Bu In Vitro Hastalık Modeli, trombojenite ve antikoagülan ajanların etkinliğini değerlendirmek için, özellikle endotel, tam kan ve hasta türetilmiş hücrelerin etkileşimini incelemek için kullanılabilir. Bu endotel hücreleri çeşitli durumlarda kullanılabilir ve özel yapılmış mikroakışkanlar tanıtarak veya kan akımı parametreleri ayarlayarak değiştirilebilir. Buna ek olarak, bu model inflamatuar koşullarda trombüs dinamikleri çalışma için kullanılabilir, ya da antikoagülan ve antiplatelet tedavisinin etkilerini değerlendirmek için.
Sonuçta, bu yaklaşımlar kişiselleştirilmiş tıp yöntemi kullanılabilir. Cerrahi bir insan pulmoner arter doku örneği aldıktan sonra, kat yüksek afinite hücre bağlama 60 mililitre hücre kültür çanak mililitre fiboronektin başına beş mikrogram iki mililitre ve en az 15 dakika boyunca 37 derece santigrat de çanak kuluçka. Kuluçka sonunda, steril koşullar altında bir laminar akış kabininde steril çalgılar kullanın, PBS bir Petri kabına doku aktarmak için.
Doku hala bir halka ise, makas ile açık arter kesmek, damarın en iç tabakası dokunmamaya dikkat, endotel kolayca zarar görmüş ve kaldırılır gibi. Fibronektin çıkardıktan sonra, çanak tam endotel hücreli orta dört mililitre ekleyin ve ortama doku örneği aktarmak için forseps kullanın, dikkatle orta içine geminin iç tabakası kazımak için bir neşter kullanın, damar duvarında gözlenen herhangi bir lipid birikimini önlemek için özen. Hücreler hasat edildikten sonra, hücre kültürü kuluçka içine plaka yerleştirin.
Fibroblastlar kültürü kirletecekse, üreticinin talimatlarına göre hücreleri arındırmak için bir CD144 için manyetik afinite hücre ayrımı kullanın. Genellikle, kültür saf olarak tanımlanır, akış sitometri sitometri% 10 veya daha az kirletici hücreleri algılar. Deneysel kullanım için yeterli sayıda endotel hücresi elde edildiğinde, primer endotel hücreleri endotel hücresispesifik belirteçlerinin varlığı ve düz kas ve epitel hücre belirteçlerinin yokluğu için karakterize edilebilir.
Akış odası hazırlama için, %0,1 jelatin 30 mikrolitre ile altı kuyu akış slayt kod bir kanal ve 37 santigrat derece en az 15 dakika bu slayt kuluçka. Ticari akış odalarına ek olarak, vasküler geometrinin pıhtı dinamiği üzerindeki etkisini incelemek için özel boyutlara sahip özel akış odaları da kullanılabilir. Slayt kuluçka iken, EDTA ve tripsin ve santrifüj ile hücreleri sediment ile bir konfluent pulmoner arter endotel hücre kültüründen hücreleri toplamak, tam endotel hücre orta ve kuvvetle ama yavaşça 600 mikrolitre pelet askıya, her kanala hücre 100 mikrolitre ekleyin, tam bir 50 mikrolitre ek bir ek ekleyebilirsiniz tam endotel hücre liyal hücre kanalına tam bir 50 mikrolitre ekleyin , 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksit gece kuluçka için yeterli orta sağlamak için, bağlı olmayan hücreleri yıkamak için ertesi gün orta değiştirin.
Kültürde altı gün sonra, hücreler istikrarlı bir konfluent monolayer oluşmuş olmalıdır. Pulmoner arter endotel hücre kültürünün yedinci gününde, 109 monosodyum sitrat antikoagülan tüpler içine antikoagülasyon tedavisi almayan deneklerden venöz kan örnekleri almak ve 50 mililitrelik tüp içine kan transferi. Kan virüsler ve diğer enfeksiyöz ajanlar içerebilir.
Bu nedenle her zaman eldiven giymek ve insan materyali ile çalışmak için güvenlik rehberliğitakip etmek önemlidir. Floresan 1 ila 10, Calcein Kırmızı ve mililitre başına 50 mikrogram konsantrasyonu ile kan hücreleri etiketli ve Alexa 488 fibrinojen eklemek, sonra tam emilimi sağlamak için 15 dakika boyunca 37 derece santigrat kan kuluçka. Perfüzyondan 30 dakika önce pulmoner arter endotel hücrelerini endotel hücreli ortamda bir mikromolar histaminin 100 mikrolitresi ve %1'i fetal sığır serumu ile tedavi edin.
Ve akış sistemi tüplerini durulamak için yıkama tamponuyla dolu 20 mililitrelik bir şırınga kullanın, iki mililitre yıkama tamponuyla üçüncü bir ila 20 mililitrelik şırınga yükleyin ve şırıngayı bir şırınga pompasına yükleyin. İkinci bir 20 mililitreşlik şırınga hippiler artı tampon% 1 sığır serum albumin içeren ve dikkatle mikro slayt tüpleri bağlamak için bir dirsek şekli Laura konektörü kullanmak için ikinci bir 20 mililitreşşöf kullanın, şırınga için slayt çıkış bağlamak, sahneye slayt içeren hücre yerleştirerek mikroskopi onarım ve deney için kurulum montaj , mikroskobu ayarlayın ve görüntüleme parametrelerini ayarlayın. Ampirik kanın yeniden kalsifikasyonu.
Ve bu pıhtılaşma mutlu bir co-sponsoru, ayrıca bu endotel hücre tabakası zarar ve sonuçları etkilemek çünkü hava kabarcıkları oluşumunu önlemek için deneyin. Perfüzyonhemen önce, rekalsifikasyon tampon ile iki kez kan seyreltmek ve kan tüpü içine mikro slayt giriş tüpü yerleştirin, şırınga pompası basın başlatın. Kan endotel üzerinden akmaya başlar başlamaz, önceden seçilmiş aktif kanalları ve ilgi alanları nın konumlarını kullanarak görüntüleri elde etmek için mikroskoba beş dakika boyunca her 15 saniyede bir başlayın.
Analizin sonunda, kaydı ve şırınga pompasını durdurun ve düzgün bir şekilde temizleyin. Calcein Red ile trombosit etiketleme ve Alexa 488 konjuge fibrinojen eklenmesi, trombosit yapışma ve lif ve birikimi ile trombüs oluşumunun araştırılmasına olanak sağlar. Uyarılmayan koşullarda trombosit veya fibrin endotel için herhangi bir bağlama yoktur.
Histamin ile stimülasyon, trombosit adezyonunda ani bir artışa neden olur, bu noktada 2,5 dakika sonra bir platoya ulaşır, trombositler fibrin trombosit agregasyonu ve fibrinojen bölünmesine neden olan otokrin faktörleri salgılamaya başlar, üç dakikada lif ve birikme ile sonuçlanır ve dört dakika sonra trombositlerle stabil bir agrega oluşumu na neden olur. Doğrudan antikoagülan ile tedavi, tedavi edilmeyen kana göre hem pıhtı oluşumunu hem de trombosit yapışmasını inhibe eder. Pulmoner arter endotel hücre trombosit etkileşimlerinin beş dakikalık perfüzyondan sonra immünfloresan analizi, endotel hücresinin bakımını ortaya çıkarır, hücre kontakları, vasküler endotel kadherin boyama ile doğrulanırsa, endotelsel model tabakalarında kan pıhtılaşmasının endotel seliyal boşluklar arasındaki alt matris yerine oluştuğunu gösterir.
insan umbilikal ven endotel hücreleri pulmoner arter endotel ile karşılaştırıldığında daha az trombosit adezyonu ve fibrin birikimi göstermektedir. Özellikle kronik tromboembolik pulmoner hipertansiyon hastalarından hastalıklı primer pulmoner arter endotel hücreleri, sağlıklı hücrelere göre artmış trombosit adezyonu ve daha fazla fibrin birikimi sergilemektedir. Endotel trombojenitesi vasküler yatağın kökeni veya biyolojik arka plan parçaları gibi birden fazla faktöre bağlıdır.
Bu protokol kullanılarak, vasküler ve kan bileşenlerinde içsel disfonksiyonlar, yanı sıra anti koagüle tedavinin etkinliği tromboz hemostazFarklı aşamalarında test edilebilir. Bu protokol, antikoagülasyon tedavisine hastaya özgü tepkileri tahmin etme potansiyeline sahip çeşitli tromboembolik hastalıklarda kan ve Teo etkileşimlerini anlamak için kullanılabilir.
