Name: discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00
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Les auteurs remercient le Laboratoire de biologie des radiations de l’Institut de recherche radiologique de l’hôpital Chang Gung Memorial pour son soutien technique. Cette étude a été soutenue par des subventions de l’hôpital Chang Gung Memorial (CMRPD1J0321), de l’hôpital général Cheng Hsin (CHGH 106-06) et de l’hôpital Commémoratif Mackay (MMH-CT-10605 et MMH-106-61). Les organismes de financement n’ont eu aucune influence dans la conception de l’étude et de la collecte, de l’analyse et de l’interprétation des données ou dans la rédaction du manuscrit.

1. Culture cellulaire et formation de tumeursphères
<ol><li>Culture HT29 cellules dans un plat de 10 cm contenant le milieu aigle modifié de Dulbecco (DMEM) avec 10% sérum bovin foetal (FBS) et 1% antibiotique pénicilline-streptomycine (P/S).</li>
	<li>Cultiver les cellules dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 et 95% d’humidité dans des conditions aseptiques, jusqu’à ce qu’elles atteignent 80% de confluence.</li>
	<li>Trypsiniser les cellules HT29 avec 1 mL de trypsine de 0,25% pendant 5 m...

<ol>
	<li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+colorectal+cancer:+incidence,+mortality,+survival,+and+risk+factors.">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegl&#261;d Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li><li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. 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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma:+Clinicopathological+significance.">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li><li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers:+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening.">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).</li><li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer.">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li><li>Medema, J. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetworkAnalyst+for+statistical,+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data.">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li><li>Gagan, J., Van Allen, E. 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The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li><li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gene+Ontology+Resource:+20+years+and+still+GOing+strong.">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+in+2013:+modeling+the+evolution+of+gene+function,+and+other+gene+attributes,+in+the+context+of+phylogenetic+trees.">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).</li><li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers.">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li></ol>

Dans cette étude, des tumeurs de tige de cancer cultivées ont été employées comme modèle dans l’analyse des données de RNAseq avec la bioinformatique disponible. Pour un modèle de maladie, des tumeurs HT29-dérivées ont été employées. Parce que les tumeurs ont une résistance aux médicaments contre les thérapies tumorales, le modèle établi peut être utilisé pour étudier les mécanismes détaillés de la résistance en étudiant les différences dans l’expression des gènes. En outre, la technologie...

Le cancer colorectal (CRC) est l’une des principales causes de décès avec une prévalence et une mortalité élevées dans le monde1,2. En raison de mutations et d’amplifications génétiques, les cellules cancéreuses se développent sans contrôle prolifératif, ce qui contribue à la survie cellulaire3, anti-apoptose4, et la stemness cancer5,6,7. Dans un tissu tumoral, l’hétérogénéité tumorale permet aux cellules tumorales de s’adapter et de survivre pendant les traitements thérapeutiques8. Les cellules souches cancéreuses (CSC), avec un taux plus élevé d’auto-renouvellement et de pluripotence que les types de cancer différentiel, sont principalement responsables de la récurrence tumorale9,10 et métastatique CRC11. Les CSC présentent plus de résistance aux médicaments12,13,,14 et propriétés anti-apoptose15,16, survivant ainsi les chimiothérapies tumorales.
Ici, afin d’étudier le mécanisme potentiel de stemness dans les cellules souches sélectionnées CRC, RNAseq a été exécuté pour dépister les gènes exprimés différemment dans les sphéroïdes de tumeur. Les cellules cancéreuses peuvent former des sphéroïdes (également appelés tumeurs) lorsqu’elles sont cultivées dans des conditions de faible adhérence et stimulées par des facteurs de croissance ajoutés au milieu cultivé, y compris le FEM, le bFGF, le HGF et l’IL6. Par conséquent, nous avons sélectionné des cellules tumorales CRC HT29 qui résistent aux chimiothérapies avec une augmentation de STAT3 phosphorylé lorsqu’elles sont traitées avec de l’oxaliplatine et de l’irinotecon17. En outre, HT29 a exprimé des marqueurs de tige plus élevés lorsqu’ils sont cultivés dans les conditions de culture décrites. Le modèle CSC dérivé du HT29 exprimait des quantités plus élevées de récepteurs couplés à la protéine G riches en protéines de leucine 5 (LGR5)18, un marqueur spécifique des cellules souches CRC19,20. En outre, CD133, considéré comme un biomarqueur général pour les cellules souches cancéreuses, est également fortement exprimé dans la ligne cellulaire HT2921. Le but de ce protocole est de découvrir des groupes de gènes conducteurs dans les tumeurs de type tige du cancer établies basées sur des ensembles de données bioinformatiques plutôt que d’étudier les oncogènes individuels22. Il étudie les mécanismes moléculaires potentiels par l’analyse RNAseq suivie d’analyses bioinformatiques disponibles.
Le séquençage de prochaine génération est une méthode de séquençage de l’ADN à haut débit, facilement disponible et fiable basée sur l’aide informatique, utilisée pour examiner de manière exhaustive les gènes du conducteur pour guider les thérapies tumorales23. La technologie est également utilisée pour détecter l’expression des gènes à partir de la transcription inversée d’un échantillon d’ARN isolé24. Cependant, lors du dépistage avec RNAseq, les gènes les plus importants à cibler avec la thérapie peuvent ne pas avoir le différentiel d’expression le plus élevé entre les échantillons expérimentaux et témoins. Par conséquent, certaines bioinformatiques ont été développées pour classer et identifier les gènes basés sur des ensembles de données actuels tels que KEGG25, GO26,27, ou PANTHER28, y compris l’analyse des voies d’ingéniosité(IPA) 29 et NetworkAnalyst30. Ce protocole montre l’intégration de RNAseq et NetworkAnalyst pour découvrir rapidement un groupe de gènes dans les sphéroïdes sélectionnés dérivés de HT29 par rapport aux cellules parentales HT29. L’application de cette méthode à d’autres modèles de la maladie est également suggérée pour découvrir des différences dans les gènes importants.
Par rapport à l’étude de l’expression génique individuelle, une technique à haut débit offre des avantages pour trouver des gènes conducteurs potentiels facilement pour la médecine de précision tumorale. Avec des ensembles de données utiles tels que KEGG, GO, ou PANTHER, des gènes spécifiques peuvent être identifiés en fonction des modèles de la maladie, des voies de signalisation, ou des fonctions spécifiques, ce qui permet de se concentrer rapidement sur des gènes spécifiques et importants, ce qui permet d’économiser du temps et des coûts de recherche. Une application similaire est utilisée dans les études précédentes14,18,31. En particulier, une tumeur est plus compliquée parce que différents types de tumeurs expriment des gènes distinctifs et des voies de survie et de prolifération. Par conséquent, ce protocole peut détecter des gènes distinguant différents types de tumeurs dans des circonstances différentes. Il est possible de trouver des stratégies efficaces contre les cancers en comprenant le mécanisme de l’expression spécifique des gènes.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>iRiS Digital Cell Imaging System</td>
			<td>Logos Biosystems, Inc</td>
			<td>I10999</td>
			<td>for observing the formation of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LGR5-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>373803</td>
			<td>LGR5 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD133-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>372803</td>
			<td>CD133 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z00333</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03116</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03229</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL6</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03034</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183025</td>
			<td>isolate total RNA for RNAseq analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseq performance</td>
			<td>Biotools, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td>RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NetworkAnalyst</td>
			<td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>http://www.networkanalyst.ca/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>a statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres

Les cellules souches cancéreuses jouent un rôle vital contre les thérapies cliniques, contribuant à la rechute tumorale. Il y a beaucoup d’oncogènes impliqués dans la tumorigenèse et l’initiation des propriétés de tige de cancer. Puisque l’expression de gène dans la formation des tumeurs cancéreuses côloresphères cancéreuses côlores est peu claire, il faut du temps pour découvrir les mécanismes fonctionnant sur un gène à la fois. Cette étude démontre une méthode pour découvrir rapidement les gènes moteurs impliqués dans la survie des cellules souches du cancer colorectal in vitro. Les cellules cancéreuses colorectales HT29 qui expriment le LGR5 lorsqu’elles sont cultivées sous forme de sphéroïdes et accompagnent une augmentation des marqueurs de stemness CD133 ont été sélectionnées et utilisées dans cette étude. Le protocole présenté est utilisé pour effectuer RNAseq avec la bioinformatique disponible pour découvrir rapidement les gènes conducteurs surexprimés dans la formation de tumeurs côlores de tige HT29-dérivées. La méthodologie peut rapidement dépister et découvrir les gènes conducteurs potentiels dans d’autres modèles de maladies.

Pour établir le modèle d’étude du mécanisme dans les cellules souches cancéreuses, des cellules ht29 colorectales ont été employées pour la culture des tumeurs de tige-comme de cancer in vitro dans une plaque à faible attachement contenant B27, EGF, bFGF, HGF, et IL6. Les tumeursphères >100 μm de diamètre ont été formées en 7 jours (Figure 1A). Les tumeursphéres ont été trypsinized aux cellules simples et analysées utilisant la cytométrie de flux pour détecter l’expr...

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Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Présenté ici est un protocole pour découvrir les gènes conducteurs surexprimés maintenant les cellules souches du cancer établies dérivées des cellules HT29 colorectal. RNAseq avec la bioinformatique disponible a été exécutée pour étudier et examiner des réseaux d’expression de gène pour élucider un mécanisme potentiel impliqué dans la survie des cellules de tumeur ciblées.

Découverte des gènes conducteurs dans les tumeurs de tige de tige de cancer de HT29-dérivées

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Notre protocole a utilisé l’ARN-Seq et les outils bioinformatiques pour découvrir rapidement les gènes conducteurs surexprimés qui contribuent à la formation de tumeurs colorectales en forme de tige. Ce protocole est utilisé pour dépister un gène et des voies de signal exprimés différemment afin d’étudier un mécanisme moléculaire de la stemness du cancer dans un cancer colorectal sélectif. Le septième jour de la culture, utilisez un microscope inversé avec un système d’imagerie cellulaire numérique pour observer et mesurer le diamètre des tumorsphère.Lorsque les tumorspheres atteignent un diamètre supérieur à 100 micromètres, traiter la culture avec 0,25% trypsine. Après cinq minutes à 37 degrés Celsius, neutraliser la trypsine avec deux fois le volume du milieu de croissance et compter les cellules à l’aide d’un hémomètre. Recueillir les cellules par centrifugation.Et résuspendez la pastille à cinq fois 10 aux quatre cellules pour 100 microlitres de concentration moyenne. Ajouter deux microlitres de l’anticorps primaire d’intérêt à chaque tube et incuber les cellules pendant 30 minutes à température ambiante et 200 révolutions par minute. À la fin de l’incubation, laver chaque tube avec 900 microlitres de PBS et analyser les cellules pour l’expression de la protéine d’intérêt par cytométrie de flux selon les protocoles standard.Pour l’isolement d’ARN après la collection de trypsine comme juste démontré, résuspendez les cellules à deux fois 10 aux cinquièmes cellules par 50 microlitres de concentration de PBS et lyse chaque échantillon avec 200 microlitres de tampon de lyse complétés avec deux microlitres de bêta mercaptoethanol par tube. Après un bref vortex et une incubation de cinq minutes à température ambiante, recueillir les lysates par centrifugation et ajouter 200 microlitres de 70% d’éthanol à chaque tube. Transférer les échantillons dans des colonnes rapides et retirer le solvant par centrifugation.Lavez les échantillons avec 400 microlitres de solution de lavage une et 600 microlitres de solution de lavage deux pour éliminer complètement tout non-ARN par centrifugation, suivie d’une centrifugation supplémentaire de deux minutes dans les mêmes conditions de centrifugeuse pour éliminer tout éthanol résiduel. Puis resuspendez les granulés dans 50 microlitres d’eau distillée par tube et centrifugez l’échantillon pendant une minute avant de recueillir l’ARN contenant des supernatants. Étudier l’expression différentielle du gène entre les cellules tumorales par rapport aux cellules tumorales parentales après analyse du séquençage de l’ARN.Sélectionnez les gènes avec un changement de pli de plus d’un à moins un log2 avec des comptes de lecture supérieurs à 100 dans la tumorsphère et les groupes parentaux. Et utilisez les commandes comme indiqué. Pour obtenir une parcelle volcanique des données pour déterminer l’expression différentielle du gène.Pour la sélection des gènes d’entraînement chez l’analyste réseau, sélectionnez l’entrée unique du gène et copiez et coller les gènes surexprimés sélectionnés avec l’homme spécifié comme l’organisme et le symbole génétique officiel comme type d’identification. Cliquez sur Télécharger et procéder. Pour insérer et analyser les données à l’aide de l’interaction protéine-protéine, après interaction protéine-protéine génétique, utilisez la base de données interactome STRING avec un score de confiance coupé de 900 pour montrer les gènes des graines.Relier les gènes téléchargés. Les gènes de semence s’associant à des gènes plus individuels peuvent être sélectionnés comme gènes conducteurs qui peuvent être impliqués dans le maintien de la formation de la tumorsphère. Sélectionnez Procéder dans la vue d’ensemble de cartographie blanc dans l’arrière-plan et l’atlas de force dans le bouton Mise en page.Sélectionnez ensuite la paire de base PANTHER pour analyser le groupe génétique d’upregulation. Tumorspheres de plus de 100 micromètres de diamètre se forment dans les sept jours de la culture. L’analyse cytométrique de flux indique une augmentation de l’expression de LGR5 et de CD133 dans les tumeurs HT29-dérivées comparées aux cellules parentales de HT29.Après séquençage de l’ARN, les gènes ayant un changement plus important d’un pli log2 dans leur réglementation à la hausse ou à la baisse avec une valeur P inférieure à 0,05 déterminée par la carte thermique peuvent être tracés pour distinguer les gènes significatifs entre les tumeurs dérivées de HT29 et les cellules parentales HT29. Dans cette expérience représentative, l’analyse des gènes upregulated avec plus d’un pli log2 a abouti à 10 gènes de semences, reliant les réseaux génétiques. L’analyse de paire de base panther a indiqué que deux gènes ont été associés à la régulation négative de l’apoptose.En outre, les gènes choisis ont été par conséquent validés par PCR quantitatif confirmant leur expression accrue dans les tumeurs HT29-dérivées. La sélection différentielle des gènes est l’étape la plus importante des procédures. N’oubliez pas d’utiliser un changement de pli log2 supérieur à un avec des recomptages supérieurs à 100 comme critères.En utilisant ce protocole, les gènes sélectionnés parmi les tumeurs dérivées du colorectal peuvent être renversés ou surexprimés pour découvrir leurs rôles potentiels dans la formation de tumorsphère.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Avancée Modèle animal de colorectal métastatique du foie: Techniques d&#39;imagerie et propriétés des métastatiques Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Recherche

Recherche en cancérologie

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolation des cellules tumorales circulantes dans un modèle de souris orthotopique du cancer colorectal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Un modèle de souris génétiquement modifiée de cancer colorectal sporadique

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

À la recherche de pilote Pathways of acquis une résistance à la thérapie ciblée : génération sous-clone résistantes aux médicaments et sensibilité restauration par gène précipitation

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolement des cellules endothéliales humaines du côlon Normal et carcinome Colorectal - un protocole amélioré

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

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There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Évaluation du risque et de la prévalence du cancer colorectal par détection de l’intégrité de l’ADN des selles

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolement des cellules souches des cultures sphéroïdes tridimensionnelles

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Évaluation de la mort cellulaire à l’aide d’un surnageant sans cellules de probiotiques dans des cultures sphéroïdes tridimensionnelles de cellules cancéreuses colorectales

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-culture de cellules souches de glioblastome sur des neurones à motifs pour étudier la migration et les interactions cellulaires

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...