Denne In Vitro Sykdom Modell, kan brukes til å studere samspillet mellom fullblod og pasient avledede celler, spesielt endotel, for å evaluere trombogenitet og effektiviteten av antikoagulantmidler. Dette er endotelceller kan brukes på ulike omstendigheter og kan endres ved å innføre skreddersydde mikrofluidics eller ved å justere blodstrømparametre. I tillegg kan denne modellen brukes til å studere trombedynamikk i inflammatoriske tilstander, eller for å vurdere effekten av antikoagulant og platehemmende terapi.
Til syvende og sist kan disse tilnærmingene brukes i en metode for personlig medisin. Etter å ha fått en kirurgisk menneskelig lungearterievevsprøve, belegge høy affinitetscellebinding 60 milliliter cellekulturrett med to milliliter med fem mikrogram per milliliter fiboronectin og inkubere parabolen ved 37 grader Celsius i minst 15 minutter. På slutten av inkubasjonen, bruk sterile tang i et laminært strømningskabinett under sterile forhold, for å overføre vevet til en petriskål av PBS.
Hvis vevet fortsatt er i en ring, kutt arterien åpen med saks, ta vare på ikke å berøre det innerste laget av fartøyet, da endotelet lett skades og fjernes. Etter å ha fjernet fibronectin, legg til fire milliliter med komplett endotelcellemedium til parabolen og bruk tang til å overføre vevsprøven til mediet, bruk en skalpell til å forsiktig skrape det indre laget av fartøyet inn i mediet, vær forsiktig for å unngå lipidakkumuleringer som observeres i karveggen. Etter at cellene er høstet, legg platen inn i cellekulturinkubatoren.
Hvis fibroblaster forurenser kulturen, bruk magnetisk affinitetscelleseparasjon for en CD144, i henhold til produsentens instruksjoner for å rense cellene. Vanligvis er kultur definert som ren, når strømningscytometri oppdager 10% eller færre forurensende celler. Når det tilstrekkelige antallet endotelceller er oppnådd for eksperimentell bruk, kan de primære endotelcellene karakteriseres for tilstedeværelse av endotelcellespesifikke markører og for fravær av glatte muskel- og epitelcellemarkører.
For strømningskammer forberedelse, kode en kanal av en seks brønnflyt lysbilde med 30 mikroliter på 0,1% gelatin og inkubere dette lysbildet i minst 15 minutter ved 37 grader Celsius. I tillegg til kommersielle strømningskamre kan skreddersydde strømningskamre med spesifikke dimensjoner brukes til å studere påvirkning av vaskulær geometri på koagulasjonsdynamikk. Mens lysbildet ruger, samle cellene fra en samtidig lungearterie endotelcellekultur med EDTA og trypsin og sediment som celler ved sentrifugering, re suspendere pellet i 600 mikroliter av komplett endotelcelle medium og kraftig, men forsiktig, legge til 100 mikroliter celler i hver kanal, legge til ytterligere 50 mikroliter av komplett endotelcelle medium til kanalen , for å gi tilstrekkelig medium for overnatting inkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid, endre mediet neste dag for å vaske bort de ubundne cellene.
Etter seks dager i kultur skal cellene ha dannet et stabilt sammenføyd monolag. På dag sju av lungearterie endotelcellekultur, få en venøs blodprøver fra personer som ikke får antikoagulasjonsbehandling i 109 mononatriumsitrat antikoagulantrør og overføre blodet til et 50 milliliter rør. Blod kan inneholde virus og andre smittsomme stoffer.
Derfor er det viktig å alltid bruke hansker og følge sikkerhetsveiledningen for arbeid med menneskelig materiale. Fluorescerende merket blodcellene med 1 til 10, 000 konsentrasjon av Calcein AM Red og 50 mikrogram per milliliter og tilsett Alexa 488 fibrinogen, og inkuber deretter blodet ved 37 grader Celsius i 15 minutter for å tillate fullstendig absorpsjon. 30 minutter før perfusjonen, behandle lungearterie endotelceller med 100 mikroliter av en mikromolar histamin i endotelcellemedium og 1% fostervin serum uten andre tilsetningsstoffer.
Og bruk en 20 milliliter sprøyte fylt med vaskebuffer for å skylle strømningssystemrørene, last en tredje til 20 milliliter sprøyte med to milliliter vaskebuffer og last sprøyten på en sprøytepumpe. Bruk en annen 20 milliliter sprøyte til å fylle strømningsrørene med hippier pluss buffer som inneholder 1% storfe serum albumin og bruke en albue form Laura kontakt for å forsiktig koble rørene til mikrolysbildet, koble utløpet av lysbildet til sprøyten, reparere fra mikroskopi ved å plassere cellen som inneholder lysbildet på scenen og montere oppsettet for eksperimentet , justere mikroskopet og angi parametrene for bildebehandling. Rekalsifisering av ettertrykkelig blod.
Og dette er en lykkelig medsponsor av koagulasjon, videre prøve å unngå dannelse av luftbobler fordi dette vil skade endotelcellelag og påvirke resultatene dine. Umiddelbart før perfusjonen, fortynne blodet to ganger med rekalsifiseringsbuffer og plasser innløpsrøret på mikrolyset i blodrøret, trykk start på sprøytepumpen. Så snart blodet begynner å strømme over endotelet, trykk start på mikroskopet for å skaffe bilder ved hjelp av de forhåndsvalgte aktive kanalene og regionen av interesseposisjoner, hvert 15.
På slutten av analysen, stopp opptaket og sprøytepumpen og rengjør riktig. Merking blodplater med Calcein AM Red og tillegg av Alexa 488 konjugert fibrinogen, tillater undersøkelse av trombedannelse ved blodplate vedheft og fiber og deponering. Under ikke-stimulerte forhold er det ingen binding av blodplater eller fibrin til endotelet.
Stimulering med histamin resulterer i en umiddelbar økning i blodplateadhesjon, som når et platå etter 2,5 minutter, på dette tidspunktet begynner blodplatene å skille ut autocrine faktorer som induserer en blodplateaggregasjon og fibrinogenspalting til fibrin, noe som resulterer i fiber og deponering på tre minutter og dannelsen av et stabilt aggregat med blodplatene etter fire minutter. Behandling med et direkte antikoagulantmiddel, hemmer både koagulasjonsdannelse og blodplateadhesjon sammenlignet med ubehandlet blod. Immunofluorescerende analyse av lungearterie endotelcelle blodplateinteraksjoner etter fem minutter med perfusjon, avslører vedlikehold av endotelcellen, cellekontakter, som bekreftet av vaskulær endotelkaderinfarging, noe som indikerer at blodproppene dannes på endotelmodelllag i stedet for på den underliggende matrisen mellom endotelhull.
humane navlestrengendeotelceller viser mindre blodplateadhesjon og fibrindeponering sammenlignet med lungearterie endotel. Spesielt, syke primære lungearterie endotelceller fra kronisk tromboembolisk pulmonal hypertensjon pasienter, viser en økt blodplate vedheft og mer fibrin deponering sammenlignet med friske celler. Trombogenitet av endotelet er avhengig av flere faktorer som opprinnelsen til vaskulær seng eller deler av biologisk bakgrunn.
Ved hjelp av denne protokollen kan iboende dysfunksjoner i vaskulære og blodkomponenter, samt effektiviteten av antikoagulert terapi testes i ulike faser av trombose hemostase. Denne protokollen kan brukes til å forstå blod- og Theo-interaksjoner, i ulike tromboemboliske sykdommer med det ultimate potensialet til å forutsi pasientspesifikke responser på antikoagulasjonsbehandling.
