Name: optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples
Uploaded: 2020-06-08T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Vi är tacksamma till Dr Danielle Carrick (Avdelningen för cancerkontroll och befolkningsvetenskap, National Cancer Institute) för fortsatt hjälp, särskilt för att inleda denna studie, ge oss prover, och för användbara förslag under dataanalys. Vi tackar uppriktigt alla medlemmar i CCR Sequencing Facility vid Frederick National Laboratory for Cancer Research för deras hjälp under provberedning och sekvensering, särskilt Brenda Ho för hjälp i prov QC, Oksana tyska för bibliotek QC, Tatyana Smirnova för att köra sequencers. Vi vill också tacka Tsai-wei Shen och Ashley Walton på Sequencing Facility Bioinformatics Group för att hjälpa till med dataanalys och RNA-seq pipeline genomförande. Vi tackar också CCBR och NCBR för hjälp med RNaseq analys pipeline och bästa praxis utveckling.

1. RNA-kvantitet och kvalitetsbedömning
<ol><li>Välj FFPE-proverna enligt fördefinierade kriterier och extrahera RNA med en lämplig metod (t.ex. FFPE-nuclei acid extraction kit, Table of Materials). OBS: Det finns flera olika metoder för FFPE-RNA utvinning, inklusive nyare microdissection metoder som kan arbeta med mycket lite vävnad och extrahera god kvalitet RNA12,13,14.</li>
	<li>Största möjliga ...

<ol>
	<li>Carrick, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+Next+Generation+Sequencing+on+Older+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+Tissue.">Robustness of Next Generation Sequencing on Older Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue.</a> PLoS One. 10 (7), 0127353 (2015).</li><li>Hedegaard, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+of+RNA+and+DNA+isolated+from+paired+fresh-frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+samples+of+human+cancer+and+normal+tissue.">Next-generation sequencing of RNA and DNA isolated from paired fresh-frozen and formalin-fixed paraffin-embedded samples of human cancer and normal tissue.</a> PLoS One. 9 (5), 98187 (2014).</li><li>Zhang, P., Lehmann, B. D., Shyr, Y., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Utilization+of+Formalin+Fixed-Paraffin-Embedded+Specimens+in+High+Throughput+Genomic+Studies.">The Utilization of Formalin Fixed-Paraffin-Embedded Specimens in High Throughput Genomic Studies.</a> International Journal of Genomics. 2017, 1926304 (2017).</li><li>Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+fixatives+and+tissue+processing+on+the+content+and+integrity+of+nucleic+acids.">Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids.</a> American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).</li><li>von Ahlfen, S., Missel, A., Bendrat, K., Schlumpberger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determinants+of+RNA+quality+from+FFPE+samples.">Determinants of RNA quality from FFPE samples.</a> PLoS One. 2 (12), 1261 (2007).</li><li>Esteve-Codina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Comparison+of+RNA-Seq+Results+from+Paired+Formalin-Fixed+Paraffin-Embedded+and+Fresh-Frozen+Glioblastoma+Tissue+Samples.">A Comparison of RNA-Seq Results from Paired Formalin-Fixed Paraffin-Embedded and Fresh-Frozen Glioblastoma Tissue Samples.</a> PLoS One. 12 (1), 0170632 (2017).</li><li>Vukmirovic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+validation+of+differentially+expressed+transcripts+by+RNA-sequencing+of+formalin-fixed,+paraffin-embedded+(FFPE)+lung+tissue+from+patients+with+Idiopathic+Pulmonary+Fibrosis.">Identification and validation of differentially expressed transcripts by RNA-sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) lung tissue from patients with Idiopathic Pulmonary Fibrosis.</a> BMC Pulmonary Medicine. 17 (1), 15 (2017).</li><li>Adiconis, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+RNA+sequencing+methods+for+degraded+or+low-input+samples.">Comparative analysis of RNA sequencing methods for degraded or low-input samples.</a> Nature Methods. 10 (7), 623-629 (2013).</li><li>Sinicropi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+transcriptome+RNA-Seq+analysis+of+breast+cancer+recurrence+risk+using+formalin-fixed+paraffin-embedded+tumor+tissue.">Whole transcriptome RNA-Seq analysis of breast cancer recurrence risk using formalin-fixed paraffin-embedded tumor tissue.</a> PLoS One. 7 (7), 40092 (2012).</li><li>Altekruse, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEER+cancer+registry+biospecimen+research:+yesterday+and+tomorrow.">SEER cancer registry biospecimen research: yesterday and tomorrow.</a> Cancer Epidemiology, Biomarkers &amp; Prevention. 23 (12), 2681-2687 (2014).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robustness+of+RNA+sequencing+on+older+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+from+high-grade+ovarian+serous+adenocarcinomas.">Robustness of RNA sequencing on older formalin-fixed paraffin-embedded tissue from high-grade ovarian serous adenocarcinomas.</a> PLoS One. 14 (5), 0216050 (2019).</li><li>Amini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimised+protocol+for+isolation+of+RNA+from+small+sections+of+laser-capture+microdissected+FFPE+tissue+amenable+for+next-generation+sequencing.">An optimised protocol for isolation of RNA from small sections of laser-capture microdissected FFPE tissue amenable for next-generation sequencing.</a> BMC Molecular Biology. 18 (1), 22 (2017).</li><li>Amini, P., Nassiri, S., Ettlin, J., Malbon, A., Markkanen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+RNA+sequencing+of+FFPE+subsections+reveals+highly+conserved+stromal+reprogramming+between+canine+and+human+mammary+carcinoma.">Next-generation RNA sequencing of FFPE subsections reveals highly conserved stromal reprogramming between canine and human mammary carcinoma.</a> Disease Models and Mechanisms. 12 (8), (2019).</li><li>Wimmer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+RNA+quality,+microarray+data+reliability+and+pathway+analysis+in+fresh,+fresh+frozen+and+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+samples.">Systematic evaluation of RNA quality, microarray data reliability and pathway analysis in fresh, fresh frozen and formalin-fixed paraffin-embedded tissue samples.</a> Scientific Reports. 8 (1), 6351 (2018).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</a> (2019)</li><li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cutadapt+removes+adapter+sequences+from+high-throughput+sequencing+reads.">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li><li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trimmomatic:+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data.">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li><li>. Babraham Bioinformatics Available from: <a target="_blank" href="https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/">https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastq_screen/</a> (2019)</li><li>Wood, D. E., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kraken:+ultrafast+metagenomic+sequence+classification+using+exact+alignments.">Kraken: ultrafast metagenomic sequence classification using exact alignments.</a> Genome Biology. 15 (3), 46 (2014).</li><li>Dobin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAR:+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner.">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li><li>Wang, L., Wang, S., Li, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSeQC:+quality+control+of+RNA-seq+experiments.">RSeQC: quality control of RNA-seq experiments.</a> Bioinformatics. 28 (16), 2184-2185 (2012).</li><li>Ewels, P., Magnusson, M., Lundin, S., Kaller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiQC:+summarize+analysis+results+for+multiple+tools+and+samples+in+a+single+report.">MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report.</a> Bioinformatics. 32 (19), 3047-3048 (2016).</li><li>Li, B., Dewey, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RSEM:+accurate+transcript+quantification+from+RNA-Seq+data+with+or+without+a+reference+genome.">RSEM: accurate transcript quantification from RNA-Seq data with or without a reference genome.</a> BMC Bioinformatics. 12, 323 (2011).</li><li>Son, K., Yu, S., Shin, W., Han, K., Kang, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Guideline+to+Assess+the+Characteristics+of+RNA-Seq+Data.">A Simple Guideline to Assess the Characteristics of RNA-Seq Data.</a> BioMed Research International. 2018, 2906292 (2018).</li><li>McCarthy, D. J., Chen, Y., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+analysis+of+multifactor+RNA-Seq+experiments+with+respect+to+biological+variation.">Differential expression analysis of multifactor RNA-Seq experiments with respect to biological variation.</a> Nucleic Acids Research. 40 (10), 4288-4297 (2012).</li><li>Robinson, M. D., McCarthy, D. J., Smyth, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=edgeR:+a+Bioconductor+package+for+differential+expression+analysis+of+digital+gene+expression+data.">edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data.</a> Bioinformatics. 26 (1), 139-140 (2010).</li><li>Ritchie, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limma+powers+differential+expression+analyses+for+RNA-sequencing+and+microarray+studies.">limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies.</a> Nucleic Acids Research. 43 (7), 47 (2015).</li><li>Subramanian, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+set+enrichment+analysis:+a+knowledge-based+approach+for+interpreting+genome-wide+expression+profiles.">Gene set enrichment analysis: a knowledge-based approach for interpreting genome-wide expression profiles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America U S A. 102 (43), 15545-15550 (2005).</li><li>Mootha, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PGC-1alpha-responsive+genes+involved+in+oxidative+phosphorylation+are+coordinately+downregulated+in+human+diabetes.">PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes.</a> Nature Genetics. 34 (3), 267-273 (2003).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), 25-29 (2000).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources.">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nature Protocols. 4 (1), 44-57 (2009).</li><li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioinformatics+enrichment+tools:+paths+toward+the+comprehensive+functional+analysis+of+large+gene+lists.">Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists.</a> Nucleic Acids Research. 37 (1), 1-13 (2009).</li><li>Evaluating RNA Quality from FFPE Samples. Illumina Available from: <a target="_blank" href="https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf">https://www.illumina.com/content/dam/illumina-marketing/documents/products/technotes/evaluating-rna-quality-from-ffpe-samples-technical-note-470-2014-001.pdf</a> (2016)</li></ol>

Den metod som beskrivs här beskriver de viktigaste stegen som krävs för att få bra sekvensdata från FFPE-RNA-exempel. De viktigaste punkterna att tänka på med denna metod är: (1) Se till att RNA bevaras så bra som möjligt efter extraktion genom att minimera provhanteringen och frysnings- och upptiningscyklerna. Separata QC alikvoter är till stor hjälp. (2) Använd ett QC-mått som är bäst för den angivna provuppsättningen. RIN-värden och DV200 är ofta inte användbara för skadade prover, och...

Användning av nästa generations sekvensering metoder har gjort det möjligt för oss att få fram en mängd information från olika typer av prover. Gamla och dåligt bevarade prover förblir dock ogenomförbara för de vanliga metoderna för att generera sekvensdata och kräver ofta ändringar av väletablerade protokoll. FFPE vävnader representerar en sådan provtyp som har använts i stor utsträckning för kliniska exemplar1,,2,3. Medan FFPE bevarande upprätthåller vävnad morfologi, nukleinsyrorna i FFPE vävnader uppvisar vanligtvis ett brett spektrum av skador och nedbrytning, vilket gör det svårt att hämta den genomiska information som kan leda till viktiga insikter om molekylära mekanismer som ligger till grund för olika sjukdomar.
Genuttrycksdata som genereras av RNA-sekvensering är ofta avgörande för att studera sjukdomar och resistensmekanismer och kompletterar DNA-mutationsanalys. RNA är dock mer mottagliga för nedbrytning, vilket gör det mer utmanande att generera korrekta genuttrycksdata från FFPE-vävnader. Eftersom den stora tillgängligheten och överkomligheten för sekvensering är relativt ny, lagrades dessutom äldre exemplar ofta inte under de förhållanden som krävs för att bevara RNA-integriteten. Några av de frågor för FFPE prover inkluderar nedbrytning av RNA på grund av inbäddning i paraffin, kemisk modifiering av RNA leder till fragmentering eller refractoriness till enzymatiska processer som krävs för sekvensering, och förlust av poly-A svansar, begränsa tillämpligheten av oligo-dT som en primer för omvänd transkriptas4. En annan utmaning är hantering/lagring av FFPE-prover under suboptimala förhållanden, vilket kan leda till ytterligare nedbrytning av labila molekyler som RNA i vävnaderna5. Detta är särskilt relevant för äldre prover som kan ha samlats in vid en tidpunkt då genuttrycksanalys av RNA-sekvensering inte förväntades för proverna. Alla dessa leder till minskad kvalitet och kvantitet av det extraherade RNA som är tillgängligt för att generera användbara sekvensdata. Den låga sannolikheten för framgång, i kombination med de höga kostnaderna för sekvensering, har avskräckt många forskare från att försöka generera och analysera genuttryck data från potentiellt användbara FFPE prover. Vissa studier under de senaste åren har visat användbarheten av FFPE vävnader för genuttryck analys2,6,7,8,9, om än för färre och/eller nyare prover.
Som en genomförbarhetsstudie använde vi RNA utvinns ur FFPE tumör vävnad exemplar från tre Residual Tissue Förråd från övervakning, epidemiologi, och slutresultat (SEER) cancer register för RNA sekvensering och genuttryck analys10. Upphandlas från kliniska patologi labs, FFPE vävnader från högvärdiga äggstockscancer serösa adenokarcinom lagrades från 7-32 år under olika förhållanden före RNA utvinning. Eftersom i de flesta fall dessa block hade lagrats på olika platser i flera år utan förväntningar på någon känslig genetisk analys i framtiden, inte mycket omsorg hade vidtagits för att bevara nukleinsyror. Således uppvisade de flesta av proverna dålig kvalitet RNA, med en stor andel av prover förorenade med bakterier. Ändå kunde vi utföra gen kvantifiering, mäta enhetlighet och kontinuitet gen täckning, och utföra Pearson korrelation analys bland biologiska replikerar för att mäta reproducerbarhet. Baserat på en uppsättning nyckel signatur genpanel, jämförde vi proverna i vår studie med Cancer Genome Atlas (TCGA) data och bekräftade att cirka 60% av proverna hade jämförbara genuttryck profiler11. Baserat på korrelationen mellan olika QC-resultat och exempelmetadata identifierade vi viktiga QC-mått som har bra prediktivt värde för att identifiera exempel som är mer benägna att generera användbara sekvensdata11.
Här beskriver vi den metod som används för FFPE-RNA kvalitetsbedömning, generering av sekvensering bibliotek från extraherade RNA prover, och bioinformatisk analys av sekvensering data.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>2100 Bioanalyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G2939BA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent DNA 7500 Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent High Sensitivity DNA Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AllPrep DNA/RNA FFPE Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80234</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CFX96 Touch System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1855195</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Library Quantification kit v2-Illumina</td>
			<td>KapaBiosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext Ultra II Directional RNA Library Prep Kit for Illumina</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E7765S</td>
			<td>https://www.neb.com/protocols/2017/02/07/protocol-for-use-with-ffpe-rna-nebnext-rrna-depletion-kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEBNext rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>E6310L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq 500 Sequencing System</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-415-1001</td>
			<td>NextSeq 500 System guide: https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/system_documentation/nextseq/nextseq-500-system-guide-15046563-06.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NextSeq PhiX Control Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-110-3002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NSQ 500/550 Hi Output KT v2.5 (150 CYS)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10X Genomics Magnetic Separator</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>120250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator Multimixer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>13916-822</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C1000 Touch Thermal Cycler</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1851197</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sequencing reagent kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cell package</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buffer cartridge and the reagent cartridge</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>20024907</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydroxide solution (0.2N)</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>SX0607D-6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TRIS-HCL Buffer 1.0M, pH 7.0</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-151-871</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optimization for sequencing and analysis of degraded ffpe-rna samples

Genuttrycksanalys genom RNA-sekvensering (RNA-seq) möjliggör unika insikter i kliniska prover som potentiellt kan leda till mekanistisk förståelse av grunden för olika sjukdomar samt resistens- och/eller känslighetsmekanismer. FFPE-vävnader, som representerar den vanligaste metoden för att bevara vävnadsmorfologi i kliniska prover, är dock inte de bästa källorna för genuttrycksprofileringsanalys. RNA som erhålls från sådana prover bryts ofta ned, fragmenteras och modifieras kemiskt, vilket leder till suboptimala sekvenseringsbibliotek. I sin tur genererar dessa sekvensdata av dålig kvalitet som kanske inte är tillförlitliga för genuttrycksanalys och mutationsupptäckt. För att få ut det mesta av FFPE-prover och få bästa möjliga data från prover av låg kvalitet är det viktigt att vidta vissa försiktighetsåtgärder när du planerar experimentell design, förbereder sekvenseringsbibliotek och under dataanalys. Detta inkluderar användning av lämpliga mått för exakt provkvalitetskontroll (QC), identifiera de bästa metoderna för olika steg under sekvensering bibliotek generation, och noggrant bibliotek QC. Dessutom är det viktigt att använda korrekta programvaruverktyg och parametrar för sekvensdataanalys för att identifiera artefakter i RNA-seq-data, filtrera bort föroreningar och läsa av låg kvalitet, bedöma enhetlig gentäckning och mäta reproducerbarheten hos genuttrycksprofiler bland biologiska replikat. Dessa steg kan säkerställa hög noggrannhet och reproducerbarhet för profilering av mycket heterogena RNA-prover. Här beskriver vi de olika stegen för prov QC, bibliotek förberedelse och QC, sekvensering och dataanalys som kan bidra till att öka mängden användbara data som erhållits från låg kvalitet RNA, såsom den som erhållits från FFPE-RNA vävnader.

Den metod som beskrivs ovan tillämpades på 67 FFPE-prover som hade lagrats under en mängd olika förhållanden i 7–32 år (medianprovets lagringstid var 17,5 år). De dataset och analysresultat som presenteras här har tidigare beskrivits och publicerats i Zhao et al.11. Vid kontrollen av provkvaliteten enligt beskrivningen ovan (t.ex. spår i figur 2) konstaterades DV100 vara mer användbar än DV200, eftersom det är mer känsligt att exak...

Watch this Scientific Journal Video about Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples at JoVE.com

Optimization for Sequencing and Analysis of Degraded FFPE-RNA Samples

Den här metoden beskriver stegen för att förbättra kvaliteten och kvantiteten av sekvensdata som kan erhållas från formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) RNA-prover. Vi beskriver metoden för att mer exakt bedöma kvaliteten på FFPE-RNA-prover, förbereda sekvensering bibliotek och analysera data från FFPE-RNA prover.

Optimering för sekvensering och analys av försämrade FFPE-RNA-prover

Gene expression analysis by RNA sequencing (RNA-seq) enables unique insights into clinical samples that can potentially lead to mechanistic understanding ...

Vårt protokoll kan användas för att förbättra kvaliteten och kvantiteten av genuttrycksdata som genereras från FFPE-härledda RNA-prover, särskilt i suboptimala kvalitetsprover. Denna teknik bedömer RNA-kvaliteten inom FFPE vävnadsprover och möjliggör optimering av deras nedströms bearbetning för att förbättra kvantiteten och kvaliteten på provsekvenseringsdata. Denna metod möjliggör omfattande karakterisering av en avskrift i biologiska och kliniska prov och kan ge insikt i funktionella delar av arvsmassan i utveckling och sjukdom.FFPE-RNA-nedbrytning och val av metoderna för prov QC, biblioteksberedning och dataanalys kan alla vara mycket knepigt. Var noggrann när du väljer rätt metoder och lämpliga kontroller. Visuell demonstration gör det möjligt för tittarna att observera de små subtila modifieringar och försiktighetsåtgärder som behövs under planeringen, bedömning, och sekvenseringsprocessen särskilt för dåligt bevarade FFPE prover.För att kontrollera kvaliteten på RNA-provet, kör provet på ett RNA QC-system enligt tillverkarens anvisningar och använd lämplig bioanalysprogramvara för att analysera RNA-fragmentens fördelning inom provet och för att beräkna andelen fragment som är längre än 100 och 200 kärnor. Baserat på mätvärdena QC, identifiera proverna med färre än 40%av fragmenten längre än 100 nukleotider för att tillåta uteslutning av dessa prover från bearbetning. För sekvensering, tina lämpliga sekvenseringsreagenssatser enligt runparametrarna i ett vattenbad för rumstemperatur och placera reagensbrickan vid fyra grader Celsius efter upptining.Placera flödescellpaketet i rumstemperatur i 30 minuter. Medan paketet är uppvärmningen, öppna Illumina Experiment Manager ansökan och välj Skapa exempel blad. Välj den sequencer som ska användas och klicka på Nästa.Ange reagenssatsens streckkod och de andra lämpliga arbetsflödesparametrarna. Ladda sedan upp ett provblad som skapats enligt sekvenskriterierna för Illumina. För att förbereda provbiblioteket och kontrollbiblioteket PhiX, denaturera och späda ut biblioteken till lämpliga koncentrationer och blanda prov- och PhiX-kontrollbiblioteken för att få ett 5%PhiX-kontrollvolymförhållande.När flödescellerna är klara, ta bort omslaget, rengör glasytan med en luddfri alkoholtork och torka glaset med en låg ludd laboratorievävnad. Ta bort reagenspatronen från fyra grader Celsius lagring och invertera patronen fem gånger för att blanda reagenserna. Knacka försiktigt på patronen på bänken för att minska luftbubblor och ladda det denaturerade och utspädda provet i reagenspatronen i den avsedda behållaren.Ladda flödescellen, buffertpatronen och reagenspatronen på systemet. Gör sedan en automatiserad kontroll och granska utdata för att säkerställa att körparametrarna klarar systemkontrollen. När den automatiserade kontrollen är klar väljer du Start för att påbörja sekvenseringskörningen.Om du vill visualisera pre-processing QC och efterjustering QC resultat, kör multi-QC att generera en aggregerad rapport i HTML-format. För att fastställa batcheffekter och för att bedöma kvalitetskartan för den givna datauppsättningen, använd ett R-skript för att köra en huvudkomponentanalys. Provkorrelationsanalys kan sedan utföras med hjälp av Pearson-korrelationen mellan olika prover.Uppskattningen av andelen fragment som är längre än 100 nukleotider är mer användbar än en uppskattning av fragmenten som är längre än 200 nukleotider eftersom den är känsligare för att exakt mäta andelen mindre fragmentstorlekar för starkt nedbrutna RNA-prover. Med tanke på den höga nedbrytningsgraden i provmängden rekommenderas en total RNA-biblioteksberedningsmetod. Till exempel här sekvensering bibliotek som utarbetats från fyra olika prover visas.Här visas översikter över rå FastQ-filsekvenseringskvalitet och provadapterinnehåll. FastQC screening kan hjälpa till att upptäcka kontaminering såsom bakteriell eller mus kontaminering inom proverna. STAR-inriktningen kan användas för att bestämma andelen läsningar som mappats till referensgenomet, procentuellt avläsningar som mappats unikt till referensgenomet och andelen läsningar som inte mappades, eller som mappades till flera lokus.Kortet och RSeQC statistik kan användas för att bestämma procent av messenger RNAs, intronic och intergenic baser som finns i de kartlagda läsningar. För dessa representativa analyser hade några försämrade bibliotek en tre främsta partiskhet där fler läsningar kartlades närmare de tre främsta än till de fem främsta. Dessutom kan huvudkomponentanalys utföras för att bestämma procent av den totala variationen som fångas av de viktigaste komponenterna för de biologiska replikaten av varje prov.Var noga med att undvika provförsämring, förbereda replikat och flera rockar för varje prov, använd lämpliga mått för att bedöma provkvaliteten och använd rätt biblioteksberedningsmetod. Med hjälp av denna metodik kan större NGS-studier utföras med tidigare oanvändbara FFPE-prover med varierande lagringstider och förhållanden för att få insikter i en mängd olika sjukdomstillstånd. Denna teknik banade väg för forskare att studera befintliga stora arkiv av FFPE prov med rik klinisk information och kan kraftigt förbättra populationsbaserade cancerstudier.

Research

JoVE Journal

Genetics

Flow-sorting and Exome Sequencing of the Reed-Sternberg Cells of Classical Hodgkin Lymphoma

Flödessortering och Exome-sekvensering av Reed-Sternberg-cellerna av klassisk Hodgkin-lymfom

The Hodgkin Reed-Sternberg cells of classical Hodgkin lymphoma are sparsely distributed within a background of inflammatory lymphocytes and typically ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detektion av Copy Number Ändringar Använda Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

Optimering och jämförande analys av organellära DNA-berikningsmetoder lämpliga för nästa generations sekvensering

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

Generation of Native Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Libraries for Nucleosome Density Analysis

Generation av infödda kromatin Immunoprecipitation sekvensering bibliotek för Nucleosome densitet analys

We present a modified native chromatin immunoprecipitation sequencing (ChIP-seq) experimental protocol compatible with a Gaussian mixture distribution ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Kromatin Immunoprecipitation (ChIP) protokoll för låg-överflöd embryonala prover

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

Robust DNA Isolation and High-throughput Sequencing Library Construction for Herbarium Specimens

Robust DNA isolering och hög genomströmning sekvensering bibliotek konstruktion för herbarieexemplar

Herbaria are an invaluable source of plant material that can be used in a variety of biological studies. The use of herbarium specimens is associated with ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Detektion av sällsynta händelser med fel-korrigerade DNA och RNA-sekvensering

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Amplification of Near Full-length HIV-1 Proviruses for Next-Generation Sequencing

Förstärkning av nära fullängds HIV-1 Proviruses för nästa generations sekvensering

The Full-Length Individual Proviral Sequencing (FLIPS) assay is an efficient and high-throughput method designed to amplify and sequence single, near ...

Semiconductor Sequencing for Preimplantation Genetic Testing for Aneuploidy

Halvledar sekvensering för preimplantatorisk genetisk testning för aneuploidi

Chromosomal aneuploidy, one of the main causes leading to embryonic development arrest, implantation failure, or pregnancy loss, has been well documented ...

Sequencing of mRNA from Whole Blood using Nanopore Sequencing

Sekvensering av mRNA från helblod med Nanopore sekvensering

Sequencing in remote locations and resource-poor settings presents unique challenges. Nanopore sequencing can be successfully used under such conditions, ...