muestras del procesamiento. Para la secuenciación, descongele los kits de reactivos de secuenciación adecuados de acuerdo con los parámetros de carrera en un baño de agua a temperatura ambiente y coloque la bandeja de reactivos a cuatro grados centígrados después de descongelar.Coloque el paquete de celda de flujo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Mientras el paquete se está calentando, abra la aplicación Illumina Experiment Manager y seleccione Crear hoja de muestra. Seleccione el secuenciador que desea utilizar y haga clic en Siguiente.Introduzca el código de barras del kit de reactivos y los demás parámetros de flujo de trabajo adecuados. A continuación, cargue una hoja de muestra creada según los criterios de secuencia de Illumina. Para preparar la biblioteca de muestras y la biblioteca de control PhiX, desnaturalizar y diluir las bibliotecas a las concentraciones adecuadas y mezclar la muestra y las bibliotecas de control PhiX para obtener una relación de volumen de control de 5%PhiX.Cuando las células de flujo estén listas, retire el envoltorio, limpie la superficie de vidrio con una toallita de alcohol sin pelusas y seque el vaso con un tejido de laboratorio de pelusas baja. Retire el cartucho de reactivo de un almacenamiento de cuatro grados Celsius e invierta el cartucho cinco veces para mezclar los reactivos. Toque suavemente el cartucho en el banco para reducir las burbujas de aire y cargue la muestra desnaturalizado y diluido en el cartucho de reactivo en el depósito designado.Cargue la celda de flujo, el cartucho de búfer y el cartucho de reactivo en el sistema. A continuación, realice una comprobación automatizada y revise la salida para asegurarse de que los parámetros de ejecución pasan la comprobación del sistema. Una vez completada la comprobación automatizada, seleccione Iniciar para iniciar la ejecución de secuenciación.Para visualizar los resultados de control de calidad de preprocesamiento y control de calidad posterior a la alineación, ejecute multi-QC para generar un informe agregado en formato HTML. Para determinar los efectos de lote y evaluar el mapa de calidad del conjunto de datos especificado, utilice un script de R para ejecutar un análisis de componente principal. El análisis de correlación de muestras se puede llevar a cabo utilizando la correlación de Pearson entre diferentes muestras.La estimación de la proporción de fragmentos de más de 100 nucleótidos es más útil que una estimación de los fragmentos de más de 200 nucleótidos, ya que es más sensible para medir con precisión la proporción de tamaños de fragmentos más pequeños para muestras de ARN altamente degradadas. Dado el alto grado de degradación en el conjunto de muestras, se recomienda un método total de preparación de la biblioteca de ARN. Por ejemplo, aquí se muestran las bibliotecas de secuenciación preparadas a partir de cuatro ejemplos diferentes.Aquí, se muestran información general sobre la calidad de secuenciación de archivos FastQ sin procesar y el contenido del adaptador de ejemplo. El cribado FastQC puede ayudar a detectar contaminación como contaminación bacteriana o de ratón dentro de las muestras. La alineación STAR se puede utilizar para determinar la proporción de lecturas asignadas al genoma de referencia, el porcentaje de lecturas asignadas de forma única al genoma de referencia y la proporción de lecturas que no se asignaron o que se asignaron a varios loci.La tarjeta y las estadísticas RSeQC se pueden utilizar para determinar el porcentaje de ARN de mensajería, bases intrónicas e intergénicas presentes en las lecturas asignadas. Para estos análisis representativos, algunas bibliotecas degradadas tenían un sesgo de tres primos en el que se asignaban más lecturas más cerca de los tres primeros que a los cinco finales principales. Además, se puede realizar un análisis de componentes principales para determinar el porcentaje de la variación total capturada por los componentes principales para las réplicas biológicas de cada muestra.Tenga cuidado de evitar la degradación de la muestra, preparar réplicas y varias capas para cada muestra, utilizar las métricas adecuadas para evaluar la calidad de la muestra y utilizar el método de preparación de la biblioteca adecuado. Utilizando esta metodología, se pueden realizar estudios NGS más grandes con muestras de FFPE previamente inutilizables con diferentes tiempos y condiciones de almacenamiento para obtener información sobre una variedad de diferentes estados de la enfermedad. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudien los grandes archivos existentes de muestras de FFPE con información clínica rica y pueden mejorar en gran medida los estudios de cáncer basados en la población.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Clasificación de flujo y secuenciación exome de las células Reed-Sternberg del linfoma de Hodgkin clásico

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Investigación

Genética

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detección del número de copias alteraciones Uso de Secuenciación de los organismos unicelulares

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimización y Análisis Comparativo de Métodos de Enriquecimiento de ADN de Organelos Vegetales Adecuados para Secuenciación de Próxima Generación

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generación de inmunoprecipitación de la cromatina nativa secuenciación bibliotecas para el análisis de densidad de nucleosoma

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Cromatina (ChIP) de la inmunoprecipitación protocolo para muestras embrionarias baja abundancia

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robusto de ADN y la secuenciación de alto rendimiento biblioteca construcción de especímenes de herbario

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detección de eventos raros usando ADN Error corregido y secuenciación de ARN

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Amplificación de cerca integrales provirus VIH-1 para secuenciación de próxima generación

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Secuenciación de semiconductores para pruebas genéticas preimplantaciones para la aneuploidía

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Secuenciación de ARNm de sangre entera utilizando secuenciación de nanoporos

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...