Dit In Vitro Disease Model, kan worden gebruikt om de interactie van volbloed en patiënt afgeleide cellen, met name de endotheel, te bestuderen om trombogeniciteit en de effectiviteit van antistollingsmiddelsmiddelen te evalueren. Dit is endotheel cellen kunnen worden gebruikt op verschillende omstandigheden en kan worden gewijzigd door de invoering van op maat gemaakte microfluidics of door het aanpassen van de bloedstroom parameters. Bovendien kan dit model worden gebruikt om de trombusdynamiek in ontstekingsaandoeningen te bestuderen of om de effecten van antistollings- en antiplatelettherapie te beoordelen.
Uiteindelijk kunnen deze benaderingen worden gebruikt in een methode van gepersonaliseerde geneeskunde. Na het verkrijgen van een chirurgische menselijke longslagader weefsel monster, jas hoge affiniteit cel binding 60 milliliter cel cultuur schotel met twee milliliter van vijf microgram per milliliter fiboronectine en incubeer de schotel op 37 graden Celsius gedurende ten minste 15 minuten. Gebruik aan het einde van de incubatie steriele tang in een laminaire stroomkast onder steriele omstandigheden om het weefsel over te brengen in een petrischaaltje PBS.
Als het weefsel zich nog in een ring bevindt, snijd de slagader open met een schaar, waarbij u ervoor zorgt dat de binnenste laag van het vat niet wordt aangeraakt, omdat het endotheel gemakkelijk wordt beschadigd en verwijderd. Na het verwijderen van de fibronectine, voeg vier milliliter van volledige endotheelcelmedium toe aan de schotel en gebruik tangen om het weefselmonster in het medium over te brengen, gebruik een scalpel om de binnenste laag van het vat zorgvuldig in het medium te schrapen, waarbij ervoor wordt gezorgd dat lipideophopingen die in de vaatwand worden waargenomen, worden voorkomen. Nadat de cellen zijn geoogst, plaats de plaat in de celcultuur incubator.
Als fibroblasten de cultuur besmetten, gebruik dan magnetische affiniteit celscheiding voor een CD144, volgens de instructies van de fabrikant om de cellen te zuiveren. Over het algemeen wordt cultuur gedefinieerd als zuiver, wanneer stromingscytometrie 10% of minder vervuilende cellen detecteert. Wanneer het voldoende aantal endotheelcellen is verkregen voor experimenteel gebruik, kunnen de primaire endotheelcellen worden gekarakteriseerd voor de aanwezigheid van endotheelcelspecifieke markers en voor de afwezigheid van gladde spier- en epitheliale celmarkers.
Voor de voorbereiding van de stroomkamer, code één kanaal van een zesputige stroomdia met 30 microliters van 0.1%gelatine en incubeer deze dia minstens 15 minuten bij 37 graden Van Celsius. Naast commerciële stroomkamers kunnen op maat gemaakte flowkamers met specifieke afmetingen worden gebruikt om de invloed van de vasculaire geometrie op de stolseldynamiek te bestuderen. Terwijl de dia is incubatie, verzamel de cellen van een confluent longslagader endotheelcelcultuur met EDTA en trypsine en sediment dat cellen door centrifugatie, opnieuw zweven de pellet in 600 microliter van volledige endotheelcel medium en krachtig maar voorzichtig, voeg 100 microliter cellen in elk kanaal, voeg een extra 50 microliter van volledige endothelial cell medium aan het kanaal , om voldoende medium te bieden voor nachtelijke incubatie bij 37 graden Celsius en 5%kooldioxide, verander het medium de volgende dag om de niet-gebonden cellen weg te wassen.
Na zes dagen in cultuur, moeten de cellen een stabiele confluent monolayer hebben gevormd. Op dag zeven van longslagader endotheelcelcultuur, verwerven van een veneuze bloedmonsters van onderwerpen die geen behandeling tegen stolling ontvangen in 109 mononatrium citraat antistollingsmiddel buizen en breng het bloed in een 50 milliliter buis. Bloed kan virussen en andere besmettelijke stoffen bevatten.
Daarom is het belangrijk om altijd handschoenen te dragen en de veiligheidsrichtlijnen te volgen voor het werken met menselijk materiaal. Fluorescerend gelabeld de bloedcellen met 1 tot 10,000 concentratie van Calcein AM Red en 50 microgram per milliliter en voeg Alexa 488 fibrinogen, dan incubeer het bloed op 37 graden Celsius gedurende 15 minuten om volledige absorptie mogelijk te maken. Behandel 30 minuten voor de perfusie de longslagader endotheelcellen met 100 microliter van één micromolar histamine in endotheelcelmedium en 1%foetaal runderserum zonder andere toevoegingen.
En gebruik een 20 milliliter spuit gevuld met wasbuffer om de stroom systeem buizen spoelen, laden een derde tot 20 milliliter spuit met twee milliliter wasbuffer en laad de spuit op een spuitpomp. Gebruik een tweede spuit van 20 milliliter om de stroombuizen te vullen met hippies plus buffer met 1%bovine serum albumine en gebruik een elleboogvorm Laura-connector om de buizen zorgvuldig aan te sluiten op de microschuif, sluit de uitlaat van de glijbaan aan op de spuit, herstel van microscopie door de cel met dia op het podium te plaatsen en de setup voor het experiment samen te stellen voor het experiment , pas de microscoop aan en stel de parameters voor beeldvorming in. Herkalking van nadrukkelijk bloed.
En dit is een gelukkige co-sponsor van stolling, bovendien proberen om de vorming van luchtbellen te voorkomen, omdat dit zal beschadigen endotheel cel laag en invloed op uw resultaten. Verdun het bloed vlak voor de perfusie twee keer met recalcificatiebuffer en plaats de inlaatbuis van de microglijbaan in de buis van bloed, druk op de spuitpomp. Zodra het bloed over het endotheel begint te stromen, drukt u op de microscoop om beelden te verkrijgen met behulp van de vooraf geselecteerde actieve kanalen en interessegebieden, elke 15 seconden gedurende vijf minuten.
Aan het einde van de analyse, stop de opname en de spuit pomp en goed opruimen. Etikettering van bloedplaatjes met Calcein AM Red en de toevoeging van Alexa 488 geconjugeerde fibrinogen, maakt het onderzoek van trombusvorming door bloedplaatjesver hechting en vezels en afzetting mogelijk. Onder niet-gestimuleerde omstandigheden is er geen binding van bloedplaatjes of fibrine aan het endotheel.
Stimulatie met histamine resulteert in een onmiddellijke toename van de bloedplaatjesver hechting, die een plateau bereikt na 2,5 minuten, op dit moment beginnen de bloedplaatjes autocrinefactoren af te scheiden die een bloedplaatjesaggregatie en fibrinogen decolleté tot fibrine veroorzaken, wat resulteert in vezels en afzetting op drie minuten en de vorming van een stabiel aggregaat met de bloedplaatjes na vier minuten. Behandeling met een direct antistollingsmiddel remt zowel stolselvorming als bloedplaatjes in vergelijking met onbehandeld bloed. Immunofluorescente analyse van longslagader endotheelcelplaatjes interacties na vijf minuten van perfusie, onthult het onderhoud van de endotheelcel, celcontacten, zoals bevestigd door vasculaire endotheel cadherin vlekken, wat aangeeft dat de bloedstolsels vormen op endotheel model lagen in plaats van op de onderliggende matrix tussen endotheel hiaten.
menselijke navelstreng endoek endothelial cellen tonen minder bloedplaatjes adhesie en fibrin afzetting in vergelijking met longslagader endotheel. Met name zieke primaire longslagader endotheelcellen van chronische trombo-embolische hypotheekpatiënten vertonen een verhoogde bloedplaatjesver hechting en meer fibrinafzetting in vergelijking met gezonde cellen. Trombogeniciteit van het endotheel is afhankelijk van meerdere factoren, zoals de oorsprong van het vaatbed of de delen van de biologische achtergrond.
Met behulp van dit protocol kunnen intrinsieke disfuncties in vasculaire en bloedbestanddelen, evenals de effectiviteit van anti gestolde therapie worden getest tijdens verschillende fasen van trombosehemostase. Dit protocol kan worden gebruikt voor het begrijpen van bloed en Theo-interacties, in verschillende trombo-embolische ziekten met het uiteindelijke potentieel om patiëntspecifieke reacties op antistollingstherapie te voorspellen.
