Name: discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres
Uploaded: 2020-07-22T13:00:00
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Os autores agradecem ao Laboratório Central de Biologia da Radiação do Instituto de Pesquisa Radiológica, Chang Gung Memorial Hospital, pelo apoio técnico. Este estudo foi apoiado por subsídios do Hospital Memorial Chang Gung (CMRPD1J0321), Do Hospital Geral cheng Hsin (CHGH 106-06) e do Mackay Memorial Hospital (MMH-CT-10605 e MMH-106-61). Os órgãos financiadores não influenciaram na concepção do estudo e coleta de dados, análise e interpretação dos dados ou na redação do manuscrito.

1. Cultura celular e formação da tumorfera
<ol><li>Cultura HT29 células em um prato de 10 cm contendo o meio de águia modificada de Dulbecco (DMEM) com 10% de soro bovino fetal (FBS) e 1% antibiótico penicilina-estreptomicina (P/S).</li>
	<li>Cresça as células em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 e 95% de umidade em condições assépticas, até atingirem 80% de confluência.</li>
	<li>Trippsinize células HT29 com 1 mL de 0,25% de trippsina por 5 min a 37 °C e, consequentemente, neutralizar a tr...

<ol>
	<li>Rawla, P., Sunkara, T., Barsouk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidemiology+of+colorectal+cancer:+incidence,+mortality,+survival,+and+risk+factors.">Epidemiology of colorectal cancer: incidence, mortality, survival, and risk factors.</a> Przegl&#261;d Gastroenterologiczny. 14 (2), 89-103 (2019).</li><li>Wong, M. C., Ding, H., Wang, J., Chan, P. S., Huang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevalence+and+risk+factors+of+colorectal+cancer+in+Asia.">Prevalence and risk factors of colorectal cancer in Asia.</a> Intestinal Research. 17 (3), 317-329 (2019).</li><li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+expression+of+basic+transcription+factor+3+predicts+poor+survival+of+colorectal+cancer+patients:+possible+mechanisms+involved.">Positive expression of basic transcription factor 3 predicts poor survival of colorectal cancer patients: possible mechanisms involved.</a> Cell Death &amp; Disease. 10 (7), 509 (2019).</li><li>Slattery, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+genes+and+miRNAs+in+the+apoptosis+pathway+in+colorectal+cancer+patients.">Dysregulated genes and miRNAs in the apoptosis pathway in colorectal cancer patients.</a> Apoptosis. 23 (3-4), 237-250 (2018).</li><li>Arteaga, C. L., Engelman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERBB+receptors:+from+oncogene+discovery+to+basic+science+to+mechanism-based+cancer+therapeutics.">ERBB receptors: from oncogene discovery to basic science to mechanism-based cancer therapeutics.</a> Cancer Cell. 25 (3), 282-303 (2014).</li><li>Yarden, Y., Pines, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERBB+network:+at+last,+cancer+therapy+meets+systems+biology.">The ERBB network: at last, cancer therapy meets systems biology.</a> Nature Reviews Cancer. 12 (8), 553-563 (2012).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YM155+as+an+inhibitor+of+cancer+stemness+simultaneously+inhibits+autophosphorylation+of+epidermal+growth+factor+receptor+and+G9a-mediated+stemness+in+lung+cancer+cells.">YM155 as an inhibitor of cancer stemness simultaneously inhibits autophosphorylation of epidermal growth factor receptor and G9a-mediated stemness in lung cancer cells.</a> PLoS One. 12 (8), 0182149 (2017).</li><li>Prasetyanti, P. R., Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intra-tumor+heterogeneity+from+a+cancer+stem+cell+perspective.">Intra-tumor heterogeneity from a cancer stem cell perspective.</a> Molecular Cancer. 16 (1), 41 (2017).</li><li>Zhao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+expression+may+be+useful+as+a+prognostic+indicator+in+colorectal+cancer,+a+tool+for+optimizing+therapy+and+supportive+evidence+for+the+cancer+stem+cell+hypothesis:+a+meta-analysis.">CD133 expression may be useful as a prognostic indicator in colorectal cancer, a tool for optimizing therapy and supportive evidence for the cancer stem cell hypothesis: a meta-analysis.</a> Oncotarget. 7 (9), 10023-10036 (2016).</li><li>Choi, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+epithelial-mesenchymal+transition+and+cancer+stem+cell+markers+in+colorectal+adenocarcinoma:+Clinicopathological+significance.">Expression of epithelial-mesenchymal transition and cancer stem cell markers in colorectal adenocarcinoma: Clinicopathological significance.</a> Oncology Reports. 38 (3), 1695-1705 (2017).</li><li>Massard, C., Deutsch, E., Soria, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cell-targeted+treatment:+elimination+or+differentiation.">Tumour stem cell-targeted treatment: elimination or differentiation.</a> Annals of Oncology. 17 (11), 1620-1624 (2006).</li><li>Grillet, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+tumour+cells+from+patients+with+colorectal+cancer+have+cancer+stem+cell+hallmarks+in+ex+vivo+culture.">Circulating tumour cells from patients with colorectal cancer have cancer stem cell hallmarks in ex vivo culture.</a> Gut. 66 (10), 1802-1810 (2017).</li><li>Dallas, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoresistant+colorectal+cancer+cells,+the+cancer+stem+cell+phenotype,+and+increased+sensitivity+to+insulin-like+growth+factor-I+receptor+inhibition.">Chemoresistant colorectal cancer cells, the cancer stem cell phenotype, and increased sensitivity to insulin-like growth factor-I receptor inhibition.</a> Cancer Research. 69 (5), 1951-1957 (2009).</li><li>Chang, Y. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+induces+G9a+to+exacerbate+HER3+expression+for+the+survival+of+epidermal+growth+factor+receptor-tyrosine+kinase+inhibitors+in+lung+cancers.">STAT3 induces G9a to exacerbate HER3 expression for the survival of epidermal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitors in lung cancers.</a> BMC Cancer. 19 (1), 959 (2019).</li><li>Catalano, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer+stem+cells+and+cell+death.">Colorectal cancer stem cells and cell death.</a> Cancers (Basel). 3 (2), 1929-1946 (2011).</li><li>Piggott, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+apoptosis+inhibitor+c-FLIP+selectively+eliminates+breast+cancer+stem+cell+activity+in+response+to+the+anti-cancer+agent,+TRAIL.">Suppression of apoptosis inhibitor c-FLIP selectively eliminates breast cancer stem cell activity in response to the anti-cancer agent, TRAIL.</a> Breast Cancer Research. 13 (5), 88 (2011).</li><li>Chung, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+novel+SHP-1+agonists,+SC-43+and+SC-78,+are+more+potent+than+regorafenib+in+suppressing+the+in+vitro+stemness+of+human+colorectal+cancer+cells.">Two novel SHP-1 agonists, SC-43 and SC-78, are more potent than regorafenib in suppressing the in vitro stemness of human colorectal cancer cells.</a> Cell Death Discovery. 4, 25 (2018).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STAT3+exacerbates+survival+of+cancer+stem-like+tumorspheres+in+EGFR-positive+colorectal+cancers:+RNAseq+analysis+and+therapeutic+screening.">STAT3 exacerbates survival of cancer stem-like tumorspheres in EGFR-positive colorectal cancers: RNAseq analysis and therapeutic screening.</a> Journal of Biomedical Science. 25 (1), 60 (2018).</li><li>Kleist, B., Xu, L., Li, G., Kersten, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+adult+intestinal+stem+cell+marker+Lgr5+in+the+metastatic+cascade+of+colorectal+cancer.">Expression of the adult intestinal stem cell marker Lgr5 in the metastatic cascade of colorectal cancer.</a> International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 4 (4), 327-335 (2011).</li><li>Medema, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+the+Colorectal+Cancer+Stem+Cell.">Targeting the Colorectal Cancer Stem Cell.</a> New England Journal of Medicine. 377 (9), 888-890 (2017).</li><li>Sahlberg, S. H., Spiegelberg, D., Glimelius, B., Stenerlow, B., Nestor, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+cancer+stem+cell+markers+CD133,+CD44,+CD24:+association+with+AKT+isoforms+and+radiation+resistance+in+colon+cancer+cells.">Evaluation of cancer stem cell markers CD133, CD44, CD24: association with AKT isoforms and radiation resistance in colon cancer cells.</a> PLoS One. 9 (4), 94621 (2014).</li><li>Xia, J., Gill, E. E., Hancock, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetworkAnalyst+for+statistical,+visual+and+network-based+meta-analysis+of+gene+expression+data.">NetworkAnalyst for statistical, visual and network-based meta-analysis of gene expression data.</a> Nature Protocols. 10 (6), 823-844 (2015).</li><li>Gagan, J., Van Allen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+sequencing+to+guide+cancer+therapy.">Next-generation sequencing to guide cancer therapy.</a> Genome Medicine. 7 (1), 80 (2015).</li><li>Panichnantakul, P., Bourgey, M., Montpetit, A., Bourque, G., Riazalhosseini, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-Seq+as+a+Tool+to+Study+the+Tumor+Microenvironment.">RNA-Seq as a Tool to Study the Tumor Microenvironment.</a> Methods in Molecular Biology. 1458, 311-337 (2016).</li><li>Kanehisa, M., Sato, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KEGG+Mapper+for+inferring+cellular+functions+from+protein+sequences.">KEGG Mapper for inferring cellular functions from protein sequences.</a> Protein Science. 29 (1), 28-35 (2020).</li><li>Ashburner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+ontology:+tool+for+the+unification+of+biology.+The+Gene+Ontology+Consortium.">Gene ontology: tool for the unification of biology. The Gene Ontology Consortium.</a> Nature Genetics. 25 (1), (2000).</li><li>The Gene Ontology Collective. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Gene+Ontology+Resource:+20+years+and+still+GOing+strong.">The Gene Ontology Resource: 20 years and still GOing strong.</a> Nucleic Acids Research. 47, 330-338 (2019).</li><li>Mi, H., Muruganujan, A., Thomas, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PANTHER+in+2013:+modeling+the+evolution+of+gene+function,+and+other+gene+attributes,+in+the+context+of+phylogenetic+trees.">PANTHER in 2013: modeling the evolution of gene function, and other gene attributes, in the context of phylogenetic trees.</a> Nucleic Acids Research. 41, 377-386 (2013).</li><li>Yu, F., Shen, X. Y., Fan, L., Yu, Z. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+analysis+of+genetic+variations+assisted+by+Ingenuity+Pathway+Analysis+to+comprehensively+investigate+potential+genetic+targets+associated+with+the+progression+of+hepatocellular+carcinoma.">Genome-wide analysis of genetic variations assisted by Ingenuity Pathway Analysis to comprehensively investigate potential genetic targets associated with the progression of hepatocellular carcinoma.</a> European Review for Medical and Pharmacological Sciences. 18 (15), 2102-2108 (2014).</li><li>Zhou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NetworkAnalyst+3.0:+a+visual+analytics+platform+for+comprehensive+gene+expression+profiling+and+meta-analysis.">NetworkAnalyst 3.0: a visual analytics platform for comprehensive gene expression profiling and meta-analysis.</a> Nucleic Acids Research. 47 (1), 234-241 (2019).</li><li>Cheng, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+induces+STAT1+expression+to+exacerbate+the+IFNr-mediated+PD-L1+axis+in+epidermal+growth+factor+receptor-positive+cancers.">Epidermal growth factor induces STAT1 expression to exacerbate the IFNr-mediated PD-L1 axis in epidermal growth factor receptor-positive cancers.</a> Molecular Carcinogenesis. 57 (11), 1588-1598 (2018).</li><li>Gallego Romero, I., Pai, A. A., Tung, J., Gilad, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-seq:+impact+of+RNA+degradation+on+transcript+quantification.">RNA-seq: impact of RNA degradation on transcript quantification.</a> BMC Biology. 12, 42 (2014).</li></ol>

Neste estudo, tumores semelhantes a câncer cultivados foram utilizados como modelo na análise dos dados rnAseq com bioinformática disponível. Para um modelo de doença, foram utilizadas tumores derivados de HT29. Como os tumores têm resistência a medicamentos contra terapias tumorais, o modelo estabelecido pode ser usado para investigar os mecanismos detalhados de resistência, investigando diferenças na expressão genética. Além disso, a tecnologia genômica usando rnAseq com bioinformática disponível fornece...

O câncer colorretal (C CRC) é uma das principais causas de morte com alta prevalência e mortalidade em todo o mundo1,2. Devido a mutações genéticas e amplificações, as células cancerígenas crescem sem controle proliferativo, o que contribui para a sobrevivência celular3, anti-apoptose4e câncer5,,6,7. Dentro de um tecido tumoral, a heterogeneidade tumoral permite que as células tumorais se adaptem e sobrevivam durante os tratamentos terapêuticos8. As células-tronco cancerígenas (CSCs), com maior taxa de autoconexão e pluripotência do que os tipos diferenciais de câncer, são as principais responsáveis pela recidiva do tumor9,,10 e CRC metastática11. Os CSCs apresentam mais resistência a medicamentos12,,13,14 e propriedades anti-apoptose15,16, sobrevivendo assim às quimioterapias tumorais.
Aqui, a fim de investigar o mecanismo potencial de stemness nas células-tronco CRC selecionadas, rnAseq foi realizado para tela de genes expressos diferencialmente em esferoides tumorais. As células cancerígenas podem formar esferoides (também chamados de tumores) quando cultivadas em condições de baixa adesão e estimuladas por fatores de crescimento adicionados ao meio cultivado, incluindo EGF, bFGF, HGF e IL6. Por isso, selecionamos células tumorais CRC HT29 que resistem às quimioterapias com aumento do STAT3 fosforilado quando tratadas com oxaliplatina e irinotecon17. Além disso, o HT29 expressou marcadores de maior caule quando cultivado nas condições de cultura descritas. O modelo CSC derivado do HT29 expressou maiores quantidades de receptor g-proteína-acoplado à proteína G 5 (LGR5)18, um marcador específico das células-tronco CRC19,,20. Além disso, o CD133, considerado um biomarcador geral para células-tronco cancerosas, também é altamente expresso na linha21 celular HT29. O objetivo deste protocolo é descobrir grupos de genes condutores nos tumores semelhantes a câncer estabelecidos com base em conjuntos de dados bioinformáticas em vez de investigar oncogenes individuais22. Investiga potenciais mecanismos moleculares através da análise RNAseq seguida de análises bioinformática disponíveis.
O sequenciamento da próxima geração é um método de sequenciamento de DNA de alta produtividade, facilmente disponível e confiável baseado na ajuda computacional, usado para rastrear abrangentemente genes do driver para orientar as terapias tumorais23. A tecnologia também é usada para detectar expressão genética a partir da transcrição reversa de uma amostra isolada de RNA24. No entanto, ao fazer a triagem com RNAseq, os genes mais importantes para atingir a terapia podem não ter o maior diferencial de expressão entre amostras experimentais e de controle. Assim, algumas bioinformáticas foram desenvolvidas para classificar e identificar genes com base em conjuntos de dados atuais como KEGG25, GO26,27ou PANTHER28, incluindo Ingenuity Pathway Analysis (IPA)29 e NetworkAnalyst30. Este protocolo mostra a integração do RNAseq e do NetworkAnalyst para descobrir rapidamente um grupo de genes nos esferoides derivados de HT29 selecionados em comparação com as células HT29 parentais. A aplicação desse método a outros modelos de doenças também é sugerida para descobrir diferenças em genes importantes.
Em comparação com a investigação da expressão genética individual, uma técnica de alto rendimento fornece vantagens para encontrar genes potenciais driver facilmente para a medicina de precisão tumoral. Com conjuntos de dados úteis como KEGG, GO ou PANTHER, genes específicos podem ser identificados com base nos modelos de doença, caminhos de sinalização ou funções específicas, e isso permite focar rapidamente em genes específicos e importantes, economizando tempo e custos de pesquisa. Uma aplicação semelhante é usada em estudos anteriores14,,18,31. Particularmente, um tumor é mais complicado porque diferentes tipos de tumores expressam genes e caminhos distintos para sobrevivência e proliferação. Portanto, este protocolo pode captar genes que distinguem diferentes tipos de tumores em diferentes circunstâncias. Há o potencial de encontrar estratégias eficazes contra os cânceres, entendendo o mecanismo de expressão genética específica.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>iRiS Digital Cell Imaging System</td>
			<td>Logos Biosystems, Inc</td>
			<td>I10999</td>
			<td>for observing the formation of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry</td>
			<td>BD biosciences</td>
			<td>FACSCalibur</td>
			<td>for detecting the LGR5 and CD133 in the tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-LGR5-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>373803</td>
			<td>LGR5 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>anti-CD133-PE</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>372803</td>
			<td>CD133 detection reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z00333</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>bFGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03116</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HGF</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03229</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL6</td>
			<td>GenScript</td>
			<td>Z03034</td>
			<td>for culture of tumorspheres</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PureLink RNA extraction kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12183025</td>
			<td>isolate total RNA for RNAseq analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAseq performance</td>
			<td>Biotools, Taiwan</td>
			<td></td>
			<td>RNAseq analysis is done commerially by Biotools, Ttaiwan</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NetworkAnalyst</td>
			<td>Institute of Parasitology, McGill University, Montreal, Quebec, Canada</td>
			<td></td>
			<td>http://www.networkanalyst.ca/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Prism</td>
			<td>GraphPad Software</td>
			<td></td>
			<td>a statistical analysis software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

discovery of driver genes in colorectal ht29-derived cancer stem-like tumorspheres

As células-tronco cancerígenas desempenham um papel vital contra as terapias clínicas, contribuindo para a recaída do tumor. Há muitos oncogenes envolvidos na tumorigênese e no início das propriedades de câncer. Como a expressão genética na formação de tumores derivados do câncer colorretal não é clara, leva tempo para descobrir os mecanismos que trabalham em um gene de cada vez. Este estudo demonstra um método para descobrir rapidamente os genes condutores envolvidos na sobrevivência das células-tronco do câncer colorretal in vitro. Foram selecionadas e utilizadas neste estudo as células cancerígenas Colorretal HT29 que expressam o LGR5 quando cultivadas como esferoides e acompanham um aumento dos marcadores de caule CD133. O protocolo apresentado é usado para realizar o RNAseq com bioinformática disponível para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos na formação de tumores derivados de haste HT29 colorretais. A metodologia pode rapidamente rastrear e descobrir potenciais genes driver em outros modelos de doenças.

Para estabelecer o modelo de investigação do mecanismo em células-tronco cancerosas, as células colorretais HT29 foram usadas para cultivar tumores semelhantes a troncos de câncer in vitro em uma placa de baixa fixação contendo B27, EGF, bFGF, HGF e IL6. Os tumores >100 μm de diâmetro foram formados em 7 dias(Figura 1A). Os tumores foram tentados em células únicas e analisados usando citometria de fluxo para detectar a expressão LGR5 e CD133. O LGR5 aumentou nos tumores HT29-driv...

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Discovery of Driver Genes in Colorectal HT29-derived Cancer Stem-Like Tumorspheres

Apresentado aqui é um protocolo para descobrir os genes condutores superexpressos mantendo as células-tronco de câncer estabelecidas derivadas de células HT29 colorretais. RNAseq com bioinformática disponível foi realizado para investigar e tela redes de expressão genética para elucidar um mecanismo potencial envolvido na sobrevivência de células tumorais direcionadas.

Descoberta de genes driver em tumores de câncer derivados de HT29 derivados do câncer colorretal

Cancer stem cells play a vital role against clinical therapies, contributing to tumor relapse. There are many oncogenes involved in tumorigenesis and the ...

Nosso protocolo utilizou RNA-Seq e ferramentas bioinformaticas para descobrir rapidamente os genes de driver superexpressos que contribuem para a formação de tumores colorretais semelhantes a troncos. Este protocolo é usado para rastrear um gene expresso diferencialmente e caminhos de sinal para investigar um mecanismo molecular para a stemness do câncer em um câncer colorretal seletivo. No sétimo dia de cultura, use um microscópio invertido com um sistema de imagem celular digital para observar e medir o diâmetro dos tumores.Quando os tumores atingirem um diâmetro maior que 100 micrômetros, trate a cultura com 0,25% de trippsina. Após cinco minutos a 37 graus Celsius, neutralize o trippsin com duas vezes o volume do meio de crescimento e conte as células usando um hemócito. Recolher as células por centrifugação.E resuspenja a pelota em cinco vezes 10 para as quatro células por 100 microliters de concentração média. Adicione dois microliters do anticorpo primário de interesse a cada tubo e incuba as células por 30 minutos à temperatura ambiente e 200 revoluções por minuto. Ao final da incubação, lave cada tubo com 900 microlitadores de PBS e analise as células para expressão da proteína de interesse por citometria de fluxo de acordo com os protocolos padrão.Para o isolamento do RNA após a coleta de trippsina como apenas demonstrado, resuspenque as células em duas vezes 10 a 5 células por 50 microliters de concentração de PBS elise cada amostra com 200 microliters de tampão de lise suplementados com dois microliters de beta mercaptoetanol por tubo. Após um breve vórtice e uma incubação de cinco minutos à temperatura ambiente, colete os lises por centrifugação e adicione 200 microliters de 70% de etanol a cada tubo. Transfira as amostras para colunas rápidas e remova o solvente por centrifugação.Lave as amostras com 400 microlitadores de solução de lavagem uma e 600 microliters de solução de lavagem dois para remover completamente qualquer não-RNA por centrifugação, seguido por uma centrífuga adicional de dois minutos sob as mesmas condições centrífugas para remover qualquer etanol residual. Em seguida, resuspengue as pelotas em 50 microliters de água destilada por tubo e centrifugar a amostra por um minuto antes de coletar o RNA contendo supernantes. Para investigar a expressão genética diferencial entre as células tumorais em comparação com as células tumorais parentais após a análise de sequenciamento de RNA.Selecione genes com uma alteração maior que um a menos um log2 fold com contagem de leitura superior a 100 na tumorfera e grupos parentais. E use os comandos como indicado. Para obter um gráfico vulcâneo dos dados para determinar a expressão genética diferencial.Para a seleção de genes de unidade no analista de rede, selecione entrada de genes únicos e copie e cole os genes superexpressos selecionados com o humano especificado como o organismo e o símbolo genético oficial como o tipo de ID. Clique em Carregar e proceda. Para inserir e analisar os dados usando interação proteína-proteína, seguindo a interação genética proteína-proteína, use o banco de dados string interactome com um escore de confiança cortado de 900 para mostrar os genes das sementes.Cruzando os genes carregados. Os genes de sementes que se associam a mais genes individuais podem ser selecionados como genes condutores que podem estar envolvidos na manutenção da formação da tumorfera. Selecione Prosseguir na visão geral do mapeamento em branco no Atlas de Fundo e Força no botão Layout.Em seguida, selecione o par base PANTHER para analisar o grupo genético de regulação. Tumores de maiores de 100 micrômetros de diâmetro se formam dentro de sete dias de cultura. A análise citométrica do fluxo revela um aumento na expressão LGR5 e CD133 em tumores derivados de HT29 em comparação com as células HT29 parentais.Após o sequenciamento do RNA, os genes com uma variação maior que uma dobra de log2 em sua regulação para cima ou para baixo com um valor P inferior a 0,05, conforme determinado pelo mapa de calor, podem ser plotados para distinguir os genes significativos entre tumores derivados de HT29 e células HT29 parentais. Neste experimento representativo, a análise dos genes regulados com uma dobra maior que uma dobra de log2 resultou em 10 genes de sementes, cruzando as redes genéticas. A análise do par de bases PANTHER indicou que dois genes estavam associados à regulação negativa da apoptose.Além disso, os genes selecionados foram, consequentemente, validados pelo PCR quantitativo confirmando sua expressão aumentada em tumores derivados de HT29. A seleção diferencial de genes é o passo mais importante dos procedimentos. Lembre-se de usar uma alteração de 20 vezes maior que uma com recontagens superiores a 100 como critério.Usando este protocolo, os genes selecionados a partir das tumores derivados da colorretal podem ser derrubados ou superexpressos para descobrir seus potenciais papéis na formação da tumorfera.

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Advanced Animal Model of Colorectal Metastasis in Liver: Imaging Techniques and Properties of Metastatic Clones

Modelo Animal avançado de Colorectal metástase no fígado: técnicas de imagem e Propriedades de metastáticos Clones

Patients with a limited number of hepatic metastases and slow rates of progression can be successfully treated with local treatment approaches1,2. ...

Pesquisa do câncer

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Isolamento de células tumorais circulantes em um modelo de rato ortotópico de câncer colorretal

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

A Genetically Engineered Mouse Model of Sporadic Colorectal Cancer

Um modelo de mouse de engenharia genética de câncer colorretal esporádico

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, colorectal cancer mouse models based on tumor cell injection have severe limitations ...

Looking for Driver Pathways of Acquired Resistance to Targeted Therapy: Drug Resistant Subclone Generation and Sensitivity Restoring by Gene Knock-down

À procura de caminhos de Driver do adquiriu resistência à terapia-alvo: geração de Subclone resistentes aos medicamentos e sensibilidade restaurando pelo Gene Knock-down

The past two decades have seen a shift from cytotoxic drugs to targeted therapy in medical oncology. Although targeted therapeutic agents have shown more ...

Isolation of Human Endothelial Cells from Normal Colon and Colorectal Carcinoma - An Improved Protocol

Isolamento de células endoteliais humanas do cólon Normal e Carcinoma colorrectal - um protocolo melhorado

Primary cells isolated from human carcinomas are valuable tools to identify pathogenic mechanisms contributing to disease development and progression. In ...

Detection of a Circulating MicroRNA Custom Panel in Patients with Metastatic Colorectal Cancer

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

There is increasing interest in liquid biopsy for cancer diagnosis, prognosis and therapeutic monitoring, creating the need for reliable and useful ...

Evaluation of Colorectal Cancer Risk and Prevalence by Stool DNA Integrity Detection

Avaliação do Risco e Prevalência de Câncer Colorretal por Detecção de Integridade do DNA das fezes

Nowadays, stool DNA can be isolated and analyzed by several methods. The long fragments of DNA in stool can be detected by a qPCR assay, which provides a ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Isolamento de células-tronco a partir de culturas esferóides tridimensionais

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

Evaluating Cell Death Using Cell-Free Supernatant of Probiotics in Three-Dimensional Spheroid Cultures of Colorectal Cancer Cells

Avaliação da morte celular usando supernanato livre de células de probióticos em culturas esferoides tridimensionais de células cancerígenas colorretais

This manuscript describes a protocol to evaluate cancer cell deaths in three dimensional (3D) spheroids of multicellular types of cancer cells using ...

Co-culture of Glioblastoma Stem-like Cells on Patterned Neurons to Study Migration and Cellular Interactions

Co-cultura de células-tronco semelhantes ao Glioblastoma em neurônios padronizados para estudar migração e interações celulares

Glioblastomas (GBMs), grade IV malignant gliomas, are one of the deadliest types of human cancer because of their aggressive characteristics. Despite ...