Denna In Vitro Sjukdomsmodell, kan användas för att studera samspelet mellan helblod och patienten härledda celler, specifikt endoteliala, att utvärdera trombogenicitet och effektiviteten av antikoagulantia medel. Detta är endotelceller kan användas på olika omständigheter och kan modifieras genom att införa skräddarsydda mikrofluidik eller genom att justera blodflödesparametrar. Dessutom kan denna modell användas för att studera trombdynamik i inflammatoriska tillstånd, eller för att bedöma effekterna av antikoagulantia och antiplateletterapi.
I slutändan kan dessa metoder användas i en metod för personlig medicin. Efter att ha erhållit en kirurgisk mänskliga pulmonell gatan vävnad prov, coat hög-affinitet cell bindande 60 milliliter cellodling skålen med två milliliter på fem mikrogram per milliliter fiboronectin och inkubera skålen på 37 grader Celsius i minst 15 minuter. I slutet av inkubationen, använd sterila tlyktor i ett laminär flödesskåp under sterila förhållanden, för att överföra vävnaden till en Petriskål av PBS.
Om vävnaden är fortfarande i en ring, skär artären öppen med sax, var noga med att inte röra det innersta lagret av kärlet, eftersom endotel lätt skadas och tas bort. Efter avlägsnande av fibronectin, tillsätt fyra milliliter av komplett endotelcellsmedium till skålen och använda forceps för att överföra vävnadsprovet i mediet, använd en skalpell för att försiktigt skrapa det inre lagret av kärlet i mediet, var försiktig för att undvika eventuella lipidansamlingar som observeras i kärlväggen. Efter att cellerna har skördats, placera plattan i cellodlingens inkubator.
Om fibroblaster förorenar kulturen, använd magnetisk affinitet cellseparation för en CD144, enligt tillverkarens instruktioner för att rena cellerna. Generellt definieras kultur som ren, när flödescytometri detekterar 10%eller färre förorenande celler. När det tillräckliga antalet endotelceller har erhållits för experimentell användning, kan de primära endotelcellerna karakteriseras för närvaron av endotelcellsspecifika markörer och för frånvaron av släta muskel- och epitelcellmarkörer.
För beredning av flödeskammare, kod en kanal av en sex brunnsflödessglas med 30 mikroliter på 0,1%gelatin och inkubera denna bild i minst 15 minuter vid 37 grader Celsius. Förutom kommersiella flödeskammare kan skräddarsydda flödeskammare med specifika dimensioner användas för att studera kärlgeometrins påverkan på proppdynamiken. Medan bilden inkuberar, samla cellerna från en konfluent pulmonell artär endotelcellskultur med EDTA och trypsin och sediment som celler genom centrifugeringen, åter avbryta pelleten i 600 mikroliter av komplett endotelcell medium och kraftfullt men försiktigt, tillsätt 100 mikroliter celler i varje kanal, lägga till ytterligare 50 mikroliter av komplett endotelcell medium till kanalen , för att ge tillräckligt medium för övernattning inkubation vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid, ändra mediet nästa dag för att tvätta bort de obundna cellerna.
Efter sex dagar i kultur, cellerna borde ha bildat en stabil confluent monolayer. På dag sju av pulmonell gatan endotel cell kultur, förvärva en venös blodprov från försökspersoner som inte får antikoagulation behandling i 109 mononatriumcitrat antikoagulantia rör och överföra blodet till en 50 milliliter rör. Blod kan innehålla virus och andra smittämnen.
Därför är det viktigt att alltid bära handskar och att följa säkerhetsvägledningen för arbete med mänskligt material. Fluorescerande märkt blodkropparna med 1 till 10, 000 koncentration av Calcein AM Röd och 50 mikrogram per milliliter och tillsätt Alexa 488 fibrinogen, sedan inkubera blodet vid 37 grader Celsius i 15 minuter för att möjliggöra fullständig absorption. 30 minuter före perfusionen, behandla lungartärens endotelceller med 100 mikroliter av en mikromolekylär histamin i endotelcellsmedium och 1%fetalt bovint serum utan några andra tillsatser.
Och använd en 20 milliliter spruta fylld med tvättbuffert för att skölja flödessystemets rör, ladda en tredje till 20 milliliter spruta med två milliliter tvättbuffert och ladda sprutan på en sprutpump. Använd en andra 20 milliliter spruta för att fylla flödesrören med hippies plus buffert som innehåller 1%bovin serumalbumin och använd en armbåge form Laura-kontakt för att noggrant ansluta rören till mikro slide, ansluta utloppet av bilden till sprutan, reparation från mikroskopi genom att placera cellen som innehåller glida på scenen och montera inställningen för experimentet , justera mikroskopet och ställa in parametrarna för avbildning. Omkalkning av eftertryckligt blod.
Och detta är en glad co-sponsor av koagulering, dessutom försöka undvika bildandet av luftbubblor eftersom detta kommer att skada endotel cellskikt och påverka dina resultat. Omedelbart före perfusionen, späd blodet vid två gånger med omberäkningsbuffert och placera inloppsröret för mikroglaset i blodstuben, tryck på start på sprutpumpen. Så snart blodet börjar flöda över endotelet, tryck på start på mikroskopet för att förvärva bilder med hjälp av förvalda aktiva kanaler och region av intressepositioner, var 15 sekunder i fem minuter.
I slutet av analysen, stoppa inspelningen och sprutan pumpen och städa upp ordentligt. Märkning trombocyter med Calcein AM Röd och tillsats av Alexa 488 konjugerad fibrinogen, möjliggör utredning av trombbildning genom trombocytadhesion och fiber och nedfall. Under icke stimulerade förhållanden finns det ingen bindning av trombocyter eller fibrin till endotelet.
Stimulering med histamin resulterar i en omedelbar ökning av trombocytadhesion, som når en platå efter 2,5 minuter, vid denna tidpunkt, börjar trombocyterna att utsöndra autocrine faktorer som inducerar en trombocytaggregation och fibrinogen klyvning till fibrin, vilket resulterar i fiber och nedfall vid tre minuter och bildandet av en stabil aggregat med trombocyterna efter fyra minuter. Behandling med ett direkt blodförtunnande läkemedel, hämmar både proppbildning och trombocytadhesion jämfört med obehandlat blod. Immunofluorescent analys av pulmonell gatan endotel cell trombocyt interaktioner efter fem minuter av perfusion, avslöjar underhåll av endotelcellen, cellkontakter, vilket bekräftas av Vaskulär endotel cadherin färgning, som anger att blodproppar form på endotel modell lager snarare än på den underliggande matrisen mellan endotel gap.
mänskliga umbilical vein endotel celler visar mindre trombocyt vidhäftning och fibrin nedfall jämfört med pulmonell gatan endotel. Noterbart, sjuka primära pulmonell gatan endotelceller från kronisk tromboembolic pulmonell hypertoni patienter, uppvisar en ökad trombocyt adhesion och mer fibrin nedfall jämfört med friska celler. Trombogenicitet av endotelet är beroende av flera faktorer som ursprunget till den kärlbädden eller de delar av biologisk bakgrund.
Med hjälp av detta protokoll kan inneboende dysfunktioner i kärl- och blodkomponenter, samt effektiviteten av antikoagulerad terapi testas under olika faser av trombos hemostas. Detta protokoll kan användas för att förstå blod och Theo interaktioner, i olika tromboembolic sjukdomar med den ultimata potentialen att förutsäga patient-specifika svar på antikoagulation terapi.
