Denne In Vitro Disease Model, kan bruges til at studere samspillet mellem fuldblod og patient afledte celler, specielt endotel, at vurdere trombogenicity og effektiviteten af antikoagulerende midler. Dette er endotelceller kan bruges på en anden omstændigheder og kan ændres ved at indføre skræddersyede microfluidics eller ved at justere blodgennemstrømning parametre. Desuden kan denne model bruges til at studere trombedynamik under inflammatoriske tilstande eller til at vurdere virkningerne af antikoagulerende og antiplateletbehandling.
I sidste ende kan disse tilgange bruges i en metode til personlig medicin. Efter at have fået en kirurgisk human lungepulmonal arterie vævsprøve, pels høj-affinitet celle bindende 60 milliliter cellekultur fad med to milliliter af fem mikrogram pr milliliter fiboronectin og inkubere skålen ved 37 grader Celsius i mindst 15 minutter. Ved inkubationens afslutning anvendes sterile kraftbecer i et laminar flowkabinet under sterile forhold for at overføre vævet til en petriskål af PBS.
Hvis vævet stadig er i en ring, skæres arterien åben med en saks, idet du passer på ikke at røre det inderste lag af karret, da endotel let beskadiges og fjernes. Efter fjernelse af fibronectin, tilsæt fire milliliter komplet endotelcelle medium til skålen og bruge kraftblænd til at overføre vævsprøven i mediet, skal du bruge en skalpel til omhyggeligt at skrabe det indre lag af fartøjet ind i mediet, idet du skal passe på at undgå lipid ophobninger, der er observeret i karvæggen. Når cellerne er høstet, skal pladen sættes ind i cellekulturkubvøsen.
Hvis fibroblaster forurener kulturen, skal du bruge magnetisk affinitetscelleadskillelse til en CD144 i henhold til producentens anvisninger til at rense cellerne. Generelt er kultur defineret som ren, når flow cytometri registrerer 10% eller færre forurenende celler. Når det tilstrækkelige antal endotelceller er opnået til eksperimentel brug, kan de primære endotelceller karakteriseres for tilstedeværelsen af endotelcellespecifikke markører og for fravær af glatte muskel- og epitelcellemarkører.
For flow kammer forberedelse, kode en kanal af en seks godt flow dias med 30 mikroliter på 0,1% gelatine og inkubere dette dias i mindst 15 minutter ved 37 grader Celsius. Ud over kommercielle flowkamre kan specialfremstillede flowkamre med specifikke dimensioner bruges til at undersøge den vaskulære geometris indflydelse på blodpropdynamikken. Mens diaset er inkubering, indsamle cellerne fra et sammenløb lungepulsåren endotelcellekultur med EDTA og trypsin og sediment, at celler ved centrifugering, re suspendere pellet i 600 mikroliter af komplette endotelcelle medium og kraftigt, men forsigtigt, tilføje 100 mikroliter af celler i hver kanal, tilføje en ekstra 50 mikroliters af komplet endotelcelle medium til kanalen , for at give tilstrækkeligt medium til natten inkubation ved 37 grader Celsius og 5%kuldioxid, ændre mediet den næste dag til at vaske væk ubundne celler.
Efter seks dage i kultur, bør cellerne har dannet en stabil sammenflydende monolag. På dag syv af lungepulsåren endotelcellekultur, erhverve en venøs blodprøver fra personer, der ikke modtager antikoagulationsbehandling i 109 mononatriumcitrat antikoagulerende rør og overføre blodet til en 50 milliliter rør. Blod kan indeholde virus og andre smitsomme stoffer.
Derfor er det vigtigt altid at bære handsker og følge sikkerhedsvejledningen for arbejde med menneskeligt materiale. Fluorescerende mærket blodceller med 1 til 10, 000 koncentration af Calcein AM Red og 50 mikrogram per milliliter og tilsæt Alexa 488 fibrinogen, derefter inkubere blodet ved 37 grader Celsius i 15 minutter for at tillade fuldstændig absorption. 30 minutter før perfusionen behandles lungearteriens endotelceller med 100 mikroliter af en mikromolarhistamin i endotelcellemedium og 1 % føtalt kvægserum uden andre tilsætningsstoffer.
Og brug en 20 milliliter sprøjte fyldt med vaskebuffer til at skylle flowsystemet rør, indlæse en tredjedel til 20 milliliter sprøjte med to milliliter vask buffer og læg sprøjten på en sprøjtepumpe. Brug en anden 20 milliliter sprøjte til at fylde flow rør med hippier plus buffer, der indeholder 1%kvæg serum albumin og bruge en albue form Laura stik til omhyggeligt at forbinde rørene til mikro dias, forbinde udløbet af diaset til sprøjten, reparation fra mikroskopi ved at placere cellen indeholder dias på scenen og samle opsætningen for forsøget , juster mikroskopet, og angiv parametrene for billeddannelse. Genberegning af eftertrykkeligt blod.
Og dette er en glad co-sponsor af koagulation, desuden forsøge at undgå dannelse af luftbobler, fordi dette vil beskadige endotel celle lag og påvirke dine resultater. Umiddelbart før perfusion, fortyndes blodet på to gange med genberegning buffer og placere indløbsrøret af mikro dias i røret af blod, skal du trykke på start på sprøjten pumpen. Så snart blodet begynder at flyde over endotelet, skal du trykke på start på mikroskopet for at erhverve billeder ved hjælp af de forudvalgte aktive kanaler og region af interessepositioner hvert 15.
I slutningen af analysen skal du stoppe optagelsen og sprøjtepumpen og rydde op korrekt. Mærkning blodplader med Calcein AM Red og tilsætning af Alexa 488 konjugeret fibrinogen, giver mulighed for undersøgelse af trombe dannelse ved blodplade vedhæftning og fiber og aflejring. Under ikke-stimulerede forhold er der ingen binding af blodplader eller fibrin til endotelet.
Stimulering med histamin resulterer i en øjeblikkelig stigning i trombocyt vedhæftning, der når et plateau efter 2,5 minutter, på dette tidspunkt, blodpladerne begynder at udskille autokrine faktorer, der fremkalder en blodplade sammenlægning og fibrinogen spaltning til fibrin, resulterer i fiber og aflejring på tre minutter og dannelsen af en stabil samlet med blodpladerne efter fire minutter. Behandling med et direkte antikoagulerende middel hæmmer både blodpropdannelse og trombocyt vedhæftning sammenlignet med ubehandlet blod. Immunofluorescerende analyse af lungepulsåren endotelcelleplade interaktioner efter fem minutters perfusion, afslører vedligeholdelse af endotelcelle, cellekontakter, som bekræftet af vaskulære endotel cadherin farvning, hvilket indikerer, at blodpropper form på endotel model lag snarere end på den underliggende matrix mellem endotel huller.
humane navleceller viser mindre trombocythæftning og fibrinaflejring sammenlignet med lungearterien endotel. Især, syge primære lungepulmonal arterie endotelceller fra kronisk tromboembolisk pulmonal hypertension patienter, udviser en øget trombose vedhæftning og mere fibrin deposition sammenlignet med raske celler. Trombogenicity af endotelet er afhængig af flere faktorer som oprindelsen af vaskulære seng eller dele af biologisk baggrund.
Ved hjælp af denne protokol, iboende dysfunktioner i vaskulære og blodkomponenter, samt effektiviteten af anti koaguleret behandling kan testes i forskellige faser af trombose hæmostase. Denne protokol kan bruges til at forstå blod og Theo interaktioner, i forskellige tromboemboliske sygdomme med det ultimative potentiale til at forudsige patient-specifikke reaktioner på antikoagulation terapi.