Name: discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres at JoVE.com

يشكر المؤلفون المختبر الأساسي لمختبرات البيولوجيا الإشعاعية التابع لمعهد البحوث الإشعاعية، مستشفى تشانغ جونج التذكاري، على الدعم التقني. وقد دعمت هذه الدراسة من المنح من مستشفى تشانغ جونج التذكاري (CMRPD1J0321), مستشفى تشنغ هسين العام (هرمون النمو 106-06), ومستشفى ماكاي التذكاري (MMH-CT-10605 وMMH-106-61). ولم يكن لهيئات التمويل أي تأثير في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها وتفسيرها أو في كتابة المخطوطة.

1. خلية ثقافة وأورام تشكيل
<ol><li>ثقافة HT29 الخلايا في طبق 10 سم تحتوي على متوسط النسر Dulbecco المعدلة (DMEM) مع 10٪ مصل الأبقار الجنين (FBS) و 1٪ البنسلين-الستربتوميسين المضادات الحيوية (P/ S).</li>
	<li>تنمو الخلايا في حاضنة في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO2 والرطوبة 95٪ في ظل الظروف المتعفنة، حتى تصل إلى 80٪ التقاء....

<ol>
	<li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+colorectal+cancer:+incidence,+mortality,+survival,+and+risk+factors.">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegl&#261;d Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li><li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+risk+factors+of+colorectal+cancer+in+Asia.">Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia.</a> Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+expression+of+basic+transcription+factor+3+predicts+poor+survival+of+colorectal+cancer+patients:+possible+mechanisms+involved.">Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (7), 509 (2019).</li><li>Slattery, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients.">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li><li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERBB+network:+at+last,+cancer+therapy+meets+systems+biology.">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells.">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).</li><li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective.">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer,+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis:+a+meta-analysis.">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li><li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma:+Clinicopathological+significance.">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li><li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cell-targeted+treatment:+elimination+or+differentiation.">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li><li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture.">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li><li>Dallas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).</li><li>Chang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+induces+G9a+to+exacerbate+HER3+expression+for+the+survival+of+epidermal+growth+factor+receptor-tyrosine+kinase+inhibitors+in+lung+cancers.">STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers.</a> BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).</li><li>Catalano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+stem+cells+and+cell+death.">Colorectal cancer stem cells and cell death.</a> Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).</li><li>Piggott, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+apoptosis+inhibitor+c-FLIP+selectively+eliminates+breast+cancer+stem+cell+activity+in+response+to+the+anti-cancer+agent,+TRAIL.">Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL.</a> Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).</li><li>Chung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+SHP-1+agonists,+SC-43+and+SC-78,+are+more+potent+than+regorafenib+in+suppressing+the+in+vitro+stemness+of+human+colorectal+cancer+cells.">Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells.</a> Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers:+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening.">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).</li><li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer.">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li><li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell.">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li><li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133,+CD44,+CD24:+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells.">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).</li><li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetworkAnalyst+for+statistical,+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data.">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li><li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy.">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).</li><li>Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+as+a+Tool+to+Study+the+Tumor+Microenvironment.">RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).</li><li>Kanehisa, M., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG+Mapper+for+inferring+cellular+functions+from+protein+sequences.">KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences.</a> Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li><li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gene+Ontology+Resource:+20+years+and+still+GOing+strong.">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+in+2013:+modeling+the+evolution+of+gene+function,+and+other+gene+attributes,+in+the+context+of+phylogenetic+trees.">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).</li><li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma.">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li><li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetworkAnalyst+3.0:+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis.">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers.">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li></ol>

في هذه الدراسة، تم استخدام أورام مثل السرطان مثل السرطان المستزرع كنموذج في تحليل بيانات RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة. لنموذج المرض، تم استخدام أورام مشتقة من HT29. لأن الأورام لديها مقاومة للأدوية ضد علاجات الورم، يمكن استخدام النموذج المنشأة للتحقيق في الآليات التفصيلية للمقاومة ?...

سرطان القولون والمستقيم (CRC) هو السبب الرئيسي للوفاة مع ارتفاع معدل انتشار ووفيات في جميع أنحاء العالم1,2. بسبب الطفرات الجينية والتضخيم، تنمو الخلايا السرطانية دون السيطرة التكاثرية، مما يساهم في بقاء الخلايا3، المضادة لتخثر الدم4، والسرطان stemness5،6،7. داخل نسيج الورم، يسمح عدم تجانس الورم للخلايا السرطانية بالتكيف والبقاء على قيد الحياة أثناء العلاجات العلاجية8. الخلايا الجذعية السرطانية (CSCs), مع معدل أعلى من التجديد الذاتي و تعدد القدرات من أنواع السرطان التفاضلية, هي المسؤولة بشكل رئيسي عن تكرار الورم9,,10 و CRC11النقيلي . CSCs الحاضر أكثر مقاومة للأدوية12,13,,14 و خصائص مضادة لتخثر الدم15,16, وبالتالي نجاة الأورام العلاج الكيميائي.
هنا، من أجل التحقيق في الآلية المحتملة ل stemness في الخلايا الجذعية CRC مختارة، تم تنفيذ RNAseq لفحص الجينات التي أعرب عنها بشكل تفاضلي في spheroids الورم. الخلايا السرطانية يمكن أن تشكل spheroids (وتسمى أيضا أورامسفيرس) عندما تنمو في ظروف الالتزام المنخفضة وحفزت عوامل النمو المضافة إلى المتوسطة مثقف, بما في ذلك EGF, bFGF, HGF, وIL6. ولذلك، اخترنا CRC HT29 الخلايا السرطانية التي تقاوم العلاج الكيميائي مع زيادة في STAT3 الفوسفورية عندما تعامل مع oxaliplatin وirinotecon17. بالإضافة إلى ذلك، أعرب HT29 علامات الصلابة أعلى عندما مثقف في ظروف الثقافة الموصوفة. أعرب نموذج CSC المستمدة من HT29 كميات أعلى من تكرار الغنية بالليسين التي تحتوي على مستقبلات G-protein-coupled 5 (LGR5)18, علامة محددة من الخلايا الجذعية CRC19,20. وعلاوة على ذلك، CD133، تعتبر علامة حيوية عامة للخلايا الجذعية السرطانية، وأعرب أيضا عن ذلك بشدة في خط الخلية HT2921. الغرض من هذا البروتوكول هو اكتشاف مجموعات من جينات السائق في الأورام السرطانية المنشأة الشبيهة بـ stem استناداً إلى مجموعات البيانات المعلوماتية الحيوية بدلاً من التحقيق في أونكوجينيس الفردية22. وهو يحقق في الآليات الجزيئية المحتملة من خلال تحليل RNAseq متبوعاً بتحليلات المعلوماتية الحيوية المتاحة.
الجيل التالي هو عالية الإنتاجية ، متاحة بسهولة ، وموثوق بها الحمض النووي طريقة التسلسل على أساس المساعدة الحسابية ، وتستخدم لفرز شامل الجينات السائق لتوجيه علاجات الورم23. وتستخدم أيضا التكنولوجيا للكشف عن التعبير الجيني من النسخ العكسي لعينة معزولة RNA24. ومع ذلك، عند الفحص مع RNAseq، قد لا يكون للجينات الأكثر أهمية لاستهداف مع العلاج أعلى الفرق التعبير بين العينات التجريبية والسيطرة. لذلك ، تم تطوير بعض المعلوماتية الحيوية لتصنيف وتحديد الجينات على أساس مجموعات البيانات الحالية مثل KEGG25، GO26،27، أو PANTHER28، بما في ذلك تحليل مسار الإبداع (IPA)29 و NetworkAnalyst30. هذا البروتوكول يظهر التكامل بين RNAseq و NetworkAnalyst لاكتشاف مجموعة من الجينات بسرعة في spheroids HT29 المشتقة من HT29 مقارنة مع خلايا HT29 الأبوية. كما يقترح تطبيق هذه الطريقة على نماذج الأمراض الأخرى لاكتشاف الاختلافات في الجينات الهامة.
بالمقارنة مع التحقيق في التعبير الجيني الفردي ، فإن تقنية عالية الإنتاجية توفر مزايا للعثور على جينات السائق المحتملة بسهولة للطب الدقيق للورم. مع مجموعات البيانات المفيدة مثل KEGG أو GO أو PANTHER ، يمكن تحديد جينات محددة استنادًا إلى نماذج المرض ، أو مسارات الإشارة ، أو وظائف محددة ، وهذا يسمح بالتركيز بسرعة على جينات محددة ومهمة ، مما يوفر الوقت وتكاليف البحث. ويستخدم تطبيق مماثل في الدراسات السابقة14،18،31. على وجه الخصوص، الورم هو أكثر تعقيدا لأن أنواع مختلفة من الأورام تعبر عن الجينات التمييزية ومسارات البقاء على قيد الحياة والانتشار. لذلك، يمكن لهذا البروتوكول التقاط الجينات التي تميز أنواع الأورام المختلفة في ظل ظروف مختلفة. هناك إمكانية لإيجاد استراتيجيات فعالة لمكافحة السرطان من خلال فهم آلية التعبير الجيني المحدد.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>iRiS Digital Cell Imaging System</td>
			<td>Logos Biosystems, Inc</td>
			<td>I10999</td>
			<td>for observing the formation of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LGR5-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>373803</td>
			<td>LGR5 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD133-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>372803</td>
			<td>CD133 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z00333</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03116</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03229</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL6</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03034</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183025</td>
			<td>isolate total RNA for RNAseq analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseq performance</td>
			<td>Biotools, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td>RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NetworkAnalyst</td>
			<td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>http://www.networkanalyst.ca/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>a statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres

تلعب الخلايا الجذعية السرطانية دورًا حيويًا ضد العلاجات السريرية، مما يساهم في انتكاس الورم. هناك العديد من الأونكوجينات المشاركة في ورمريجنيسيس وبدء خصائص الجذعية السرطان. وبما أن التعبير الجيني في تكوين أورام الخلايا القولونية المشتقة من سرطان القولون والمستقيم غير واضح، فإن اكتشاف الآليات التي تعمل على جين واحد في كل مرة يستغرق وقتاً. توضح هذه الدراسة طريقة لاكتشاف جينات السائق المشاركة في بقاء الخلايا الجذعية الشبيهة بسرطان القولون والمستقيم في المختبر. تم اختيار الخلايا السرطانية HT29 القولون والمستقيم التي تعبر عن LGR5 عندما مثقف كما spheroids ومرافقة زيادة علامات الجذعية CD133 واستخدامها في هذه الدراسة. يتم استخدام البروتوكول المقدم لتنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرط في تشكيل HT29 مستقيم مشتقة من الأورام الجذعية مثل. ويمكن للمنهجية أن تفحص تكتشف بسرعة جينات السائق المحتمل في نماذج أمراض أخرى.

لإنشاء نموذج للتحقيق في آلية في الخلايا الجذعية السرطانية، استخدمت خلايا HT29 القولون والمستقيم لثقافة الأورام السرطانية مثل الجذعية في المختبر في لوحة منخفضة المرفق تحتوي على B27، EGF، bFGF، HGF، وIL6. تشكلت أورام الفيرات > 100 ميكرومتر في القطر في 7 أيام (الشكل 1A). تم تبسينيف الفرُق ?...

Watch this Scientific Journal Video about Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres at JoVE.com

Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

هنا هو بروتوكول لاكتشاف جينات السائق المفرطة في التعبير عن الحفاظ على الخلايا الجذعية السرطان المنشأة المستمدة من خلايا HT29 القولون والمستقيم. تم تنفيذ RNAseq مع المعلوماتية الحيوية المتاحة للتحقيق وفحص شبكات التعبير الجيني لتوضيح آلية محتملة تشارك في بقاء الخلايا السرطانية المستهدفة.

اكتشاف جينات السائق في الخلايا القولونية HT29 المشتقة من السرطان الجذعية مثل الأورام

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

استخدم بروتوكولنا أدوات الحمض النووي الريبي النووي -RNA-Seq والكائنات الحيوية للكشف بسرعة عن جينات السائق المفرطة التي تساهم في تكوين أورام القولون والمستقيم الشبيهة بالسيقان. يستخدم هذا البروتوكول لفحص الجينات المعبّر عنها بشكل تفاضلي ومسارات الإشارة للتحقيق في آلية جزيئية لرقي السرطان في سرطان القولون والمستقيم الانتقائي. في اليوم السابع من الثقافة، استخدم مجهرًا مقلوبًا مع نظام تصوير الخلايا الرقمية لمراقبة وقياس قطر أورام الفير.عندما تصل إلى أورامفيرز أكبر من 100 ميكرومتر قطر, علاج الثقافة مع 0.25٪ التربسين. بعد خمس دقائق في 37 درجة مئوية، تحييد التربسين مع ضعف حجم متوسط النمو وعد الخلايا باستخدام مقياس الهيموسيت. جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.و resuspend بيليه في خمس مرات 10 إلى الخلايا الأربع لكل 100 ميكرولترات من التركيز المتوسط. إضافة اثنين من microliters من الأجسام المضادة الأولية من الفائدة لكل أنبوب واحتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة و 200 الثورات في الدقيقة الواحدة. في نهاية الحضانة، وغسل كل أنبوب مع 900 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني وتحليل الخلايا للتعبير عن البروتين من الفائدة عن طريق تدفق cytometry وفقا للبروتوكولات القياسية.لعزل RNA بعد جمع التربسين كما هو موضح للتو، resuspend الخلايا في مرتين 10 إلى الخلايا الخامسة لكل 50 ميكرولترات من تركيز PBS وlyse كل عينة مع 200 ميكرولترات من العازلة تحلل تكملها اثنين من microliters من بيتا mercaptoethanol لكل أنبوب. بعد دوامة وجيزة واحتضان خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، وجمع lysates عن طريق الطرد المركزي وإضافة 200 ميكرولترات من 70٪ الإيثانول إلى كل أنبوب. نقل العينات إلى أعمدة سريعة وإزالة المذيبات عن طريق الطرد المركزي.اغسل العينات بـ 400 ميكرولترات من محلول الغسيل واحد و600 ميكرولترات من محلول الغسيل اثنين لإزالة أي غير RNA تمامًا عن طريق الطرد المركزي ، يليه طرد مركزي لمدة دقيقتين إضافيتين في ظل نفس شروط الطرد المركزي لإزالة أي إيثانول متبقي. ثم إعادة تعليق الكريات في 50 ميكرولترات من الماء المقطر لكل أنبوب والطرد المركزي العينة لمدة دقيقة واحدة قبل جمع الحمض النووي الريبي التي تحتوي على عظمى. للتحقيق في التعبير الجيني التفاضلي بين خلايا أورام في الغلاف الجوي مقارنة بالخلايا السرطانية الأبوية بعد تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي.حدد الجينات مع أكبر من واحد إلى ناقص واحد log2 أضعاف التغيير مع عدد القراءة أكبر من 100 في أوراموسفير ومجموعات الوالدين. واستخدم الأوامر كما هو مبين. للحصول على مؤامرة بركان من البيانات لتحديد التعبير الجيني التفاضلي.لاختيار جينات محرك الأقراص في محلل الشبكة، حدد إدخال الجينات المفردة ونسخ ولصق الجينات المُختارة التي تم التعبير عنها بشكل مفرط مع تحديد الإنسان ككائن حي ورمز جين رسمي كنوع المعرّف. انقر فوق تحميل والمضي قدما. لإدراج وتحليل البيانات باستخدام البروتين البروتين التفاعل، بعد التفاعل البروتين الجيني البروتين، واستخدام قاعدة بيانات التفاعل STRING مع درجة الثقة قطع من 900 لإظهار الجينات البذور.عبر ربط الجينات التي تم تحميلها. ويمكن اختيار الجينات البذور المرتبطة مع المزيد من الجينات الفردية كما الجينات السائق التي قد تشارك في الحفاظ على تشكيل أوراموسفير. حدد متابعة في تعيين نظرة عامة بيضاء في الخلفية وأطلس فرض في مقبض التخطيط.ثم حدد زوج قاعدة PANTHER لتحليل مجموعة جينات رفع التنظيم. أورام أفصال أكبر من 100 ميكرومتر في شكل قطرها في غضون سبعة أيام من الثقافة. تحليل تدفق cytometric يكشف عن زيادة في التعبير LGR5 و CD133 في HT29-اشتقاق الأورام مقارنة مع الخلايا HT29 الوالدين.بعد تسلسل الحمض النووي الريبي، الجينات مع أكبر من واحد log2 أضعاف التغيير في صعودا أو داونلوراس مع قيمة P أقل من 0.05 كما تحددها خريطة الحرارة يمكن رسمها لتمييز الجينات الهامة بين الأورام المشتقة من HT29 والخلايا HT29 الوالدين. في هذه التجربة التمثيلية، أدى تحليل الجينات المُرقَّبة التي يزيد عددها عن 11 ضعفًا إلى وجود 10 جينات بذرة، وربط الشبكات الجينية. أشار تحليل الزوج قاعدة بانثر أن اثنين من الجينات المرتبطة التنظيم السلبي لتخثر الدم.وعلاوة على ذلك، تم التحقق من صحة الجينات المختارة بالتالي بواسطة PCR الكمية التي تؤكد زيادة التعبير عنها في HT29-اشتقاق الأورام. اختيار الجينات التفاضلية هو أهم خطوة في الإجراءات. تذكر أن تستخدم log2 أضعاف تغيير أكبر من واحد مع إعادة فرز أكبر من 100 كمعايير.باستخدام هذا البروتوكول، يمكن إسقاط الجينات المختارة من أورام القولون والمستقيم أو التعبير عنها بشكل مفرط للكشف عن أدوارها المحتملة في تكوين أورامفير.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

المتقدم نموذج حيواني من القولون والمستقيم ورم خبيث في الكبد: تقنيات التصوير وخصائص النقيلي النسخ

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

نموذج الفأر المهندسة وراثيا لسرطان القولون والمستقيم المتفرقة

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

ابحث عن برنامج تشغيل مسارات اكتسبت مقاومة للعلاج المستهدفة: جيل سوبكلون المقاومة للأدوية وحساسية استعادة بواسطة خبط الجينات لأسفل

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

عزل الخلايا البطانية البشرية من القولون العادي وسرطان القولون والمستقيم-وضع بروتوكول تحسين

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

الكشف عن لوحة مخصصة MicroRNA المتداولة في المرضى الذين يعانون من سرطان القولون والمستقيم المنتشر

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

تقييم مخاطر الإصابة بسرطان القولون والمستقيم وانتشاره عن طريق الكشف عن سلامة الحمض النووي البراز

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

عزل خلايا شبيهه بالجذعية من ثقافات كروي ثلاثية الابعاد

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

تقييم موت الخلية باستخدام الخلايا الخالية من البروبيوتيك في الثقافات الكروية ثلاثية الأبعاد للخلايا السرطانية القولون والمستقيم

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

الثقافة المشتركة للخلايا الشبيهة بالورم الأرومي الدبقي على الخلايا العصبية المنقوشة لدراسة الهجرة والتفاعلات الخلوية

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...