इस इन विट्रो रोग मॉडल का उपयोग थ्रोम्बोजेनिसिटी और एंटीकोगुलैंट एजेंटों की प्रभावशीलता का मूल्यांकन करने के लिए पूरे रक्त और रोगी व्युत्पन्न कोशिकाओं, विशेष रूप से एंडोथेलियल की बातचीत का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। यह एंडोथेलियम कोशिकाओं का उपयोग विभिन्न परिस्थितियों पर किया जा सकता है और कस्टम-निर्मित माइक्रोफ्लुइडिक्स शुरू करके या रक्त प्रवाह मापदंडों को समायोजित करके संशोधित किया जा सकता है। इसके अलावा, इस मॉडल का उपयोग भड़काऊ स्थितियों में थ्रोम्बस गतिशीलता का अध्ययन करने या एंटीकोगुलैंट और एंटीप्लेटलेट थेरेपी के प्रभावों का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
अंततः, इन दृष्टिकोणों का उपयोग व्यक्तिगत दवा की विधि में किया जा सकता है। एक शल्य चिकित्सा मानव फेफड़े की धमनी ऊतक नमूना प्राप्त करने के बाद, कोट उच्च आत्मीयता सेल बाध्यकारी ६० मिलीलीटर सेल संस्कृति पकवान पांच माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के दो मिलीलीटर प्रति मिलीलीटर के साथ फाइबोरीटेक्टिन और कम से 15 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर पकवान इनक्यूबेट । इनक्यूबेशन के अंत में, बाँझ परिस्थितियों में एक लैमिनार प्रवाह कैबिनेट में बाँझ संदंश का उपयोग करें, PBS के एक पेट्री पकवान में ऊतक हस्तांतरण के लिए ।
यदि ऊतक अभी भी एक अंगूठी में है, तो धमनी को कैंची से काट लें, इस बात का ध्यान रखें कि पोत की अंतरतम परत को न छुआ जाए, क्योंकि एंडोथेलियम आसानी से क्षतिग्रस्त हो जाता है और हटा दिया जाता है। फाइब्रोनेक्टिन को हटाने के बाद, डिश में पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम के चार मिलीलीटर जोड़ें और ऊतक नमूने को माध्यम में स्थानांतरित करने के लिए संदंश का उपयोग करें, पोत की आंतरिक परत को ध्यान से मध्यम में परिमार्जन करने के लिए एक स्केलपेल का उपयोग करें, जिससे पोत की दीवार में देखे जाने वाले किसी भी लिपिड संचय से बचने का ध्यान रखा जा सके। कोशिकाओं को काटा जाने के बाद, प्लेट को सेल कल्चर इनक्यूबेटर में रखें।
यदि फाइब्रोब्लास्ट संस्कृति को दूषित करते हैं, तो कोशिकाओं को शुद्ध करने के लिए निर्माता के निर्देशों के अनुसार, सीडी 144 के लिए चुंबकीय आत्मीयता कोशिका अलगाव का उपयोग करें। आम तौर पर, संस्कृति को शुद्ध के रूप में परिभाषित किया जाता है, जब प्रवाह साइटोमेट्री 10% या कम दूषित कोशिकाओं का पता लगाता है। जब प्रायोगिक उपयोग के लिए एंडोथेलियल कोशिकाओं की पर्याप्त संख्या प्राप्त की गई है, तो प्राथमिक एंडोथेलियल कोशिकाओं को एंडोथेलियल सेल विशिष्ट मार्कर की उपस्थिति के लिए और चिकनी मांसपेशियों और एपिथेलियल सेल मार्कर की अनुपस्थिति के लिए चिह्नित किया जा सकता है।
प्रवाह कक्ष तैयारी के लिए, 0.1% जिलेटिन के 30 माइक्रोलीटर के साथ एक छह अच्छी तरह से प्रवाह स्लाइड के एक चैनल कोड और 37 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 15 मिनट के लिए इस स्लाइड इनक्यूबेट। वाणिज्यिक प्रवाह कक्षों के अलावा, विशिष्ट आयामों के साथ कस्टम मेड फ्लो कक्षों का उपयोग थक्के गतिशीलता पर संवहनी ज्यामिति के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। जबकि स्लाइड इनक्यूबेटिंग है, EDTA और ट्राइप्सिन और तलछट के साथ एक कॉन्फ्लोट्रेंट पल्मोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल संस्कृति से कोशिकाओं को इकट्ठा करें जो अपकेंद्रित्र द्वारा कोशिकाओं, पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम के 600 माइक्रोलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें और जबरदस्ती लेकिन धीरे, प्रत्येक चैनल में कोशिकाओं के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, चैनल में पूर्ण एंडोथेलियल सेल माध्यम के अतिरिक्त 50 माइक्रोलीटर जोड़ें , रात भर के लिए पर्याप्त माध्यम प्रदान करने के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस और 5% कार्बन डाइऑक्साइड पर इनक्यूबेशन, अगले दिन माध्यम बदलने के लिए दूर सीमांत कोशिकाओं को धोने ।
संस्कृति में छह दिनों के बाद, कोशिकाओं को एक स्थिर कॉन्फ्लूंट मोनोलेयर का गठन करना चाहिए था। पल्मोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल संस्कृति के सात दिन, उन विषयों से एक शिरायस रक्त नमूने प्राप्त करें जो एंटीकोगुलेशन उपचार 109 मोनोसोडियम सिट्रेट एंटीकोगुलैंट ट्यूब में प्राप्त नहीं करते हैं और रक्त को 50 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं। रक्त में वायरस और अन्य संक्रामक एजेंट हो सकते हैं।
इसलिए हमेशा दस्ताने पहनना और मानव सामग्री के साथ काम करने के लिए सुरक्षा मार्गदर्शन का पालन करना महत्वपूर्ण है। फ्लोरोसेंटली ने रक्त कोशिकाओं को 1 से 10, 000 एकाग्रता के साथ कैल्सेइन एएम रेड और 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर और एलेक्सा 488 फाइब्रिनोजेन जोड़ें, फिर पूर्ण अवशोषण की अनुमति देने के लिए 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर रक्त को इनक्यूबेट किया। परफ्यूजन से 30 मिनट पहले, पल्मोनरी आर्टरी एंडोथेलियल कोशिकाओं का इलाज एंडोथेलियल सेल माध्यम में एक माइक्रोमोलर हिस्टामाइन के 100 माइक्रोलीटर और किसी अन्य योजक के बिना 1% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ करें।
और प्रवाह प्रणाली ट्यूबों कुल्ला करने के लिए धोने बफर से भरा एक 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें, धोने बफर के दो मिलीलीटर के साथ एक तिहाई से 20 मिलीलीटर सिरिंज लोड और एक सिरिंज पंप पर सिरिंज लोड । हिप्पी प्लस बफर के साथ प्रवाह ट्यूबों को भरने के लिए एक दूसरे 20 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग करें जिसमें 1% गोजातीय सीरम एल्बुमिन होता है और ट्यूबों को सावधानीपूर्वक माइक्रो स्लाइड से जोड़ने के लिए कोहनी के आकार की लौरा कनेक्टर का उपयोग करें, स्लाइड के आउटलेट को सिरिंज से कनेक्ट करें, माइक्रोस्कोपी से मरम्मत करें, सेल को मंच पर स्लाइड रखकर और प्रयोग के लिए सेटअप को कोडांतरण करें , माइक्रोस्कोप को समायोजित करें और इमेजिंग के लिए पैरामीटर सेट करें। जोरदार रक्त का पुनर्गणना।
और यह जमावट का एक खुश सह प्रायोजक है, इसके अलावा हवा के बुलबुले के गठन से बचने की कोशिश करें क्योंकि यह एंडोथेलियल सेल परत को क्षतिग्रस्त कर देगा और आपके परिणामों को प्रभावित करेगा। पर्फ्यूजन से तुरंत पहले, पुनर्गणना बफर के साथ दो बार रक्त को पतला करें और माइक्रो स्लाइड की इनलेट ट्यूब को रक्त की ट्यूब में रखें, सिरिंज पंप पर प्रेस शुरू करें। जैसे ही रक्त एंडोथेलियम पर बहने लगता है, माइक्रोस्कोप पर प्रेस शुरू करने के लिए पूर्वचयनित सक्रिय चैनलों और ब्याज पदों के क्षेत्र का उपयोग कर छवियों को प्राप्त करने के लिए, पांच मिनट के लिए हर 15 सेकंड ।
विश्लेषण के अंत में, रिकॉर्डिंग और सिरिंज पंप को रोकें और ठीक से साफ करें। कैल्सीन एएम रेड के साथ प्लेटलेट्स लेबलिंग और एलेक्सा 488 संयुग्मित फाइब्रिनोजेन के अलावा, प्लेटलेट आसंजन और फाइबर और जमाव द्वारा थ्रोम्बस गठन की जांच की अनुमति देता है। गैर उत्तेजित परिस्थितियों में, एंडोथेलियम के लिए प्लेटलेट्स या फाइब्रिन की कोई बाध्यकारी नहीं है।
हिस्टामाइन के परिणामस्वरूप प्लेटलेट आसंजन में तत्काल वृद्धि होती है, जो 2.5 मिनट के बाद एक पठार तक पहुंचती है, इस समय बिंदु पर, प्लेटलेट्स ऑटोक्रिन कारकों को स्रावित करना शुरू करते हैं जो प्लेटलेट एकत्रीकरण और फाइब्रिनोजेन क्लीवेज दरार को फाइब्रिन में प्रेरित करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप तीन मिनट में फाइबर और जमाव होता है और चार मिनट के बाद प्लेटलेट्स के साथ एक स्थिर समग्र का गठन होता है। एक प्रत्यक्ष एंटीकोगुलैंट के साथ उपचार, अनुपचारित रक्त की तुलना में थक्का गठन और प्लेटलेट आसंजन दोनों को रोकता है। परफ्यूजन के पांच मिनट के बाद पल्मोनरी धमनी एंडोथेलियल सेल प्लेटलेट इंटरैक्शन का इम्यूनोफ्लोरेसेंट विश्लेषण, एंडोथेलियल सेल, सेल संपर्कों के रखरखाव का पता चलता है, जैसा कि वैस्कुलर एंडोथेलियल कैडेरिन स्टेनिंग द्वारा पुष्टि की गई है, यह दर्शाता है कि एंडोथेलियल अंतराल के बीच अंतर्निहित संभोग के बजाय एंडोथेलियल मॉडल परतों पर रक्त के थक्के बनते हैं।
फेफड़े की धमनी एंडोथेलियम की तुलना में मानव गर्भनाल नस एंडोथेलियल कोशिकाएं कम प्लेटलेट आसंजन और फाइब्रिन जमाव प्रदर्शित करती हैं। विशेष रूप से, क्रोनिक थ्रोम्बोलिक पल्मोनरी उच्च रक्तचाप रोगियों से रोगग्रस्त प्राथमिक फेफड़े की धमनी एंडोथेलियल कोशिकाएं, स्वस्थ कोशिकाओं की तुलना में प्लेटलेट आसंजन और अधिक फाइब्रिन जमाव प्रदर्शित करती हैं। एंडोथेलियम की थ्रोम्बोजेनिसिटी वैस्कुलर बेड की उत्पत्ति या जैविक पृष्ठभूमि के हिस्सों जैसे कई कारकों पर निर्भर करती है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके, संवहनी और रक्त घटकों में आंतरिक रोगों के साथ-साथ थ्रोम्बोसिस हेमेसिस के विभिन्न चरणों के दौरान एंटी जमावित चिकित्सा की प्रभावशीलता का परीक्षण किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल का उपयोग रक्त और थियो इंटरैक्शन को समझने के लिए किया जा सकता है, विभिन्न थ्रोम्बोलिक रोगों में, एंटीकोगुलेशन थेरेपी के लिए रोगी-विशिष्ट प्रतिक्रियाओं की भविष्यवाणी करने की अंतिम क्षमता के साथ।